专利名称：检测结肠弯曲菌的引物、探针及方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测结肠弯曲菌的荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行结肠弯曲菌检测的方法和试剂盒。
背景技术：
结肠弯曲菌(Campylobacter coli)是弯曲菌属中主要导致人类疾病的食源性病原菌之一，是导致人类腹泻的主要病原。结肠弯曲菌分布广泛，人类感染主要是由于结肠弯曲菌污染食品、饮用水以及环境引起的，给人类带来严重的疾病负担。国内外对结肠弯曲菌的监测都非常关注。细菌的分离培养及生化鉴定是目前常用的检测结肠弯曲菌感染的方法。由于结肠弯曲菌属于微需氧细菌，生长需要特定的气体环境，体外培养对培养基的营养条件要求较高，培养条件要求苛刻，且成本较高，常规的生化鉴定结肠弯曲菌比较繁琐，须具备较好的技术与经验，加上由于区分菌株的生化鉴定结果的一致性不好，可能会造成分离菌株的错误鉴定，造成目前对腹泻患者以及食品污染检测过程中的结肠弯曲菌检测灵敏度低，检出率不高，检出时间慢的缺点。近年来随着分子生物学的发展，国内外已先后开展了一些针对结肠弯曲菌的基因检测研究，通过对样品中病原的特异核苷酸(DNA)序列的检测可以确定特异病原的感染， 针对的靶基因主要包括16SrDNA、23SrDNA等。荧光定量PCR的方法通过检测标本中结肠弯曲菌特异的DNA序列，能大大提高了检测的灵敏度和特异度，同时根据特异DNA序列片段的拷贝数能够确定样品中结肠弯曲菌污染的量，确诊结肠弯曲菌的感染以及确定样品中的污染数量。
发明内容
本发明的目的在于提供用于检测结肠弯曲菌的特异性引物和探针；本发明的另一个目的在于提供检测结肠弯曲菌的荧光定量PCR方法及其试剂盒。为实现上述目的，本发明用BLASTn与Vector NTI Suite 6. 0软件对已知结肠弯曲菌特异基因的DNA序列进行比对，筛选出结肠弯曲菌基因的特异序列，其核苷酸序列如 SEQ ID NO. 1 所示。本发明提供用于检测结肠弯曲菌上述特异序列的引物，以及与所述引物配合使用的荧光探针。其中，探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ。该特异引物扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为上游引物CTCGCTTTGGAATCATTCATG，
下游引物CTTTATTGCCCACAATGATATTTC ；探针序列为FAM-AGGAATCAATGCTGTGGATGAAAATGTAA-BHQ1。
本发明提供一种结肠弯曲菌的实时荧光定量PCR检测方法，包括以样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25μ 1反应体系时，其优选配置
为
试剂体积(μ I^)终浓度2xplatinum qualitative PCR superMix UDG12.5IxMgCl2(50mM)2.254.5mMplatinum Taq(5U/ μ 1)0.250.5U/ μ 1PCR nucleotide MIX(含 dNTP) (IOmM)0.80.32mM上游引物0.40.32 μ M下游引物0.40.32 μ MTaqman probe(20 μ Μ)0.40.32 μ MDNA模板2去核酸水6本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性％iin，1个循环；95°C变性 IOs, 55 65°C退火30s,40个循环。本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为95°C预变性％iin，1个循环；95°C 变性10s，59°C退火30s，40个循环。本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩增时，样本结果判断标准如下Ct值< 35. 0时样品结果为阳性；Ct值彡40. 0的样品结果为阴性；Ct值在35. 0 40. 0之间时，样品需要重复，重复试验如Ct值依然低于40判定为阳性扩增，超过40判定为阴性扩增。本发明提供了一种用于结肠弯曲菌检测的试剂盒，其包括上述能特异地扩增出如 SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列或其特异性片段的引物以及配合引物使用的Taqman探针。本发明试剂盒的所用引物序列为上游引物CTCGCTTTGGAATCATTCATG，下游引物CTTTATTGCCCACAATGATATTTC。所用探针序列为，FAM-AGGAATCAATGCTGTGGATGAAAATGTAA-BHQ1。本发明提供的试剂盒，还包括DNA裂解液，荧光定量反应液，阴性模板和阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为结肠弯曲菌基因组DNA。本发明提供了用于检测结肠弯曲菌的特异性引物和探针，建立了检测结肠弯曲菌的荧光定量PCR方法，具有很高的检测灵敏度，当Ct = 35时可以检测到5. 62CFU的结肠弯曲菌；该方法还具有100%的特异性，其重复性好，批内可重复性变异系数为0. 15%
0.88%之间，批间可重复性变异系数为0.6%，可作为检测临床标本的手段，提高结肠弯曲菌检测的阳性率，操作简单，大大缩短检测周期。本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对照，该试剂盒的推广应用将有助于及时准确地判断环境中、饮用水和食品中结肠弯曲菌的污染及污染程度，为防治和监测结肠弯曲菌病提供技术支持。
图1为结肠弯曲菌荧光定量PCR灵敏度评价，其中图Ia为结肠弯曲菌模板 1 X IO5 1 X IO0CFU荧光定量PCR扩增曲线；图Ib为1 X IO5 1 X IO0CFU浓度对数与Ct 值的线性回归图；图2为结肠弯曲菌荧光定量PCR特异度评价，图中曲线为结肠弯曲菌ATCC33559 的反应曲线；图3为结肠弯曲菌荧光定量PCR重复性评价，图3a为ATCC33559三次重复检测回归曲线，R12 = 0. 982，R22 = 0. 983，R32 = 0. 985 ；图3b为C2!34三次稀释检测回归曲线，R12 =0. 999，R22 = 0. 999，R32 = 0. 998 ；图 3c 为 WHO 9. UffHO 10. 2 及 LUMINGHUI-1 三株菌检测回归曲线，R2CWHO 9. 1) = 0. 999，R2 (WHO 10. 2) = 0. 998，R2(Iuminghi-I) = 0. 991 ；图4为荧光定量PCR检测不同量结肠弯曲菌掺入粪便标本中的结果；图5为倍比稀释的粪便标本在选择性培养基上划线培养结果，其中图如为IO1CFU 开始有结肠弯曲菌生长，图5b为IO2CFU,图5c为IO3CFU,图5d为IO4CFU ；图k为IO5CFU ；图6为掺入菌量分别为10° IO5的10 μ 1菌液打点计数结果；图7为荧光定量PCR验证结肠弯曲菌标准质粒结果，其中图7a为结肠弯曲菌模板1.958Χ KT1
1.958 X IO7CFU扩增曲线；图7b为1. 958 X KT1 1. 958 X IO7CFU浓度对数与Ct值的线性回归图。
具体实施例方式以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1结肠弯曲菌特异DNA序列的确定本发明用BLASTn与Vector NTI Suite 6. 0软件对对NCBI已公布的所有结肠弯曲菌测序基因的DNA序列的保守性进行比对，筛选出结肠弯曲菌基因的特异序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。实施例2结肠弯曲菌特异性引物和探针的设计本发明设计引物与探针时，注意避开序列的突变点，经反复筛选和验证，使用 Primer Express Version 3软件得到一对用于检测结肠弯曲菌的荧光定量PCR引物和与引物配合使用的iTaqMan探针，该探针5’标记荧光基团FAM，3’标记淬灭基团BHQ。
优选引物序列为，上游引物CTCGCTTTGGAATCATTCATG，Tm:57°C，下游引物CTTTATTGCCCACAATGATATTTC，Tm:56°C，优选探针序列为，FAM-AGGAATCAATGCTGTGGATGAAAATGTAA-BHQ1，Tm 64 °C。实施例3检测结肠弯曲菌的荧光定量PCR检测方法的建立(1) real-time PCR实验参数的优化参照Invirogen 推荐荧光定量 PCR 25 μ L 体系:2XPCR UDG12. 5 μ L, mg2+4. 5mM, PCR nucleotide MIX (含dNTP) 4mM，上、下游引物终浓度为0. 4μΜ，探针终浓度为0. 2 μ Μ, DNA模板2 μ L。优化一个条件，固定其余条件。根据Ct值和荧光信号的强弱来判断优化条件，把最佳的条件组合起来作为最终的优化体系。退火温度从55°C 65°C之间进行优化；引物按终浓度从0. 08 μ M 0. 62 μ M之间进行优化；探针的浓度从0. 08 μ M 0. 36 μ M之间进行优化；mg2+浓度在1. 5 5mM之间进行优化；dNIPs浓度在2 5. SmM之间进行优化。最终确定的结肠弯曲菌荧光定量PCR反应体系见表1 表1结肠弯曲菌荧光定量PCR反应体系
权利要求
1.一种用于检测结肠弯曲菌的特异性引物，其扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示。
2.如权利要求1所述的引物，其核苷酸序列为 上游引物CTCGCTTTGGAATCATTCATG，下游引物CTTTATTGCCCACAATGATATTTC。
3.与权利要求1或2所述引物配合使用的荧光探针。
4.如权利要求3所述的荧光探针，其核苷酸序列为 FAM-AGGAATCAATGCTGTGGATGAAAATGTAA-BHQ1。
5.一种结肠弯曲菌的检测方法，其特征在于，以样品总DNA为模板，利用权利要求1或 2所述的引物和权利要求3或4所述探针进行实时荧光定量PCR，根据扩增曲线判定结果。
6.如权利要求5所述的结肠弯曲菌的检测方法，其特征在于，实时荧光定量PCR的反应体系为
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，所述实时荧光定量PCR的反应程序为 95°C预变性％iin，1个循环；95°C变性10s，59°C退火30s，40个循环。
8.含有权利要求1或2所述引物和/或权利要求3或4所述探针的试剂盒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其还包括DNA裂解液、荧光定量反应液、定量校准品、阴性模板和/或阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为结肠弯曲菌基因组 DNA。
全文摘要
本发明提供了用于检测结肠弯曲菌的实时荧光定量PCR引物和探针，其序列分别如SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示。本发明还提供了使用上述引物和探针进行荧光定量PCR检测结肠弯曲菌的方法及其检测试剂盒。本发明的检测方法及其检测试剂盒具有检测准确，灵敏度高、特异性强，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
文档编号G01N21/64GK102268479SQ20111019700
公开日2011年12月7日 申请日期2011年7月13日 优先权日2011年7月13日
发明者乔博, 何利华, 张建中, 张茂俊, 顾一心 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所