专利名称：溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)的表达和作为疫苗组份的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶藻弧菌(rawo a/g/wo/;^c"s)表达的一种外膜蛋白(outer membrane protein, OM protein) Pal (VA1061)的免疫调节功能。
背景技术：
溶藻弧菌广泛分布于世界各地海水及河口处，并且数量居海水类弧菌之首， 对于溶藻弧菌致病微生物，研究的重点就是免疫学分析，阐明其致病机理并找出 有效的防治方法，防治的办法主要包括药物即抗生素防治以及免疫防治，其中抗 生素虽然在最初的使用中取得了巨大的进展，然而随着抗生素的广泛使用，也出 现了一系列的相关问题，一方面抗生素的不合理使用，增加抗生素耐药菌的产生， 细菌感染增多；另一方面，因抗生素的耐药性而人为地加大剂量，加剧耐药性的 产生。因此，研制以具有免疫保护作用的高效中和抗原为成分的疫苗具有广阔的 应用前景。
在各种动物疾病的防治中，疫苗的使用是一个具有低成本、高效的方法，并 且已经有部分疫苗得到大规模使用并取得了不错的防治效果。疫苗种类很多，以 细菌为例，包括全菌疫苗、亚单位疫苗以及DNA疫苗等。从实际应用的情况来 看，全菌疫苗虽然具有制作相对简单而且成本也较低的优点，但它也存在不少由 于使用全菌体而固有的一些缺点。如减毒全菌疫苗可能出现菌株突变而导致的毒 性恢复等不良后果；灭活全菌疫苗则往往由于对细菌的灭活过程而导致一些免疫 保护基团活性的改变，而影响免疫保护的效果。而且对全菌疫苗来说，由于细菌 成分的复杂性，其中往往存在一些毒性成分(如LPS等)，会导致机体产生不良 反应。并且常规制得的全菌疫苗免疫保护效果不理想。然而，全菌疫苗仍然是目 前最为主要的疫苗种类。其原因可能与高效中和抗原的发现和鉴定困难有关。
随着基因组学、蛋白质组学和转录分布图技术的发展，这就为细菌疫苗提供 了新的契机。基因工程疫苗由于具有高效，且摆脱了传统疫苗的种种缺点，成为 疫苗研究的重点，具有广阔的应用与开发前景。外膜蛋白是革兰氏阴性菌外膜的 主要成分之一，由于外膜蛋白直接面对宿主的体液及组织，细菌利用外膜蛋白进
行黏附、侵入和炎症等生理活动，更容易被宿主识别作为攻击目标，使得革兰氏 阴性菌的外膜蛋白具有良好的免疫原性，不仅可以剌激体液免疫，而且对细胞免 疫亦有刺激作用。近年来，细菌的一些外膜蛋白已经被证实具有良好的免疫原性, 用其制备基因工程疫苗具有良好的前景。如在大肠杆菌中发现外膜蛋白OmpX 的免疫保护功能。但在本发明被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请 中提及的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的免疫调节功能。
本专利率先采用分子克隆和免疫学等现代生物学技术，以溶藻弧菌为研究对 象，对外膜蛋白基因Pa皿(VA1061)进行克隆、表达和纯化，并在此基础上深入 研究其免疫保护性。免疫和攻毒实验结果表明溶藻弧菌的外膜蛋白Pal(VA1061) 显示出对溶藻弧菌较高的免疫保护作用。其相对免疫保护率(RPS)为93.7%， 此外还显示出对荧光假单胞菌的交叉免疫原性，其免疫保护率(RPS)达到63.2 %。这些结果说明Pal可作为疫苗组分。
发明内容
外膜蛋白具有良好的免疫原性，对细胞免疫和体液免疫均有刺激作用。本发 明涉及通过对表达的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)免疫保护性以及免疫交叉 性的分析，发现免疫鲫鱼后可以显著提高对重要致病菌溶藻弧菌以及荧光假单胞 菌的抵制力。初步评价其作为候选疫苗的可行性，对水产疾病的防治具有重要意 义。
图l.Pal (VA1061)基因PCR产物0.8X琼脂糖凝胶电泳分析
图2. pET-28a-Pal重组子的双酶切鉴定
图3.克隆子BL21-pET-28a-Pal在￡.co/z-BL21中的诱导表达
图4. SDS-PAGE回收包涵体中的重组蛋白.lane 1:包涵体超声破碎上清； lane 2: SDS-PAGE切胶纯化蛋白
具体实施例方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(2001 by Cold Spring Harbor Laboratory Press)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)基因的克隆和鉴定
1. 溶藻弧菌Pal (VA1061)基因的扩增
由于溶藻弧菌基因的全序列还未测定，目前也无该菌的Pal (VA1061)基因 序列报道。鉴于副溶血弧菌已完成全序列测定，并于2006年3月在数据库 GenBank (BA000031)公布，我们按其数据库上己公布的Pal (VA1061)序列 设计了Pal (VA1061)基因引物，用于溶藻弧菌PaI (VA1061)的PCR扩增。 所设计的引物是上游引物5'-ATAfiQ^CQATGAAAAAACTAGCAGCGGT-3'; 下游引物5'-CGCAAGCTTTTATTGCTGAACTTGGTA陽3':横线所示为酶切位 点，上游引物引入^aw/Z/酶切位点，下游引物引入五a^/酶切位点。使用细菌 基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)，按照试剂盒内的使用说明书提取溶 藻弧菌的全基因组DNA作为模板，采用的引物进行PCR扩增，图1所示PCR 扩增结果。从图可见，基因扩增产物为单一特异条带，Pal(VA1061)基因约525bp， 与预计的片段大小相当。
2、 溶藻弧菌Pal (VA1061)基因的克隆、筛选和鉴定 将基因PCR产物使用0.8。/。琼脂糖/溴化乙锭凝胶进行电泳，通过新配置的琼
脂糖凝胶电泳纯化，按购自TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒(DNA Gel Extraction Kit)的说明书进行回收。用干净的、锋利的刀片，在短波长紫外灯下， 切下目的PCR扩增片段，尽可能地切除多余的胶，置于干净、已称重的离心管中， 称重并记录切下目的胶的重量；然后按照说明书的步骤，依次加入各种溶液、离 心、过柱、洗脱等，最后得到基因PCR回收产物，置于-20。C保存。取少量进行 回收效果电泳检测。
待基因PCR扩增产物回收后，分别采用相应的限制性内切酶B"w^/和 历w^Z7(Takara公司)进行双酶切，同时对载体pET-28a (Novagen公司)进行 双酶切(37。C酶切过夜)，酶切后使用乙醇沉淀回收。方法如下向酶切体系加 入1/10体积的NaAc (3M， pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，经-2(TC静置60min 后，12000rpm离心15min，弃上清，加500 Nl 70%的乙醇洗涤，12000rpm离心 5min，弃上清，重复洗涤一次，洗涤完后小心地倒尽液体，用滤纸吸尽乙醇，置 超净台中自然风干，风干后直接溶于适量的去离子无菌水。
将两者回收后加入连接酶(Takara公司)，调节水温16'C，之后连接过夜。 将连接产物与约100^1 Z)/^5a感受态细胞混合，冰浴30min后42'C热激90s,并 立即冰浴5min，加新鲜LB培养基补足体积至lml，置于37。C摇床150rpm缓慢 培养45min，取培养液10000rpm离心30s，弃85(^1上清，余下菌液重悬均匀， 涂布含卡那霉素(100、g/ml) LB平板，待转化液被平板完全吸收后，于37'C倒 置培养12 16小时。
从转化平板中随机挑取6个单菌落，接种到5ml按1:500比例添加卡那霉素
(50mg/ml)的LB液体培养基中，37'C培养8h,采用碱裂解法小量提取质粒。方 法如下将菌液转入1.5mL微量离心管中，4'Cl0000g离心l min，吸出培养液， 加IOO (iL冰预冷的溶液I (50 mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-Cl pH 8.0， 10 mmol/LEDTA)剧烈振荡至细菌沉淀完全重悬。室温下静止2 min，力卩200^现配 的溶液II (0.2mmol/LNaOH， 1%SDS)，盖紧管口，快速上下轻微颠倒几次混匀， 冰浴5 min，力口150^L冰预冷的溶液m (60mL 5mol/L乙酸钾，11.5mL冰乙酸， 2S.5mL H20)，反复颠倒几次使粘稠的细菌裂解物分散均匀，冰浴5min。 4'C下 12000g离心7min，转移350pL上清到另一离心管，用等量体积的酚/氯仿抽提2次， 加2倍体积的冰冷无水乙醇，上下颠倒混匀。室温静置2min， 4'C12000g离心5 min。小心去上清，75%乙醇洗涤2次，弃上清，再将附于管壁上的液滴除尽，用 30^L含RNA酶的TE (pH8.0)溶解质粒DNA，稍加振荡，贮存于-2(TC。用相应 的限制性内切酶进行双酶切进一步鉴定。如图2所示，重组质粒？￡1-28&-Pal可酶 切出与PCR产物大小相当片段大小一致的片段，表明基因已成功地插入到 pET-28a载体中。运用Beckman CEQ末端标记循环测序将已经克隆的重组质粒Pal
(VA1061)进行序列测定。 实施例2
溶藻弧菌Pal (VA1061)蛋白的表达 1预测氨基酸序列
基因Pal (VA1061)为中等长度片段，并运用DNAssist软件分析，获得其 完整的开放阅读框ORF 2重组子的原核表达
挑取重组质粒的单菌落接种于lml按1:500比例添加卡那霉素(50mg/ml)的
LB液体培养基中37'C过夜培养至饱和，按l:100接种量接种饱和培养物到5mL的 LB培养基中，于37'C培养约2h至OD6。o约等于0.6左右。在培养物中加入IPTG至 终浓度为lmmol/L， 37'C继续培养3h。取出经过诱导的培养物室温高速离心lmin， 收集菌体。同时设立对照组，沉淀重悬于100pL2xSDS凝胶加样buffer中，IO(TC 加热5min。 12000rpm，离心10min。取适量上请样品上样于12°/。 SDS聚丙烯酰胺 凝胶，电泳至溴酚兰迁移到分离胶底部。考马斯亮蓝染色，扫描输出照片。结果 表明Pal (VA1061)基因重组子已转入五.co//万￡"并获得阳性表达如图3。其重 组蛋白大小约为19kD。因此重组蛋白的分子量在表达图谱上与预期相符。 实施例3
1.溶藻弧菌PaI (VA1061)蛋白的纯化
挑取重组质粒转化大肠杆菌5L2/(DE3)，涂布于含有100pg/mL卡那霉素的 LB培养基中，37'C培养过夜。随即挑取单菌落，加入5mLLB液于37'C振荡过 夜，按1:100的比例转接至含抗生素的液体LB培养基200mL， 37'C振荡培养约 2.5-3h， 00600=0.6时，于瓶中加入IPTG (终浓度为1 mmol/L)进行诱导，30°C 200 rpm/min摇3h。 6000g， 4"C离心10min收集菌体，用生理盐水洗涤菌体2次， 称菌体湿重。
用缓冲液(50mmol/LTrisHCL、 lmmol/LEDTA、 pH8.0)洗涤3次，超声破 碎菌体后，先6000 rpm/min离心5min，弃沉淀物；12000 rpm/min离心10min， 回收沉淀。然后将包涵体用buffer D(8M尿素；0.1MNaH2PO4 ; lOmmTris-HC1， pH 8.0)悬浮，超声破碎，输出功率60%， 5s/次，间隔9s，超声10min。超声破 碎后的溶液，9000g， 4。C离心15min，收集上清。
包涵体超声破碎后的上清经SDS-PAGE分离，分离胶12%，浓縮胶4%。电 泳条件为浓縮胶，80V;分离胶，120V。电泳结束后用考马斯亮蓝染色液(0.1% 考马斯亮蓝R-250， 50%乙醇，10%冰乙酸)染色，用脱色液脱色至背景干净后 切下目的蛋白条带，放于研钵中。加入蛋白浸提液(pH7.9Tris-HCl， 0.05M; EDTA O.lmM; NaC10.15M; SDSO.1%)并磨碎，并放入1.5ml离心管中4。C过夜，第 二天高转速离心12000rpm， 10min，吸取上清进行丙酮沉淀，沉淀溶解后电泳分 析结果见图4， Bradford蛋白定量法定量，低温保存备用。 实施例4
溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)对溶藻弧菌以及荧光假单胞菌的免疫保 护作用
纯化外膜蛋白Pal (VA1061)共I.Omg，对鲫鱼进行腹腔注射，每次免疫的 抗原量为25、g/尾，每组共20尾。首次免疫使用弗氏完全佐剂乳化，隔两周加强 免疫一次，加强免疫用弗氏不完全佐剂乳化。同时对照组则注射生理盐水。并且 对健康的鲫鱼进行溶藻弧菌以及荧光假单胞菌半数致死剂量LD5o的测定，根据等 对数间距选择试验浓度。在加强免疫后第10天，使用5倍LD5o剂量的溶藻弧菌 (5xl07cfU/mL)及荧光假单胞菌(5xl07cfU/mL)进行攻毒保护性实验。腹腔注 射攻毒后的第2天，对照组鱼的游动开始变得迟缓，并不断死亡，而具有免疫保 护作用的Pal (VA1061)实验组无异常反应。5天后鱼不再陆续死亡，观察记录实 验组和对照组对死亡情况，注射溶藻弧菌以及荧光假单胞菌的^]"照组存活率分别 为20%和5%，而实验组Pal (VA1061)的免疫保护效果有明显的差别，对溶藻弧 菌的免疫保护率(RPS)高达93. 7%，具有显著性差异(P〈0. 01)。同时Pal(VA1061) 还显示出对荧光假单胞菌的交叉保护作用，其免疫保护率(RPS)为63.2%。经 统计学计算表明Pal (VA1061)具有显著的免疫保护作用。说明Pal (VA1061)可 以刺激机体产生保护性抗体，提高宿主免疫保护能力，是一个很好的免疫保护原。
序列表
<110>中山大学
^20溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的表达和作为疫苗组份的应用
<160>2
<210>1
<211>525
<212>DNA
<213>溶藻弧菌
<400>1
atgcaactgaacaaggttctaaaagggctactaatcgcgcttcctgtaatggctgttaca60
gcgtgtagttcgctgcttctaacactggtgcaac朋tggc120
caacagtagctgcgccaattgatcaaagcggtcagttgac180
aagcgctacgtgaaa^tcaaacaatctact,ttgcttttga240
attgcagcaggatgctagcggctcacgcttcttacctaag300
gcacttaacgtaactatcgaaggtcacgctgatgagcgcggtacacctgagtacaacatt360
gctctaggtgagcgtcgtgcgcgaactacct.a.caagcactaggtgttcaa420
gctgaccaaatctcaa.tcgttagctacggtcacttcttctaggtcaatca480
gatgaagtttccgtcgcgcggttctagtat,525
<210>2
<211>144
<212>PRT
<213>溶藻弧菌
<400>2Met Gin Leu Asn Lys Val Leu Lys Gly Leu Leu lie Ala Leu Pro Val
15 10 15
Met Ala Val Thr Ala Cys Ser Ser Ser Asp Asp Ala Ala Ser Asn Thr
20 25 30
Gly Ala Ala Thr Asn Asn Asn Gly Ala Val Glu Thr Thr Val Ala Ala
35 40 45
Pro lie Asp Gin Ser Gly Gin Leu Thr Glu Gin Glu Leu Lys Glu Gin
50 55 60
Ala Leu Arg Glu Thr Gin Thr lie Tyr Phe Ala Phe Asp Asn Ser Tlir 65 70 75 80
lie Ala Ala Asp Tyr Glu Glu Met Leu Ala Ala. His Ala Ser Tyr Leu
85 90 95
Ser Lys Asn Pro Ala Leu Asn Val Thr lie Glu Gly His Ala Asp Glu
100 105 110
Arg Gly Thr Pro Glu Tyr Asn lie Ala Leu Gly Glu Arg Arg Ala Gin
115 120 125
Ala Val Ala. Asn Tyr Leu Gin Ala Leu Gly Val Gin Ala Asp Gin lie 130 135 140
Ser lie Val Ser Tyr Gly Glu Glu Lys Pro Leu Leu Leu Gly Gin Ser
145 150 155 160
Asp Glu Val Tyr Ala Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Val Tyr 165 170
权利要求
1. 一种溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)，其氨基酸序列序列表400<2>所示。
2. 编码权利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)的DNA，其核 苷酸序列如序列表400<1>所示。
3. 权利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal(VA1061)作为疫苗组份的应用。
4. 权利要求1所述的溶藻弧菌外膜蛋白PaKVA1061)免疫保护作用的应用。
5. 权利要求l所述的溶藻弧菌外膜蛋白Pal (VA1061)作为提高宿主免疫功 能制剂的应用。
全文摘要
本发明涉及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的一种重组外膜蛋白(outermembrane proteins)Pal(VA1061)的表达和疫苗组份的作用功能。本发明通过克隆溶藻弧菌重组外膜蛋白Pal(VA1061)基因、表达及纯化，纯化产品可以显著地提高鱼类对溶藻弧菌、荧光假单胞菌等病原菌的抵抗力。可作为亚单位疫苗的候选靶位，且对控制弧菌感染的免疫学防治具有十分重要的意义。
文档编号C12N15/31GK101386643SQ20081002983
公开日2009年3月18日 申请日期2008年7月29日 优先权日2008年7月29日
发明者彭宣宪, 惠 李, 熊莜鹏 申请人:中山大学