一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达载体的制作方法
【技术领域】
[0001 ]本发明属于基因工程和发酵工程领域，涉及一种人类金属硫蛋白-4融合蛋白表达 载体，尤其是涉及一种具有伴侣样蛋白功能的人类游离脂肪酸结合蛋白与人类金属硫蛋白 的融合表达。
【背景技术】
[0002] 1957年Margoshes和Vallee在研究金属生物学作用时，从动物器官分离出一种新 的蛋白质，它含有丰富的巯基，能螯合大量的金属离子，此物质称为金属硫蛋白（英文为 Metallothionein，简称MT) 〇
[0003] 关于金属硫蛋白，全球从1978年到1999年，先后在瑞士、日本、美国共举行了四次 国际专题研讨会，第五次国际专题研讨会于2005年10月在北京召开。1987年我国将MT列入 [863]计划，"八五"、"九五"重大攻关项目，1994年列入国家级[火炬计划];2003年MT项目被 国家科技部列为"国家科技成果重点推广计划项目，1995年联合国将MT列入向世界各国推 荐的生物技术产品。由此可见从国内到国外对MT的研究、开发、推广、应用的高度重视。
[0004] 金属硫蛋白（Metallothionein，MT)，又称疏基金属结合蛋白。一类非酶蛋白质，除 含有镉(Cd)、锌(Zn)的MT外，在自然界也存在含有铜(Cu)、萊(Hz)、金(Au)、铋(Bi)等元素的 MTJT的蛋白分子内不含有芳香族氨基酸和组氨酸。让MT中50%的金属离子发生解离的pH 值分别为：Zn-MT: 3 · 5~4 · 5 ; Cd-MT: 2 · 5~3 · 5 ; Cu-MT〈1 · 0。因 MT缺乏芳香族氨基酸，故在 280nm处无吸收峰，然而具有与金属相关的吸收峰。去金属的MT在190nm处有一个吸收峰。所 有脊椎动物、多数植物和微生物体内都含有MT。无论是自然产生还是诱导产生的MT，其氨基 酸组成基本相同、主要不同在所含金属及其含量。
[0005] 人类MT按分子特征和分布分为四个亚群:]\0'1、]\0'2、]\?'3、]\?'4。]\0'1又分9个亚类，]\?'2 又分MT2a和ΜΤ21^ΜΤ1和MT2分布全身，MT3分布于脑，MT4主要分布于皮肤。
[0006] 自由基是人体衰老的第一大元凶，自由基还与人类若干中老年疾病紧密相关，导 致人体免疫力逐步下降，ΜΤ是目前已知的最好的自由基清除剂，减少自由基就能延缓人体 衰老步伐。同时，ΜΤ也是目前唯一有效的重金属解毒和清除蛋白。人体重金属超标或中毒， 损害肝、肾、骨、脑和记忆功能，引发多种疾病。
[0007] 大量的科学实验和临床结果表明：ΜΤ在抗电离辐射、紫外线照射、解除金属毒素、 治疗或缓解消化道溃疡、心肌梗塞、各种炎症、各种癌症、保护皮肤、减轻吸烟及环境污染对 人体的危害及抗过敏等方面均有显著疗效。
[0008] 目前ΜΤ产品主要从兔肝、马肾、猪肝和微生物（如粗脉孢菌）等中提取，成本高、产 量低，抑制了她的广泛使用，比如食品、饮品、化妆品等。
【发明内容】
[0009] 本发明的目的是提供一种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体。
[0010] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：
[0011] -种人类金属硫蛋白融合蛋白表达载体，所述的人类金属硫蛋白融合蛋白表达载 体是将人类金属硫蛋白-4(MT4)的编码序列作为目标蛋白编码序列插入伴侣样蛋白的融合 蛋白表达载体的多克隆区所得;所述的伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体上游含有人类游离 脂肪酸结合蛋白-6的编码序列，人类游离脂肪酸结合蛋白编码序列下游包含一段柔性接头 区和用于插入目标蛋白编码序列的多克隆区。
[0012] 所述的人类游离脂肪酸结合蛋白与人类天然游离脂肪酸结合蛋白的同源性等于 或大于85%，所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列优选为经过密码子优化的编码 序列。
[0013] 所述的人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列进一步优选如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 所述的柔性接头区和多克隆区序列优选如SEQ ID NO.3所示。
[0015] 所述的人类金属硫蛋白-4其氨基酸序列优选与人类天然金属硫蛋白的氨基酸序 列的同源性等于或大于75%。
[0016] 人类金属硫蛋白-4(MT4)氨基酸序列如SEQ ID N0.22所示，该蛋白经密码子优化 后的核苷酸编码序列优选如SEQ ID N0.21所示。
[0017] 所述的表达载体中人类游离脂肪酸结合蛋白-6的编码序列的上游还包含编码用 于分离纯化融合蛋白的标签的序列，优选编码组氨酸标签的序列。
[0018] 有益效果：
[0019] 1.本发明构建的重组表达载体能够促进或诱导被融合的下游人类金属硫蛋白融 合蛋白的折叠，具有蛋白伴侣样蛋白的特性。
[0020] 2.该FABP蛋白为人源性，理论上不存在对人体的免疫原性，适于制药工业中解决 目标蛋白包涵体问题，并且可以保留融合蛋白一同制药。
【附图说明】
[0021] 图l、hFABP融合蛋白示意图
[0022] 图2、pET28a-hFABP6表达载体物理图
[0023] 图 3、pET28-hFABP6-MT4 环状质粒物理图。
【具体实施方式】
[0024] 下面通过具体实施例对本发明的应用进行说明，所举的实施例仅是对本发明的应 用作概括性例示，有助于更好地理解本发明的用途，但并不会限制本发明应用范围。下述实 施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法;所述试剂和材料，如无特殊说明，均可 从商业途径获得。
[0025] 实施例1
[0026] -种伴侣样蛋白的融合蛋白表达载体的构建方法，包括以下步骤：
[0027] 步骤一、hFABP的编码DNA的人工合成和优化，本实施例以hFABP6为例：
[0028] (1)取hFBP6氨基酸序列（SEQ ID勵.2)逆向翻译成0嫩编码序列，经过密码子优先 性、核糖体结合区序列优化获得序列（SEQ ID N0.1)，但不限于此序列，以翻译后的蛋白质 氨基酸序列同源性等于或大于85 %为限。
[0029] (2)将该编码序列分段合成寡核苷酸单链DNA(SEQ ID N0.5~18)。
[0030] (3)多聚酶链式反应（PCR)法合成全长编码DNA序列，包含5'-6xHisTag(SEQ ID NO.4)、hFBP6氨基酸编码序列、3'-柔性接头序列(Linker)和多克隆区（SEQ ID NO.3)。
[0031] (4)经测序反应验证全长DNA序列（SEQ ID NO. 19所示）。
[0032] 步骤二、载体制备：
[0033] (1)将步骤一合成得到的hFABP6编码序列（SEQ ID N0.19)，包含5'-6xHisTag、3'- 柔性接头序列(Linker)和多克隆区，经限制性内切酶酶切消化、琼脂糖凝胶纯化，获得两端 分别是Nco I和Xho I的粘性接头的插入片段。
[0034] (2)制备表达载体pET28a，但不限于该表达载体：
[0035] ①取pET28a载体lyg，用限制性内切酶Nco I和Xho I双酶切。
[0036]②琼脂糖凝胶电泳分离、纯化线性化后的pET28a载体。
[0037]③用T4 DNA连接酶将包含hFABP6序列的插入片段和步骤②制备好的pET28a表达 载体连接。
[0038]④转化大肠杆菌感受态菌株DH5a，含卡那霉素(Kan)抗生素的培养皿培养过夜，然 后挑取单菌落，PCR法鉴定阳性克隆，常规制备DNA质粒。
[0039]⑤将阳性克隆质粒送交DNA序列分析，选取和保留正确序列的克隆供表达测试。 [0040]⑥载体命名为pET28a-hFABP6(SEQ ID N0.20)
[00411步骤三、载体的表达测试：
[0042] (1)将步骤二得到的pET28a-hFABP6载体DNA质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态 细胞，获得Kan抗性的菌落。
[0043] (2)挑取单菌落数个，LB培养基