一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及微生物领域，具体涉及一种肠膜明串珠菌及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肠膜明串珠菌是乳酸菌中的明串珠菌属的重要菌种。美国FDA和AAFC0于1989 年将其列为可以直接食（饲）用的42种安全微生物之一。我国卫生部也于2012年将肠膜 明串珠菌肠膜亚种列入了《可用于食品的菌种名单》。
[0003] 研究证实，肠膜明串珠菌不仅具有普通乳酸菌的高产酸能力、抗氧化能力和颉颃 致病菌的特性，还具有在发酵中可产生种类丰富、数量较多的胞外多糖的能力。肠膜明串珠 菌也被发现广泛分布在发酵食品中，特别是发酵乳品、腌制泡菜和酿制果酒中。
[0004] 肠膜明串珠菌发酵蔗糖合成大量的葡聚糖，是生产代血浆的主要成分一右旋糖酐 的原料。在医疗上十分重要，具有维持血液渗透压和增加血溶量的作用，是目前公认的优良 血浆代用品之一，临床上常用于治疗由于失血、创伤、烧伤和中毒等引起的失血性休克。随 着肠膜明串珠菌胞外多糖的研究越来越全面和深入，由肠膜明串珠菌合成的功能性低聚糖 产品有望实现产业化生产。
[0005]目前，国内现有的肠膜明串珠菌主要产生可溶性多糖，不产生不可溶性多糖或者 不可溶性多糖产量很低，故此缺乏可以大量产生不可溶性多糖的新菌株。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是，针对现有的肠膜明串珠菌主要产生可溶性多糖， 不产生不可溶性多糖或者不可溶性多糖产量很低的现状，本发明提供一株肠膜明串珠菌 (Leuconostoc mesenteroides)及其培养方法和应用。所述的肠膜明串珠菌可以制备多糖， 尤其是大量制备不溶性多糖，可以更好地应用于乳制品发酵以及贮藏中。
[0007] 本发明的技术方案之一是：一种肠膜明串珠菌（Leuconostocmesenteroides)，其 保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNo. 10064。
[0008] 从黑龙江省的农家腌制泡菜中分离而得，获得所述的肠膜明串珠菌CGMCC No. 10064。对该菌株进行鉴定，结果为肠膜明串珠菌Leuconostocmesenteroides，命名为 BD3749。该菌株已于2014年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心，并收到保藏中心登记入册编号CGMCCNo. 10064。
[0009] 本发明的技术方案之二是：一种制备所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10064的方 法，其包括以下的步骤：在培养基中培养所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10064即可。
[0010] 其中，所述的培养基为本领域常规的培养基，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCC No. 10064即可。较佳地为TYC培养基，所述的TYC培养基为本领域常规的TYC培养基，较佳 地包括如下组分：胰胨（或酪朊水解物）1. 5g;酵母膏0. 5g;L-胱氨酸0. 02g;乙酸钠2. 0g; Na2S04 0 . 01g;NaCl0.lg;蔗糖5. 0g;蒸馏水100ml;如果为TYC固体培养基，则除了上述组 分，较佳地还包括1. 5-2. 0克（g)的琼脂，更佳地包括1. 8g琼脂。
[0011] 所述培养的温度为本领域常规的温度，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCC No. 10064,较佳地为25~37°C，更佳地为30~37°C，最佳为30°C。所述培养的时间为本 领域常规的时间，较佳地为18~72小时（h)，更佳地为18小时（h)或72小时（h)，最佳地 为18小时（h)。所述培养的pH为本领域常规的pH，能够生长所述的肠膜明串珠菌CGMCC No. 10064,较佳地为4~6,更佳地为4~5。
[0012] 本发明培养条件为本领域常规培养条件，较佳地为好氧静置培养，震荡培养或者 厌氧静置培养，所述震荡培养的震荡速度为常规的，较佳地为180r/min。
[0013] 较佳地，所述的培养前还包括使用种子培养基进行种子培养的步骤。所述的种子 培养为本领域常规的种子培养。所述的种子培养基为本领域常规的种子培养基，较佳地为 TYC培养基；所述种子培养的时间为本领域常规的时间，较佳地为16~32h，更佳地为16~ 24h，最佳为24h;所述种子培养的温度为本领域常规的温度，较佳地为28~32°C，更佳为 30°C。所述种子培养的接种量为本领域常规的接种量，较佳地为1~2%，更佳为1 %，所述 百分比为体积百分比。
[0014] 本发明提供的技术方案之三是：所述的肠膜明串珠菌CGMCCNo. 10064在胞外多 糖生产中的应用。所述胞外多糖包括可溶性的和不溶性的。
[0015] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实 例。
[0016] 本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0017] 本发明的积极进步效果在于：本发明提供的肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides)可以制备多糖，尤其能够大量制备不可溶性多糖，从而可以更好地控制乳 清析出。因此所述菌株以及该菌株制备而得的不可溶性多糖均能被用于乳制品发酵中，尤 其是在固体型蛋白产品（如奶酪）制备中起到凝固剂的作用，在牛奶制品贮藏中也能避免 因乳清析出造成产品的质构发生严重破坏，从而影响其品质及货架期。所述菌株培养方法 简单易操作，其制备而得的不可溶性多糖量大，适合产业化应用，具有广阔的市场。
[0018] 牛物材料保藏信息
[0019] 本发明的肠膜明串珠菌BD3749,已于2014年11月26日保藏在中国微生物菌种 保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，邮编：1〇〇1〇1，保藏编号为：CGMCCNo. 10064，培养物名称是 BD3749,分类命名是肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides。
【附图说明】
[0020] 图1为本发明肠膜明串珠菌BD3749在TYC上培养的菌落形态。
[0021] 图2为本发明肠膜明串珠菌BD3749与标准菌株肠膜明串珠菌ATCC10830a菌落形 态的对比。
【具体实施方式】
[0022] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实 施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商 品说明书选择。
[0023] 本发明所用到的培养基成分如下：
[0024]TYC培养基（液体TYC培养基）：胰蛋白胨1. 5g;酵母膏0. 5g;L_胱氨酸0. 02g; 乙酸钠 2. 0g;Na2S04 0·Olg;NaCl0·lg;鹿糖 5. 0g;蒸馏水 100ml;115°C，灭菌 15min。
[0025] TYC固体培养基：液体TYC培养基另加入1. 8g琼脂。
[0026] 实施例1菌株BD3749的分离
[0027] 取黑龙江省的农家腌制泡菜，以无菌方式取lg，浸入无菌生理盐水中，取浸出液进 行梯度稀释，通过涂布的方式将稀释液均匀涂布于固体TYC培养基上，30°C培养24-48h。选 取粘鼻涕状、具有良好拉丝性的单菌落多个，分别转接到新的固体TYC培养基上，得到多个 纯化的菌落，将其中一个单菌落命名为BD3749。
[0028] 实施例2菌株BD3749的特征
[0029] 1、菌落特征
[0030] 取菌株BD3749的单菌落，转接到TYC固体培养基（琼脂）上，于37°C厌氧箱恒温 培养箱中培养24h后，观察其菌落的大小、颜色、边缘、凸起、光滑度、粘性、透明度等特点。 结果如图1所示。结果显示，菌株BD3749形成粘鼻涕状、具有良好拉丝性的、边缘整齐、凸 起、光滑、无色不透明的单菌落。
[0031] 2、形态学观察及生理生化特征
[0032] 挑取在TYC固体培养基（琼脂）上培养24h的新鲜培养物，进行生理生化测试。结 果显示，BD3749为革兰氏阳性球菌，兼性厌氧。接触酶实验阴性，氧化酶阴性。
[0033] 3、API5〇CH鉴定特征
[0034] 利用API50CH鉴定系统（生产厂商：bioM^rieux)测定菌株BD3749发酵碳水 化合物的产酸情况。API50CH的试剂条中，不同的序列号对应不同的碳源，同时，其中含有 指示剂，这样，如果其对应的碳源被利用，则培养液pH下降，指示剂便会改变颜色，利于观 察记录。
[0035]API50CH鉴定系统操作步骤如下：
[0036] 1)API50CH基础培养基成分：胰蛋白胨lg，酵母膏0· 5g，硫酸铵2g，酚红0· 18g， 无机盐基础（Cohen-Bazire)lOml，磷酸盐缓冲液（pH7. 8) 1000ml。
[0037] 2)在平板上培养菌株BD3749,挑取有多个大小相近，单菌落分离的平板。挑取大 小相近的单菌落若干个，加入1)中的培养基中，制成〇D_= 0. 4~0. 6的菌悬液。
[0038] 3)将接过种的API50CH培养基加入到含有实验条的小管中，上面覆盖一层已灭 菌的石蜡油。
[0039] 4)在30 °C的恒温培养箱中好氧培养，分别在24h和48h记录实验现象。
[0040] 菌株BD3749利用碳水化合物发酵产酸的结果如表1所示。
[0041] 表1.菌株BD3749的API50CH鉴定结果
[0042]
[0044] " + "表示利用糖产酸，表示不产酸。
[0045] 4、16srDNA序列同源性分析
[0046] 挑取TYC平板培养的BD3749菌株2-3环接入30ml液体TYC培养基中，置 于30°C下，180r/min振荡培养18h。12000rpm离心5min收集菌体。利