抗虫蛋白、抗虫融合蛋白、编码基因、载体及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种具有尚杀虫能力的抗虫基因和抗虫蛋白质、一种具有尚杀虫能力 的抗虫融合基因和融合蛋白质、以及用该抗虫蛋白或抗虫融合蛋白构建抗虫农作物的具体 应用。 (二）
【背景技术】
[0002] 害虫给全球农业生产带来每年约80亿美元的损失。水稻害虫种类复杂，自播种、 秧苗期至成熟期，由种、苗、根、茎、叶、花穗、谷粒均可受不同害虫危害。国内已知的水稻害 虫已达385余种，其中最主要的有40余种，如三化螟、二化螟和大螟等分布广泛，危害严重。 目前，害虫的防治主要是依靠化学农药，化学农药的使用对于农业持续稳定的发展发挥了 重要作用。但是，在经过半个多世纪的使用之后，化学农药已经暴露出了严重的问题。例如 化学农药在自然界和农作物中的残留以及在食物链中的富积已经造成了严重的环境污染， 对人畜安全直接构成威胁；由于化学农药非特异性的作用方式，杀死靶标害虫的同时也对 毒害了许多益虫和捕虫鸟类，破坏了生态平衡；并且由于长期使用化学农药，特别是不合理 的滥用，许多害虫已逐步对其产生了抗性（林良斌等，1997)，常规剂量已不能有效地防治 害虫，然而随着用药剂量的加大，害虫的抗性也随之增强，由此形成恶性循环，导致防治成 本显著增加，并且带来了更为严重的环境污染、生态失调和人类健康的危害。
[0003] 近年来，随着分子生物学技术特别是植物基因工程的迅速发展，为防治农作物害 虫提供了新的途径。抗虫是目前农作物转基因改良领域中应用最广泛的技术之一，国际上 的主要农业生物技术公司和种子公司都在从事该方面的研发，并且已经取得了革命性的进 展。利用基因工程技术，将抗虫基因导入农作物，使其在农作物体内表达抗虫蛋白并能稳定 遗传，形成抗虫转基因农作物新品系。种植转基因抗虫农作物大幅度降低了化学农药的使 用量，减少了害虫造成的损失，为农业生产创造了巨大的价值。目前应用于农作物抗虫性状 改良的外源基因主要有苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt)杀虫基因、植物凝 集素基因和蛋白酶抑制剂基因等。其中Bt杀虫基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基 因，Bt蛋白对鳞翅目、双翅目和鞘翅目昆虫都具有很好的杀虫活性。
[0004] 获得转基因抗虫农作物的关键技术是获得性能优良的杀虫蛋白质。杀虫蛋白 质有多种，比较常用的是苏云金芽孢杆菌（简称Bt)晶体蛋白质，例如CrylAb、CrylAc、 Cry2Ab等，它们已被大量运用于转基因抗虫农作物（Crickmore N, Zeigler D, Feitelson J, Schnepf E, Van Rie J, Lereclus D, Baum J, Dean D. (1998)Microbiol. Mol.Biol. Rev. 62, 807-813)。但是，单个杀虫蛋白质往往杀虫谱比较窄，杀虫活性比较低。同时，长 期大量使用单一的杀虫蛋白质还可能引起害虫抗性的发展（Ferre J, Van Rie J. (2002) Annu. Rev. Entomol. 47, 501-533 ；Gassmann A, Carriere Y, Tabashnik B. (2009)Annu. Rev. Entomol. 54, 147-163)。因此，获得具有尚杀虫活性的新型蛋白质杀虫毒素，对提尚杀虫能 力和减缓害虫抗性的发生具有重要的应用价值（Chen，M.，Shelton，A.，Ye，G. (201 l)Annu. Rev. Entomol. 56, 81-101)。
[0005] 相比单个基因的转化，多个基因的聚合使用在转基因作物中具有明显的优势。所 谓基因聚合就是指在同种作物品种中转入两个不同的抗虫基因。这两个基因可以是两种 不同的Bt基因，也可以是一种Bt基因和一种非Bt抗虫基因，例如Cheng等在转基因水 稻中表达Bt融合蛋白基因 CrylAbCrylAc，对于二化螟防治效果良好（Cheng XY, Sardana R1Kaplan H1Altosaar I. (1998)Proc Natl Acad Sci USA. 95, 2767-2772) ；Bohorova 等将融合基因 crylBcrylAb转入玉米中来防治多种农业害虫（Bohorova N, Frutos R1Royer M, Eslanol P1Pacheco M1Rascon Q1McLean S1Hoisington D. (2011)Thoer Appl Genet. 103,817-826)。使用二价或多价抗虫基因相对于单个基因有以下几个方面的优势： 杀虫效果更好，经济实用；杀虫谱更广，多个抗虫基因之间杀虫谱可以互相弥补，不同的基 因对同种害虫的杀虫效果也存在差异，可以相互补充；可以有效延缓抗性品种的使用寿命， 理论上昆虫同时对两种不同的Bt基因同时产生抗性的几率大大低于对单个Bt基因产生抗 性的几率，因而能有效延缓昆虫产生抗性的时间。因此，同时使用无交互抗性的Bt毒素对 于治理昆虫抗性是一种经济而有效的措施，必须加快发展利用抗虫融合基因创建具有更好 抗虫活性的转基因农作物。
[0006] 然而，本领域的技术人员都知道，并不是所有的两个杀虫基因的融合都能够增强 杀虫能力的。例如CrylAb和CrylCa的融合蛋白质的杀虫能力比相同重量的单独CrylAb 和CrylCa的混合物的杀虫能力还要低。另外，即使两个单独的抗虫蛋白质组合使用具有增 效作用，但也并不能得出它们的融合蛋白具有高效杀虫能力；这是因为：在蛋白质生物化 学上，两个单独蛋白质的物理混和与融合是不同的，不能根据物理混和所具有的增效作用 来肯定融合后所获得的增效作用；而且在不同位置融合所得的融合蛋白的活性是大相径庭 的。
[0007] 本发明首次公开了一种具有高杀虫能力的BT晶体毒素 Cry2蛋白质，并且设计了 用一个Cryl晶体毒素与该Cry2晶体毒素融合成的人工蛋白质分子，与原先的Cryl和Cry2 晶体毒素物理混合相比，具有如下优点：杀虫活性提高了 10倍以上，杀虫谱更广。本发明的 杀虫蛋白质可以杀灭棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等水稻、玉米和棉花的主要鳞翅目 害虫。此外，本发明发现的融合蛋白质还可以有效的减缓害虫抗性的发生。 (三）
【发明内容】
[0008] 本发明目的是提供一种具有高杀虫能力的抗虫蛋白及抗虫融合蛋白，以及在抗虫 药物及抗虫农作物中的应用。
[0009] 本发明采用的技术方案是：
[0010] 本发明提供一种抗虫蛋白，所述抗虫蛋白（Cry2Aj)的氨基酸序列与SEQ ID NO: 1 相比具有90%的同源性，更优选所述氨基酸序列为SEQ ID N0:1所示。
[0011] 本发明还涉及所述抗虫蛋白编码基因，所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO: 2所示。
[0012] 本发明涉及一种由所述抗虫蛋白编码基因构建的重组载体，以及由重组载体转化 制备的重组工程菌。
[0013] 本发明提供一种所述抗虫蛋白在制备抗虫药物中的应用，所述虫为水稻、玉米和 棉花的主要鳞翅目害虫，如棉铃虫、甜菜夜蛾、玉米螟、二化螟等。
[0014] 本发明提供一种所述抗虫蛋白在制备抗虫植物细胞中的应用，所述植物为水稻、 玉米、棉花、小麦、高粱、大豆、油菜、萝卜或甘蓝等农作物。
[0015] 此外，本发明还提供一种含所述抗虫蛋白的抗虫融合蛋白，所述抗虫融合蛋白从N 端到C端依次含有BT晶体毒素 Cry 1蛋白和抗虫蛋白（Cry2Aj)，优选所述抗虫融合蛋白的 氨基酸序列为SEQ ID N0:3所示，更优选所述融合蛋白是由SEQ ID NO: 1所示蛋白Cry2Aj 与SEQ ID N0:5所示蛋白CrylAb连接构成，其中蛋白CrylAb编码基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:6所示，该融合蛋白从N端至C端依次为CrylAb晶体毒素和抗虫蛋白Cry2Aj。
[0016] 本发明涉及一种所述的抗虫融合蛋白的编码基因，所述编码基因与SEQ ID NO :4 所示核苷酸序列相比具有92 %以上的同源性，更优选所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO :4所示。抗虫融合基因包括从5' -3'依次含有编码BT晶体毒素 Cryl的核苷酸序列和 编码抗虫蛋白Cry2Aj的核苷酸序列，且这两个