大肠杆菌表达的融合蛋白mbp-mart-1及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种大肠杆菌表达的重组蛋白及其制备和应用，特别是涉及一种大肠 杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] MART-1 (melanoma antigen recognized by T-cellsl，又名 Melan-A)是人类黑 色素细胞分化抗原，在正常黑色素细胞和几乎所有黑色素瘤肿瘤细胞中表达，在其他组织 或细胞中不表达。MART-1上有多个免疫优势表位，它们在体内外被诱导产生特异性T细胞 免疫应答，在黑色素瘤特异性免疫治疗中拥有良好的应用前景。
[0003] 重组MART-1蛋白的表达、纯化在表位肽的发现及鉴定等发面发挥着重要作用。一 方面，重组MART-1蛋白可直接由树突状细胞摄取、加工后，提呈天然表位，刺激T细胞。 获得的特异性T细胞在HLA分型相符的前提下可直接用于免疫治疗，进一步研究可鉴定得 到其所识别的表位肽序列。另一方面，重组MART-1蛋白可用于对人工合成MART-1表位肽 的鉴定。同时，利用重组蛋白免疫后得到的抗体在黑色素肿瘤研究中将起到重要作用。
[0004] 然而，目前对于利用大肠杆菌表达MART-1可溶性蛋白的制备方法还有待提高。
【发明内容】
[0005] 本发明要解决的技术问题是提供一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP (Maltose-binding protein)-MART-1及其制备和应用。本发明解决了很难快速简便获得 大量大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白的难题。
[0006] 为解决上述技术问题,本发明的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1 (即重组蛋 白MBP-MART-1 )，是通过以下方法制备得到的：
[0007] 通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL_p5x载体(质粒） 中，得到MART-1-pMAL-p5x重组载体，并将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中， 经25~37°C培养16~20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性 大肠杆菌；
[0008] 将该阳性大肠杆菌落接种于LB培养基中，25~37°C培养至0D6QQ=0. 6~0. 8,用 IPTG(异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导表达3~4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用 细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测， 得到融合蛋白MBP-MART-1。
[0009] 上述大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的制备方法，包括步骤：
[0010] 1)通过PCR方法得到人MART-1基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得 到MART-1-pMAL-p5x重组载体（即含MART-1基因的pMAL-p5x载体）；
[0011] 2)将MART-1-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，在25~37°C培养16~20 小时后，经PCR鉴定，得到含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌（即转化子）；
[0012] 3)将含MART-1-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌的单菌落接种于LB培养基中， 25~37°C培养至0D6(I(I=0. 6~0. 8,用IPTG诱导表达3~4h后，将菌液离心弃上清，将菌体 用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检 测，得到融合蛋白MBP-MART-1。
[0013] 所述步骤1)中，PCR方法中的上下游引物分别如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0. 2所 /_J、i 〇
[0014] 所述步骤2)中，大肠杆菌包括：大肠杆菌BL21(DE3);IPTG的用量为0. 1~0. 5mM; 细菌裂解液的配方为：每l〇〇〇mL溶液中含有5~10mM咪唑、500~700mM氯化钠、20~30mM Tris 和曲拉通 X-100 10mL。
[0015] 所述步骤3)中，进行直链淀粉树脂纯化的操作包括：用柱缓冲液（Column Buffer)洗直链淀粉树脂柱，用含10~30mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱蛋白，经SDS-PAGE电泳 检测，得到融合蛋白MBP-MART-1;其中，柱缓冲液配方为：20~30ml 1. 0-1. 5M Tris-HCl、 11. 7g氯化钠和2. 0ml0. 5M EDTA的混合物；融合蛋白MBP-MART-1的纯度为95%以上。 [0016] 本发明还公开了大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1的应用，其中，所述融合蛋 白MBP-MART-1在制备MART-1抗体中的应用。
[0017] 另外，本发明还提供一种表达融合蛋白MBP-MART-1的大肠杆菌，其中，所述大肠 杆菌含MART-1-pMAL-p5x重组载体。
[0018] 优选地，所述大肠杆菌是含MART-1-pMAL-p5x重组载体的大肠杆菌BL21 (DE3)。
[0019] 本发明中，MBP是Maltose-binding protein的缩写，可译为麦芽糖结合蛋白，它 是本发明中所用到的载体pMAL-p5x上带有的蛋白标签，以便于纯化。
[0020] 本发明可以快速简便的获得大量大肠杆菌表的MART-1可溶性蛋白，解决了其它 方法获得大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程。
【附图说明】
[0021] 下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明：
[0022] 图1是MART-1基因的PCR结果图，其中，1为标记（Marker)，2、3为MART-1基因；
[0023] 图2是含重组载体的菌落鉴定PCR结果，其中，1、2为含重组载体的菌落，3为标记 (Marker)；
[0024] 图3是质粒鉴定PCR结果，其中，1为标记（Marker)，2为MART-1基因；
[0025] 图4是表达和纯化MART-1的电泳图，其中，M为标记（Marker)，BI为表达菌诱 导前蛋白条带（即诱导前)，AI为表达菌诱导后蛋白条带（即诱导后)，S为上清，FT为上清 上样的流穿（即穿透Ni柱的蛋白），E1为用Column Buffer洗脱的第一管洗脱液的蛋白 条带【即0. 18g/ml (3ml)洗脱液】，E2为用Column Buffer洗脱的第二管洗脱液的蛋白条 带【即1. 25mg/ml (5ml)洗脱液】，E3为用Column Buffer洗脱的第三管洗脱液的蛋白条带 【即4. 79mg/ml (4ml)洗脱液】，E4为用Column Buffer洗脱的第四管洗脱液的蛋白条带【即 8. 09mg/ml (3ml)洗脱液】；
[0026] 图5是MBP-MART-1重组蛋白酶切结果，M为Mark;1为Factor Xa:重组蛋白 =2:100 ;2 为 Factor Xa :重组蛋白=4:100 ;3 为 Factor Xa :重组蛋白=6:100 ;4 为 Factor Xa :重组蛋白=8:100。
【具体实施方式】
[0027] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人， 分子克隆：实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述 的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0028] 另外，实验中涉及的试剂如未特别说明，则是商业化产品。
[0029] 实施例1
[0030] 1?重组载体 MART-1-pMAL_p5x 的构建
[0031] 1. 1按下列体系配制反应混合液：
[0032] 模板DNA(Template DNA，购自Template DNA open biosystem公司）0?5-0.8 ug， 10XPCRbuffer5. Oil 1，上下游引物各 2. Oil l，dNTPs (2. 5mM)4. Oil l，pfu 聚合酶（5U/ii 1) 0? 5 u 1，增加 ddH20 至 50. 0 u 1，9000rpm 离心 5 秒。
[0033] 其中，dNTPs、pfu聚合酶、10XPCR buffer均购买于北京博海众诚生物科技有限公 司；
[0034]上游引物序列为：CCGGAAGGAITTCAATGCCAAGAGAAGATG (SEQ ID NO. 1);下游引物序 列为：CCCAAGCTTTTAAGGTGAATAAGGTG (SEQ ID N0.2)。
[0035] 1. 2PCR反应循环条件：
[0036] 94 °C 3分钟1个循环
[0037]
【主权项】
1. 一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-I，其特征在于，所述融合蛋白MBP-MART-I 是通过以下方法制备得到的： 通过PCR方法得到人MART-I基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到MART-l-pMAL-p5x重组载体，并将MART-l-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，经25~ 37°C培养16~20小时后，经PCR鉴定，得到含MART-l-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆 菌； 将该阳性大肠杆菌落接种于LB培养基中，25~37°C培养至0D_=0. 6~0. 8,用异丙 基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3~4h后，将菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液 裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋 白MBP-MART-I。
2. -种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MRT-I的制备方法，其特征 在于，包括步骤： 1) 通过PCR方法得到人MART-I基因的扩增产物，将其连接到pMAL-p5x载体中，得到 MART-l-pMAL-p5x重组载体； 2) 将MART-l-pMAL-p5x重组载体转化入大肠杆菌中，在25~37°C培养16~20小时 后，经PCR鉴定，得到含MART-l-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌； 3) 将含MART-l-pMAL-p5x重组载体的阳性大肠杆菌的单菌落接种于LB培养基中，25~ 37°C培养至OD6tltl=O. 6~0. 8,用异丙基-P-D-硫代吡喃半乳糖苷诱导表达3~4h后，将 菌液离心弃上清，将菌体用细菌裂解液裂解后，离心取上清，并对上清进行直链淀粉树脂纯 化，经SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-1。
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤1)中，PCR方法中的上下游引物分 别如SEQIDNO. 1 和SEQIDNO. 2 所示。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤2)中，大肠杆菌包括：大肠杆菌BL21 (DE3)； 异丙基-0 -D-硫代吡喃半乳糖苷的用量为0. 1~0. 5mM; 细菌裂解液的配方为：每1000 mL溶液中含有5~IOmM咪唑、500~700mM氯化钠、20~ 30mMTris和曲拉通X-10010mL。
5. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，进行直链淀粉树脂纯化的 操作包括：用柱缓冲液洗直链淀粉树脂柱，用含10~30mM麦芽糖的柱缓冲液洗脱蛋白，经 SDS-PAGE电泳检测，得到融合蛋白MBP-MART-I; 其中，柱缓冲液配方为：20~30ml1.0-1. 5MTris-HClUL7g氯化钠和2.OmlO. 5M EDTA的混合物。
6. 如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述步骤3)中，融合蛋白MBP-MRT-I的纯 度为95%以上。
7. -种如权利要求1所述的大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MRT-I的应用，其特征在 于：所述融合蛋白MBP-MART-I在制备MART-I抗体中的应用。
8. -种表达融合蛋白MBP-MART-I的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌含权利要求 2所述的MART-l-pMAL-p5x重组载体。
9. 如权利要求8所述的大肠杆菌，其特征在于：所述大肠杆菌是含MART-l-pMAL-p5x
【专利摘要】本发明公开了一种大肠杆菌表达的融合蛋白MBP-MART-1及其制备和应用，该蛋白是通过以下方法制备得到的：将人MART-1基因的扩增产物连接到pMAL-p5x载体中，得重组载体，将重组载体转化入大肠杆菌中，培养，鉴定，得到含重组载体的阳性大肠杆菌；将该阳性大肠杆菌落接种于培养基中，培养，用IPTG诱导表达后，将菌液离心弃上清，将菌体裂解后，离心取上清，对上清进行纯化，检测，得到该蛋白。该蛋白可用于制备MART-1抗体中。本发明可快速简便地获得大量大肠杆菌表的MART-1可溶性蛋白，解决了其它方法获得大肠杆菌表达的MART-1可溶性蛋白需要大量诱导并要透析的复杂过程。
【IPC分类】C07K16-18, C12R1-19, C07K19-00, C12N1-21, C12N15-70
【公开号】CN104761644
【申请号】CN201410003262
【发明人】王海燕, 何志娟, 连晓宁, 夏瑞红
【申请人】百奇生物科技（苏州）有限公司, 苏州药明康德新药开发股份有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月3日