人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法
【专利摘要】本发明涉及一种人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，主要包括培养液配制、培养瓶处理、扁桃体组织取材、扁桃体组织分组消化比较、扁桃体上皮细胞的分离、形态学观察、免疫荧光鉴定等步骤。本发明对口腔上皮细胞的分离技术进行改进，探讨出了一种成功率较高、步骤简单、纯化率高的，几乎不会出现污染的扁桃体上皮细胞的体外分离及培养技术，其应用于人扁桃体上皮细胞的体外培养和纯化过程，对后续EB及其它病毒在扁桃体中的作用机制研究具有重要意义。
【专利说明】
人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及人扁桃体上皮细胞的体外培养方法。
【背景技术】
[0002]扁桃体既是周围淋巴器官，又属于粘膜相关淋巴组织，具有复杂而特殊的隐窝管道系统，位于消化道和呼吸道共同入口处，是产生免疫应答的重要场所，其中隐窝上皮是该器官中最先接触抗原，潴留抗原，并产生免疫应答的位置，因此隐窝上皮是扁桃体行使免疫功能的重要组织屏障。然而在外界抗原的反复刺激下，常常引起慢性扁桃体炎和腺样体肥大的发生，其主要原因就是细菌和病毒的感染，越来越多的研究发现与EB病毒的感染，关系最为密切。但具体感染机制尚不明确，因此体外分离人扁桃体隐窝上皮细胞，能够更好的进一步探讨EB病毒的感染机制。
[0003]关于扁桃体上皮细胞的原代分离，国内尚没有相关文献报道，国外报道的扁桃体细胞分离方法主要集中在两种分离方法上，最早的一种方法是源于1990年华盛顿大学口腔生物系和药学系的研究，是关于口腔上皮细胞的无血清培养技术，属于酶消化法，成为后续扁桃体体外培养的很好的借鉴依据，但是各实验室的研究方法技术上存在一些差异而且不容易成功复制[I]。另一种方法是2004年波士顿的塔夫茨大学医学院的研究，利用新鲜扁桃体的外植体，进行体外细胞迀移，并进行培养，但是此种方法，过程较为繁琐，分离周期较长，受个体差异影响较大，且容易污染[2]。
[0004]1.Dolphine Odaj E.ff., Human oral epithelial cell culture 1.1mprovedcondit1ns for reproducible culture in serum-free medium.1N VITRO CELLDEV-ANj 1990.26(6):p.589-595.
[0005]2.Pegtelj D.M.，J.Middeldorpj and D.A.Thorley-Lawsonj Epstein-Barr virusinfect1n in ex vivo tonsil epithelial cell cultures of asymptomatic carriers.J Virol, 2004.78 (22):p.12613—24..
【发明内容】
[0006]本发明的目的是对口腔上皮细胞的分离技术进行改进，探讨出了一种成功率较高、步骤简单、纯化率高的，几乎不会出现污染的扁桃体上皮细胞的体外分离及培养技术，对后续EB及其它病毒在扁桃体中的作用机制研究具有重要意义。。
[0007]为达到上述目的，本发明提供的技术方案是:人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其步骤如下:
[0008]一、实验准备:
[0009](I)培养液配制:采用K-SFM培养基，加入表皮生长因子、牛垂体提取物、CaCl2、青霉素-链霉素混合液和两性霉素，混匀，过滤，保存；
[0010](2)培养瓶处理；向培养瓶中加入Type I/III胶原，以没过培养瓶底部为宜，在生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射，保存备用；
[0011]二、分离培养
[0012](I)扁桃体组织取材:在生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的冰浴培养皿中，去除周边结缔组织，用灭菌后的PBS清洗数次，剪成组织块，并将其转移至dispasegrade II 溶液中；
[0013](2)扁桃体组织分组消化:孵育过夜；
[0014](3)扁桃体上皮细胞的分离:将消化好的组织块，于次日经细胞筛过滤，细胞悬液离心、弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬、消化；然后加入含有血清的K-SFM培养基，中止消化，再离心、弃上清，最后用K-SFM培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，静置培养；
[0015](4)形态学观察:将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较；
[0016](5)免疫荧光鉴定:免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% -90%，弃去培养液，加入固定液固定，弃去固定液后用Triton X-100通透化处理，然后用BSA封闭；加入一抗，过夜；加入焚光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育，然后用DAPI染色，在荧光显微镜下观察。
[0017]实验准备中，所述的培养液配制为:每200毫升K-SFM培养基，加入20-30微升表皮生长因子(EGF)和4000-5000微升牛垂体提取物(BPE)、150-250微升60mM的CaCl2、2微升青霉素-链霉素混合液和200微升25mg/ml的两性霉素，混匀，然后经0.22微米滤膜过滤后，放置4°C保存。
[0018]实验准备中，所述的培养瓶处理为:向6孔板或者1cm培养皿中加入Type I/III胶原(Advanced B1Matrix，#5005_B)，以没过6孔板或者1cm培养皿底部为宜，生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射1-2小时，即可将6孔板或者1cm培养皿收起于4°C
保存备用。
[0019]其中，所述的扁桃体组织分组消化为:在37°C孵育30min-lh，期间摇晃数次，然后放入4°C孵育过夜，称为梯度消化法。
[0020]另一种方案为:所述的扁桃体组织分组消化为:在4°C直接孵育过夜，称为4°C消化过夜法。
[0021]其中，所述的扁桃体组织取材为:生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，利用外科剪仔细去除周边结缔组织，用灭过菌的PBS清洗数次，剪成3mmX3mm大小的组织块，并将其转移至浓度为l_3mg/ml的dispase grade II溶液中。
[0022]其中，所述的扁桃体上皮细胞的分离为:消化好的组织块，于次日经220目的细胞筛过滤，细胞悬液lOOOrmp，离心5_10分钟；弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬，于37°C消化5分钟；然后加入含有10-15%血清的K-SFM培养基，中止消化，再100rmp离心5分钟，弃上清，最后用角蛋白无血清培养基(K-SFM培养基)重悬，将原代细胞种入培养皿中，37°C,5% C02条件下静置培养，2-3天换液一次。
[0023]其中，所述的胰酶消化液含0.05 % -0.25 %的胰酶和0.53mM的EDTA ;所述的角蛋白无血清培养基含有5-10ng/ml EGF, 20-30 μ g/ml ΒΡΕ,Ο.06mM CaC12，I %青霉素-链霉素，25 μ g/ml两性霉素。
[0024]其中，所述的免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% _90%，弃去培养液，用PBS洗两遍；加入4%多聚甲醛固定液，固定20min-30min，然后弃去固定液，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，用0.2%的Triton X-100通透化处理lh，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，5% BSA封闭30min_lh，PBS洗三遍，3min/次;加入1:200-1:300稀释的一抗，4°C过夜，PBS洗三遍，3min/次;加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育lh，PBS洗三遍，3min/次；DAPI染色3-5min，PBS洗三遍，3min/次；荧光显微镜下观察。
[0025]本发明探讨人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其应用于人扁桃体上皮细胞的体外培养和纯化过程，为研究呼吸道病毒在临床中的作用机制奠定基础。
【附图说明】
[0026]图1:梯度消化法分离扁桃体上皮细胞，显示d0天细胞状态(10 X)。
[0027]图2:4°C消化过夜分离扁桃体上皮细胞，显示d0天细胞状态(1X)。
[0028]图3:梯度消化法分离细胞形态学观察结果(1X)，分别显示培养第5、8、14天的结果。
[0029]图4:4°C消化过夜法分离细胞形态学观察结果(10X)，分别显示培养第5、8、14天的结果。
[0030]图5:免疫荧光鉴定为扁桃体上皮细胞(1X)，图中蓝色荧光显示细胞核，绿色荧光显示CK13。
[0031]图6:免疫荧光鉴定为隐窝上皮细胞(1X)，图中蓝色荧光显示细胞核，绿色荧光显示CK8。
[0032]图7:人扁桃体上皮细胞分离培养与鉴定的步骤流程图。
【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0034]实施例1
[0035]一、实验准备:
[0036](I)培养液配制:细胞培养液:每200毫升K-SFM培养基，加入20_30微升表皮生长因子(EGF)和4000-5000微升牛垂体提取物(BPE)、150-250微升CaC12 (60mM)、2微升青霉素-链霉素混合液和200微升两性霉素(25mg/ml)，混匀，然后经0.22微米滤膜过滤后，放置4°C保存；
[0037](2)培养瓶处理:将6孔板或者1cm培养皿加入Type I/III胶原(AdvancedB1Matrix，#5005_B)，以没过6孔板或者1cm培养皿底部为宜，生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射1-2小时，即可将6孔板或者1cm培养皿收起于4°C保存备用；
[0038]二、分离培养
[0039](I)扁桃体组织取材:生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，利用外科剪仔细去除周边结缔组织，用灭过菌的PBS清洗数次，剪成3mmX 3mm左右组织块儿，并将其转移至浓度为l_3mg/ml的dispase grade II溶液中；
[0040](2)扁桃体组织分组消化:37°C孵育30min-lh，期间手动摇晃数次，然后放入4°C孵育过夜；
[0041](3)扁桃体上皮细胞的分离:消化好的组织块，于次日经220目的细胞筛过滤，细胞悬液lOOOrmp，离心5_10分钟；弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液(含0.05% -0.25%的胰酶和0.53mM的EDTA)重悬，于37°C消化5分钟；然后加入含有10-15%血清的K-SFM培养基，中止消化，再100rmp离心5分钟，弃上清，最后用K-SFM培养基(角蛋白无血清培养基，其中含有 5-10ng/ml EGF, 20-30 μ g/ml ΒΡΕ, 0.06mM CaCl2,1 %青霉素-链霉素，25 μ g/ml两性霉素)重悬，将原代细胞种入培养皿中，37°C，5% C02条件下静置培养，2_3天换液一次。
[0042](4)形态学观察:将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜(OlympusCKX 41型)下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。
[0043](5)免疫荧光鉴定:免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% -90%，弃去培养液，用PBS洗两遍；加入4%多聚甲醛固定液，固定20min-30min，然后弃去固定液，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，用0.2%的Triton X-100通透化处理lh，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，5 % BSA封闭30min-lh，PBS洗三遍，3min/次；加入一抗(1:200-1:300稀释)，4°C过夜，PBS洗三遍，3min/次；加入荧光标记的二抗(后续步骤均需避光操作)，室温孵育lh，PBS洗三遍，3min/次；DAPI染色3-5min，PBS洗三遍，3min/次；荧光显微镜下观察。
[0044]实施例2
[0045]一、实验准备:
[0046](I)培养液配制:细胞培养液:每200毫升K-SFM培养基，加入20_30微升表皮生长因子(EGF)和4000-5000微升牛垂体提取物(BPE)、150-250微升CaC12 (60mM)、2微升青霉素-链霉素混合液和200微升两性霉素(25mg/ml)，混匀，然后经0.22微米滤膜过滤后，放置4°C保存；
[0047](2)培养瓶处理:将6孔板或者1cm培养皿加入Type I/III胶原(AdvancedB1Matrix，#5005_B)，以没过6孔板或者1cm培养皿底部为宜，生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射1-2小时，即可将6孔板或者1cm培养皿收起于4°C保存备用；
[0048]二、分离培养
[0049](I)扁桃体组织取材:生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，利用外科剪仔细去除周边结缔组织，用灭过菌的PBS清洗数次，剪成3mmX 3mm左右组织块儿，并将其转移至浓度为l_3mg/ml的dispase grade II溶液中；
[0050](2)扁桃体组织分组消化:在4°C直接孵育过夜；
[0051](3)扁桃体上皮细胞的分离:消化好的组织块，于次日经220目的细胞筛过滤，细胞悬液lOOOrmp，离心5_10分钟；弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液(含0.05% -0.25%的胰酶和0.53mM的EDTA)重悬，于37°C消化5分钟；然后加入含有10-15%血清的K-SFM培养基，中止消化，再100rmp离心5分钟，弃上清，最后用K-SFM培养基(角蛋白无血清培养基，其中含有 5-10ng/ml EGF, 20-30 μ g/ml ΒΡΕ,Ο.06mM CaCl2,1 %青霉素-链霉素，25 μ g/ml两性霉素)重悬，将原代细胞种入培养皿中，37°C，5% C02条件下静置培养，2_3天换液一次。
[0052](4)形态学观察:将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜(OlympusCKX 41型)下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。
[0053](5)免疫荧光鉴定:免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% -90%，弃去培养液，用PBS洗两遍；加入4%多聚甲醛固定液，固定20min-30min，然后弃去固定液，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，用0.2%的Triton X-100通透化处理lh，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，5 % BSA封闭30min-lh，PBS洗三遍，3min/次；加入一抗(1:200-1:300稀释)，4°C过夜，PBS洗三遍，3min/次；加入荧光标记的二抗(后续步骤均需避光操作)，室温孵育lh，PBS洗三遍，3min/次；DAPI染色3-5min，PBS洗三遍，3min/次；荧光显微镜下观察。
[0054]实施例1、实施例2试验结果对比分析:
[0055]实施例1中，消化方法是采用梯度消化的方法。本研究所利用的分散酶活性在37°C下酶活性最高，因此采用37°C消化30min-lh然后4°C消化过夜的梯度消化方法，在减少细胞膜损伤的同时，又能增加细胞的得率，如图1所示。
[0056]实施例2中，消化方法是采用4°C消化过夜法。4°C过夜消化可使细胞一直处于低强度的分散酶活性下，而不会降低细胞活力，但此种方法对组织块的分散力度较弱，致使所分离的细胞呈团块分布，且不利于扁桃体上皮细胞从淋巴细胞中游离出来。如图2所示。
[0057]将实施例1、实施例2的不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜(Olympus CKX 41型)下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较。结果显示人扁桃体上皮原代培养细胞成典型的铺路石状上皮细胞的形态，贴壁生长，实施例1、实施例2两种方法分离第一天的细胞均以淋巴细胞数目居多，待细胞贴壁后，经过PBS清洗和换液，5天时上皮细胞数目均明显增加，淋巴细胞均明显减少，可见数十个至数万个细胞组成的扁桃体上皮细胞球，细胞形态规则，边界清楚，折光性强。
[0058]随着时间的推移，培养14天后形成单层细胞层，细胞形状也趋于典型。两种消化方法的比较发现，梯度消化法分离的细胞与40C消化过夜法分离的细胞相比，融合的速度明显较快，且细胞活力较高(图3、4)。两种方法分离的细胞经传代克隆后仍可出现与原代培养相同的大量次代克隆，单细胞克隆显示单个细胞在培养3天时细胞克隆增多至数十个，此后随密度增加生长加快，细胞形态不变，传代后7天细胞数目即可达到百万个细胞。
[0059]将两种方法的原代及传代的细胞进行角蛋白13(CK13)免疫荧光鉴定，结果显示大部分细胞呈CK13抗原阳性，其中梯度消化法检测的阳性率高于4°C过夜消化法(如图5、6所示)。传代细胞中阳性率更高，结果证实分离的原代细胞为扁桃体上皮细胞，进一步经过角蛋白8(CK8)的免疫荧光鉴定显示90%以上的细胞均有阳性表达，说明在所分离的扁桃体上皮细胞中大部分为隐窝上皮细胞即为扁桃体上皮细胞的一种，也是EB等病毒的主要作用靶细胞，这将为后续研究病毒感染的机制奠定良好的基础，。
[0060]以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，依据本发明的技术实质，对以上实施例所作的任何简单的修改、等同替换与改进等，均仍属于本发明技术方案的保护范围之内。
【主权项】
1.人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:步骤如下: 一、实验准备: (1)培养液配制:采用K-SFM培养基，加入表皮生长因子、牛垂体提取物、CaCl2、青霉素-链霉素混合液和两性霉素，混匀，过滤，保存； (2)培养瓶处理；向培养瓶中加入TypeI/III胶原，以没过培养瓶底部为宜，在生物安全柜中避光通风过夜，次日在紫外灯下照射，保存备用； 二、分尚培养 (1)扁桃体组织取材:在生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的冰浴培养皿中，去除周边结缔组织，清洗，剪成组织块，并将其转移至dispase grade II溶液中； (2)扁桃体组织分组消化:孵育过夜； (3)扁桃体上皮细胞的分离:将消化好的组织块于次日经细胞筛过滤，细胞悬液离心、弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬、消化；然后加入含有血清的K-SFM培养基，中止消化，再离心、弃上清，最后用K-SFM培养基重悬，将原代细胞种入培养皿中，静置培养； (4)形态学观察:将不同培养时间的扁桃体上皮细胞于倒置相差显微镜下进行形态观察，观察其形态及结构的变化，并进行比较； (5)免疫荧光鉴定:包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% -90%，弃去培养液，加入固定液固定，弃去固定液后用TritonX-1OO通透化处理，然后用BSA封闭；加入一抗，过夜；加入荧光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育，然后用DAPI染色，在荧光显微镜下观察。2.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的扁桃体组织分组消化为:在37°C孵育30min-lh，期间摇晃数次，然后放入4°C孵育过夜。3.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的扁桃体组织分组消化为:在4°C直接孵育过夜。4.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:实验准备中，所述的培养液配制为:每200晕升K - SFM培养基，加入20 - 30微升表皮生长因子(EGF)和4000 - 5000微升牛垂体提取物(BPE)、150 - 250微升60mM的CaCl2、2微升青霉素-链霉素混合液和200微升25mg/ml的两性霉素，混匀，然后经0.22微米滤膜过滤后，放置4°C保存。5.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:实验准备中，所述的培养瓶处理为:向6孔板或者1cm培养皿中加入Type I/III胶原(Advanced B1Matrix，#5005 -B)，以没过6孔板或者1cm培养皿底部为宜，生物安全柜中避光通风过夜，次日紫外灯下照射1- 2小时，即可将6孔板或者1cm培养皿收起于4°C保存备用。6.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的扁桃体组织取材为:生物安全柜下将扁桃体组织置于盛有PBS平衡盐溶液的4°C冰浴的培养皿中，利用外科剪仔细去除周边结缔组织，用灭过菌的PBS清洗数次，剪成3mm X 3mm大小的组织块，并将其转移至浓度为1- 3mg/ml的dispase grade II溶液中。7.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的扁桃体上皮细胞的分离为:消化好的组织块，于次日经220目的细胞筛过滤，细胞悬液100rmp,离心5_10分钟；弃上清，细胞沉淀用胰酶消化液重悬，于37°C消化5分钟；然后加入含有10-15%血清的K-SFM培养基，中止消化，再100rmp离心5分钟，弃上清，最后用角蛋白无血清培养基(K-SFM培养基)重悬，将原代细胞种入培养皿中，37°C，5% C02条件下静置培养，2-3天换液一次。8.如权利要求7所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的胰酶消化液含0.05% - 0.25%的胰酶和0.53mM的EDTA ;所述的角蛋白无血清培养基含有 5-10ng/ml EGF，20 - 30 μ g/ml ΒΡΕ, 0.06mM CaC12，I %青霉素-链霉素，25 μ g/ml 两性霉素。9.如权利要求1所述的人扁桃体上皮细胞的分离培养与鉴定方法，其特征在于:所述的免疫荧光鉴定包括细胞角蛋白13(CK13)和细胞角蛋白8(CK8)的鉴定:待培培养皿中的细胞密度达到70% -90%，弃去培养液，用PBS洗两遍；加入4%多聚甲醛固定液，固定20min-30min，然后弃去固定液，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，用0.2%的TritonX-100通透化处理lh，PBS洗三遍，3min/次；室温条件下，5% BSA封闭30min_lh，PBS洗三遍，3min/次；加入1:200-1:300稀释的一抗，4°C过夜，PBS洗三遍，3min/次；加入焚光标记的二抗，后续步骤均需避光操作，室温孵育lh，PBS洗三遍，3min/次；DAPI染色3_5min，PBS洗三遍，3min/次；荧光显微镜下观察。
【文档编号】C12N5/071GK105936888SQ201510583200
【公开日】2016年9月14日
【申请日】2015年9月14日
【发明人】金玉, 李树珍, 李琦, 孙真真, 郑必霞, 黄群, 杨光
【申请人】南京医科大学附属南京儿童医院