专利名称：一种苹果黑星病菌的快速分离与培养方法
技术领域：
本发明涉及病菌分离与培养领域，具体涉及一种分离 培养苹果黑星病菌的方法，包括病菌单孢分离和在培养基中培养。
背景技术：
苹果黑星病是世界各苹果产区的重要病害之一，苹果 黑星病菌(/加e《wa/" (Cke. ) Wint,)可侵染苹果叶片、 叶柄、花、萼片、花梗和果实，也可侵染幼嫩枝条和芽鳞等，受害果 实开裂畸形，严重时造成落叶、落果，直接影响苹果的产量、质量及 其商品价值。苹果黑星病在我国主要发生在陕西、辽宁、新疆、黑龙 江4省，在吉林、河南、甘肃、宁夏、山东、山西、四川、云南等省
局部地区有分布。近年来，苹果黑星病在我国部分地区有逐年加重的 趋势，严重地威胁着苹果产业的发展。在我国苹果优生区-渭北單塬 苹果产区，苹果黑星病分别于1997、 1998、 1999、 2004和2005年大
流行，造成了严重的经济损失，主要原因是缺乏对苹果黑星病在我国 的流行规律和病原菌的遗传变异规律等的研究，没有有效的有针对性 的防治措施，这些问题的研究都离不开对苹果黑星病病原菌的分离与 培养，而苹果黑星病菌因其在培养基上生长速度慢，容易被污染，是 国内长期以来难以分离和培养的病原微生物之一。
发明内容
本发明提供了一种分离培养苹果黑星病菌的方法，包 括病菌的单孢分离和在培养基中培养。 其中所采用的单孢分离方法是将苹果黑星病新鲜病斑与表面干 燥洁净的载玻片摩擦，在显微镜的目镜为15倍，物镜为IO倍的条件下，用头发丝粘取单个苹果黑星病菌分生孢子,转移至培养基中培养。
所用培养基的制备方法为取苹果叶片40g和去皮马铃薯40g， 分别在500 mL蒸镏水中煮沸30 min，过滤后混合，加入15 g琼脂 粉，用蒸馏水定容至IOOO mL， 12rC灭菌20 min，待培养基冷却至 55'C时，加入硫酸链霉素使其终浓度达到100 mg/L，即得本发明所 述培养基。
另外，本发明还提供了适合病菌菌丝生长和产孢的培养条件，即 在温度为15-20'C， pH值为5.0-6.5,光照强度为600 lx，光周期为 12 h条件下培养，上述条件有利用病菌菌丝生长和产孢。
本发明所述分离培养方法不仅能够快速有效地进行苹果黑星病 菌的分离培养，同时也可用于其它可产生孢子的植物病原真菌的快速 有效分离和培养。
具体实施例
实施例1:比较试验
2004年我们从陕西旬邑太村乡8年生苹果园(品种为嘎啦，授 粉树品种为秦冠)釆取发病的苹果黑星病叶片标样，带回实验室，分 别釆用组织块分离法、稀释分离法和单孢分离法共分离了 234皿(表 1 )。组织块分离法表面消毒条件为70%酒精5 sec， 0. 1%升汞3min， 无菌水冲洗3次，共分离了 147皿，有5皿获得成功，成功率仅为 3.4%。釆用稀释分离法共分离了 20皿，有2皿获得了成功，而且极 易被其他杂菌所污染，成功率为10.0%。采用本发明所述的单孢分 离法共做了67皿，有49皿获得了纯分离物，成功率为73. 1%，远远高于组织块分离法和稀释分离法，是一种适合于苹果黑星病菌的快速 高效分离方法。
表l苹果黑星病菌分离方法比较
分离方法 分离数量(皿)分离成功数(皿)
成功率(w
组织块分离法
147
3. 4
稀释分离法
20
10. 0
单孢分离法
67
49
73. 1
稀释分离法，快速而且成功率高。
另外上述单孢分离方法还可以配合使用本发明所述的培养基,在 本发明所述的培养条件下进一步对分离的单孢进行培养。本发明的单 孢分离方法、培养基制备方法及培养条件是苹果黑星病菌有效的分离 培养配套方法，优于常规的植物病原真菌的分离培养方法。同时，本 发明所建立的单孢分离方法也适合于其他可产生孢子的植物病原真 菌的快速有效分离。
实施例2:培养基的制备
取苹果叶片40 g和去皮马铃薯40 g，分别在500 mL蒸僧水中 煮沸30min,过滤后混合，加入15g琼脂粉，用蒸馏水定容至1000 mL, 12rC灭菌20min，待培养基冷却至55°C时，加入硫酸链霉素使其终浓度达到100 mg/L，即得本发明所述培养基。将制得的培养基 倾倒到培养皿中备用。 实施例3:培养
将苹果黑星病新鲜病斑与表面干燥洁净的载玻片摩擦，在显微镜 的目镜为15倍，物镜为IO倍的条件下，用头发丝粘取单个苹果黑星 病菌分生孢子，转移至实施例2所制备的培养基中，在温度为15-20 X:， pH值为5.0-6.5，光照强度为600 lx，光周期为12h条件下培养。
权利要求
1、一种分离培养苹果黑星病菌的方法，包括病菌的单孢分离和在培养基中培养，其中所述病菌单孢分离的过程是将苹果黑星病新鲜病斑与表面干燥洁净的载玻片摩擦，在显微镜的目镜为15倍，物镜为10倍的条件下，用头发丝粘取单个苹果黑星病菌分生孢子，转移至培养基中培养。
2、 根据权利要求l所述的方法，其中所述培养基是通过如下方法制备的取苹果叶片40 g和去皮马铃薯40 g，分别在500 mL蒸馏水中煮沸30min，过滤后混合，加入15g琼脂粉，用蒸馏水定容至1000 mL， 121'C灭菌20min，待培养基冷却至55'C时，加入硫酸链霉素使其终浓度达到10Q mg/L，即得所述培养基。
3、根据权利要求l或2任一项所述的方法，其中所述培养是在如下的培养条件进行的，温度为15-20'C, pH值为5.0-6.5，光照强度为600lx，光周期为12 h，上述条件有利用病菌菌丝生长和产孢。
全文摘要
本发明是提供一种分离培养苹果黑星病菌的方法，包括病菌单孢分离和在培养基中培养。其中所采用的单孢分离方法是将苹果黑星病新鲜病斑与表面干燥洁净的载玻片摩擦，在显微镜的目镜为15倍，物镜为10倍的条件下，用头发丝粘取单个苹果黑星病菌分生孢子，转移至培养基中培养。另外，本发明还提供了适合苹果黑星病菌的培养基和培养条件。本发明所述分离培养方法不仅能够快速有效地进行苹果黑星病菌的分离培养，同时也可用于其它可产生孢子的植物病原真菌的快速有效分离培养。
文档编号C12N1/14GK101624571SQ20091016472
公开日2010年1月13日 申请日期2009年7月16日 优先权日2009年7月16日
发明者征 俞, 商文静, 杨家荣, 王保通, 胡小平 申请人:胡小平;杨家荣;王保通