专利名称：一种自然水环境中的溶藻菌分离方法
技术领域：
本发明属于自然水环境的生物控藻技术，具体涉及一种自然水环境中的溶藻菌分 离方法。
背景技术：
20世纪60年代，国外科学家发现有多种微生物着生在水华藻类上并能分解 藻类，揭开了微生物与水华之间的关系，并开始了有关病毒(Curtis A. Suttle, Α. Μ. C, Matthew Τ.Cottrel1. Infection of phytoplankton by viruses and reduction of primary productivity [J]. Nature ,1990,347: 467-469.)、真菌(Ellen Van Donk, J. R. The effect of fungal parasitism on the succession of diatoms in Lake Maarsseveen I (The Netherlands) [J]. Freshwater Biology, 1983, 13(3) : 241-251.)以及细菌溶藻 的研究。后来越来越多的研究发现溶藻细菌对水华的控制有非常重要的作用。然而，溶藻细 菌控藻研究首先就是要从自然水体中分离高效溶藻细菌。针对目前溶藻细菌的分离方法， 通常分为两种思路一种是利用液体感染的方法进行分离；另一种是利用固体感染的方法 进行分离。具体分离方法为
(1)利用液体感染筛选分离方法
利用液体感染方法筛选溶藻细菌，一般先确定水样中是否含有溶藻细菌，再进行分 离蹄选。(Imai I, Kim Mu-Chan, et al. Relationships between dynamics of red tide-causing raphidophycean flagellates and algicidal micro-organisms in the coastal sea of Japan [J]. Phycological Research, 1998，46 (2) : 139-146.)展了一种 利用液体培养基分离海洋溶藻细菌的方法。程序如下采集水样，经0. 8 m滤膜过滤，去除 比细菌大的颗粒，然后用藻类培养基对水样进行10倍递增梯度稀释，取ImL各个稀释度的 水样分别加入4mL预培养藻类培养物中，设置5个平行进行培养。培养一段时间后，取黄化 的培养物涂布平板分离细菌，然后从优势菌株筛选溶藻细菌。(2)固体感染筛选方法(即软琼脂顶层平板法(SAOTL))
在固体培养基上分离溶藻细菌主要利用空斑形成(Plaque formation)的方法进行。 1964年Safferman(Safferman R. S, Camion R. Ε, Desjardins P. R, et al. Classification and nomenclature of viruses of cyanobaeteria[J]. Intevrirology, 1983, 19:61-66.) 首先采用SAOTL法分离和检测蓝藻病毒，1970年Shilo (Shilo M. Lysis of Blue-Green Algae by Myxobacter. Journal of bacteriology, 1970, 104(1) : 453-461.)将其用于分离 溶藻细菌，后经过许多研究者的不断发展和完善，目前以成为一种分离溶藻微生物，尤其是 淡水生态系统中溶藻细菌的常用方法(Kurhmaro A , Loya Y, et al.Bacterial infection and coral bleaching [J]. Nature, 1996，380:396.)其基本操作如下制备两种藻类固体 培养基一琼脂培养基和软琼脂培养基(soft-agar medium)，以琼脂培养基作底层平板， 水样、预培养的藻和融化并冷却到47°C的软琼脂培养基混合均勻迅速倾注到底层平板，琼 脂固化后进行培养，至扩散的溶藻斑出现后，通过单斑纯化获得溶藻菌株(席宇，一株欧文氏菌的分离及其溶藻特性的研究.2003，华中师范大学.硕士毕业论文)。由于水样的预处理、微生物间相互依赖关系以及分离使用的培养基缺乏微生物 所需的特殊的营养需求等，种种这些原因都会使大部分的细菌被遗漏，无论在液体还是 在固体培养基中，有些细菌是不能被分离培养的。Suzuki (Suzuki M Τ, M S Rappe, Z W Haimberger. Bacterial diversity among small—subunit rRNA gene clones and cellular isolates from the same seawater sample[J]. App1. Environ. Microbiol., 1997，63 (3) : 983-989.)的研究发现在海洋环境中，通过培养获得细菌的16SrRNA序列 远远少于直接从环境中获得的序列。这给分离高效溶藻微生物带来了困难，这些矛盾的解 决都需要技术和方法上的突破。
发明内容
本发明的目的在于提供一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，可直观、快速、便捷 地分离具有高效抑藻效果的溶藻细菌。本发明的技术方案如下一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤
1)在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；
2)制备藻类细胞内含液，将其与BGll培育基混合后制成半固体培养基，铺在BGll固 体培养基上，获得SM培养基；
3)清洗步骤1)形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中 培养；
4)取步骤3)中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；
5)挑取步骤4)形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验，从而纯化空斑；
6)取纯化后的空斑在步骤2)制备的SM培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻 效果，得到溶藻菌。上述步骤1)中所述惰性载体是惰性挂膜材料，可选用惰性玻璃片、FPUFS载体(含 有羟基、环氧基和酰胺基等反应性基团，孔径0. 3 0. 7mm)等。惰性挂膜材料通常垂挂在 富营养化水体水面下广1. 5m处，15-30天后即可得到富集多种微生物的生物膜。通过在不同地域如云南滇池、北京的富营养化湖泊、富营养化景观水体中放置多 个惰性挂膜材料，定期采收形成生物膜的材料开展后续的溶藻试验初步筛选，再从有明显 控藻效果生物膜中分离溶藻微生物。上述步骤2)中所述藻类根据待治理区域的水华特点进行选择。针对我国水华特 点主要为微囊藻、水华鱼腥藻(Jfla如ma卯ae)，可建立以这两种藻类细胞内含液与 BGll培养基混合制作的SM培养基，直接用于溶藻菌的分离，能快速完成针对微囊藻、水华 鱼腥藻等水华藻的溶藻菌的筛选。可以通过将藻类细胞反复冻溶后离心，取上清过滤除菌 得到无菌的藻类细胞内含液。上述步骤3 )通常是将生物膜材料用灭菌高纯水清洗后，将清洗得到的混合液通过 滤纸过滤，以消除原生动物的影响以及去除水中的杂质；然后将滤液加入预培养的藻类培 养液中，光照静置培养，出现溶藻现象的培养液用于下一步骤。上述步骤4)的溶藻空斑实验所用的培养基为BGll固体培养基，将步骤3)出现溶 藻现象的培养液用BGll培养液稀释后与浓缩的藻液混勻，涂布在BGll固体培养基上，光照培养，观察是否有空斑出现。上述步骤5)取溶藻空斑重悬于BGll培养液中后重复进行溶藻空斑实验，进行空 斑纯化。上述步骤6)取一个最后形成的典型空斑，转移到SM培养基上黑暗培养。形成菌 落后挑取部分菌落加入藻类培养液中培养以检测其溶藻效果，将出现溶藻现象的菌落再次 转移到新的SM培养基上划线分离，直至获得具有溶藻作用的单菌落。本发明采用自然水环境挂膜的方法，通过在富营养化水体中放置惰性载体，在短 时间内形成物种丰富的微生物群落，并直接采用自主建立的固体SM培养基进行高效溶藻 细菌的分离筛选。本发明创新性提出惰性材料富集微生物、模拟富营养化藻类细胞效果初 筛、SM培养基划线分离菌株的过程，可直观、快速、便捷地分离具有高效抑藻效果的溶藻细 菌。
图1为本发明具体实施例的处理流程图2为本发明实施例中测得的溶藻菌DCl的叶绿素a去除效果图。
具体实施例方式下面通过实例对本发明做进一步说明。需要注意的是，公布实施例的目的在于帮 助进一步理解本发明，但是本领域的技术人员可以理解在不脱离本发明及所附权利要求 的精神和范围内，各种替换和修改都是可能的。因此，本发明不应局限于实施例所公开的内 容，本发明要求保护的范围以权利要求书界定的范围为准。一、溶藻菌的分离 具体步骤如下
1)溶藻材料的获取
以滇池富营养化水体中溶藻菌的分离为例，在滇池采样点水面下1. 5m处，悬挂多个惰 性挂膜材料FPUFS载体。20d后取出，在惰性挂膜材料上形成生物膜。2) SM培养基的制备
收集培养至对数期的水华鱼腥藻(OD68tl ^ 1)，于常温以300(T4500r/min离心8 15 min，去上清后用新鲜的BGll液体培养基来悬浮藻细胞沉淀，分装1. 5 ml的Eppendorf 管中，每管广2ml，用液氮反复冻融8 12次，于4°C以1000(Tl2000Xg离心10 15 min，取上 清用0.22mm孔径的滤膜过滤除菌，滤液保存于_20°C。取10(T200 ml冻融鱼腥藻滤液，用 无菌的BGll液体培养基稀释到0.5 1 ml。用微波炉化开的低熔点琼脂糖的BGll半固 体培养基，将它保温在47飞5°C水浴锅中足够长时间使其温度降到47飞5°C，取广2 ml保 温的无菌BGll半固体培养基加到无菌小试管中，于47飞5°C温浴，再取0.5 1 ml稀释的 冻融鱼腥藻滤液加到小试管中，混勻后立即均勻铺在BGll固体培养基上，在超净台上吹干 后置于4°C保存。SM培养基含有具有生物活性成分的鱼腥藻提取物。3)细菌培养
将步骤1)获得的生物膜样品进行如下预处理用灭菌高纯水清洗，将混合液通过滤纸 过滤，以消除原生动物的影响以及去除水中的杂质；然后进行细菌培养实验组将过滤所得的l(T20mL水样经无菌操作注入到10(Tl50mL预培养5_7天的各
种藻中。对照组在10(Tl50mL预培养5_7天的各种藻种中注入20mL经滤纸过滤后高压灭 菌的水样。将上述两组试样分别混合均勻，在光照下静置培养。每天观察是否发生溶藻现象， 连续观察5到7天。将对照正常，实验组出现溶藻现象的藻液用于下一步实验。由于分离到 的溶藻细菌对鱼腥藻的溶藻效果最好，我们选择水华鱼腥藻作为主要的受试蓝藻藻种。取 水华鱼腥藻中出现溶藻现象的黄化藻液用于下一步实验。4)菌种分离溶藻空斑实验
收集培养至对数期的水华鱼腥藻(0D_ 1 )，于常温下300(T4500r/min离心 l(Tl5min，然后再用新鲜的BGll培养基来悬浮藻细胞沉淀，最终浓度控制在3(Γ40倍原浓 度。将出现溶藻现象的黄化藻液用无菌BGll培养液稀释100和1000倍。取稀释液0. 2^0. 3 ml与广1. 5 ml浓缩水华鱼腥藻液混合，在小试管中混勻后均勻涂布在BGll固体培养基上， 并且设置一个滴加对应量无菌水和浓缩水华鱼腥藻液的空白对照。将这些藻板在植物室内 继续光照培养，几天后观察平板上是否有空斑出现。5)空斑纯化
待藻板上出现空斑后，用无菌接种环切取典型的空斑(每板取2-3个)，重悬于2 3ml 的无菌BGll液体培养基中，用步骤4)所述的铺藻板的方法对空斑纯化三次。以上操作均 在超净室中进行。6)划线分离
从最后一次形成空斑的藻板上切取一个典型的空斑，转移到SM培养基上，于25 35°C 黑暗培养。所有操作均需无菌操作。使用无菌接种环挑取菌落周围部分到新的SM培养基 上划线分离。同时在50 ml小锥形瓶中加入20 30ml水华鱼腥藻液，用无菌接种环挑取单 菌落的一部分放入藻液，混合后将它们在光照下继续培养，观察并记录这些液体在5 7天 内是否黄化。若检测到抑藻效果，对该单菌落再次转移到新的SM培养基上进行划线生长， 反复纯化多次。分离出五株溶藻菌，对这五株溶藻菌进行进一步的抑藻效果检测。二、细菌抑藻效果
无菌操作条件下，将溶藻菌接种在高温灭菌的基本培养基中，35°C、170rpm条件下摇床 培养2d。取2mL、5mL、10mL、20mL菌悬液，依次加入到初始叶绿素a (Chl-a)浓度为0. 612 mg·!/1的水华鱼腥藻液中，用BGll培养基定容至40 mL。设平行组和对照组，实验条件下 培养1周(藻种接种于150mL锥形瓶中，用封口膜封口保存，放置在光合植物培养室内培养， 光合培养周期(光照和黑暗的时间比)为1处1011、温度25士1° C、光照20001UX)，测定初 始藻液和6d后黄化藻液的Chl-a浓度。基本培养基每IOOOml 蒸馏水含 Ig 磷酸二氢铵(NH4H2PO4)，0. 2g MgSO4 · 7H20, 5g 葡萄糖，5g NaCl，lg K2HPO4 · 3H20。BGll培养基和其中的微量元素A5的成分分别如表1和表2所示
表1 BGll培养基各营养物质成分
权利要求
一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，包括如下步骤1)在富营养化水体中放置惰性载体，在惰性载体上形成富集多种微生物的生物膜；2)制备藻类细胞内含液，将其与BG11培养基混合后制成半固体培养基，铺在BG11 固体培养基上，获得SM培养基；3)清洗步骤1)形成的生物膜材料，去除原生动物和水中杂质，然后加入藻类培养液中培养；4)取步骤3)中发生溶藻现象的培养液进一步在固体培养基上进行溶藻空斑实验；5)挑取步骤4)形成的溶藻空斑再进行多次溶藻空斑实验以纯化空斑；6)取纯化后的空斑在步骤2)制备的SM培养基上划线培养，获得单菌落并检测其溶藻效果，得到溶藻菌。
2.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1)中所述 惰性载体为惰性玻璃片或FPUFS载体。
3.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤1)将所述 惰性载体垂挂在富营养化水体水面下广1. 5m处15-30天。
4.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤2)中所述 藻类为微囊藻和/或水华鱼腥藻。
5.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤2)中所述 藻类细胞内含液是通过将藻类细胞反复冻溶后离心，再取上清过滤除菌得到。
6.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤3)用灭菌 水清洗生物膜材料，将清洗得到的混合液用滤纸过滤，然后将滤液加入预培养的藻类培养 液中，光照静置培养。
7.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤4)溶藻空 斑实验所用的培养基为BGll固体培养基，将步骤3)出现溶藻现象的培养液用BGll培养液 稀释后与浓缩的藻液混勻，涂布在BGll固体培养基上，光照培养，观察是否有空斑出现。
8.如权利要求7所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤5)取溶藻 空斑重悬于BGll培养液中后重复进行溶藻空斑实验以纯化空斑。
9.如权利要求1所述的自然水环境中的溶藻菌分离方法，其特征在于，步骤6)划线培 养在黑暗中进行，然后挑取菌落加入藻类培养液中培养以检测其溶藻效果，将出现溶藻现 象的菌落再次转移到新的SM培养基上划线分离，直至获得具有溶藻作用的单菌落。
全文摘要
本发明提供了一种自然水环境中的溶藻菌分离方法，属于自然水环境的生物控藻技术。本发明采用自然水环境挂膜的方法，通过在富营养化水体中放置惰性载体，在短时间内形成物种丰富的微生物群落，然后采用添加了藻类细胞内含物的固体SM培养基进行高效溶藻细菌的筛选分离。本发明能够快速、便捷、有效地分离高效的溶藻菌。
文档编号C12N1/20GK101955904SQ20101051815
公开日2011年1月26日 申请日期2010年10月25日 优先权日2010年10月25日
发明者吴为中, 吴伟龙, 李超 申请人:北京大学