五个烟草金属硫蛋白基因的新应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物基因工程领域，具体设及五个烟草金属硫蛋白Uicotiana 主aba州m ^化llo；yiionein,化MT)及其编码基因和在调控酵母儒耐受和积累方面的应用。
【背景技术】
[0002] 金属硫蛋白是生物体内广泛存在的小分子蛋白，富含半脫氨酸，结构高度保守。研 究表明，金属硫蛋白可W结合儒、锋、铜在内的多种重金属离子，在细胞内具有重金属解毒 的功能，同时还可W参与微量元素的储存、转运和代谢。同时，由于金属硫蛋白含有多个还 原性的半脫氨酸残基，具有较强的抗氧化能力，能清除细胞内富余的活性氧，降低由各种逆 境胁迫照成的氧化胁迫伤害。由此可见，金属硫蛋白强大的生化功能决定了该类蛋白具有 较大的应用潜力。通过克隆不同生物体内的金属硫蛋白基因，并开发该类基因的应用价值， 具有重大的意义。本发明公布了烟草中的五个金属硫蛋白基因的克隆，并公开了该类基因 在针对重金属儒污染的植物基因工程和微生物基因工程方面的应用价值。
[0003] 来自工业、采矿业和化肥的重金属对环境的污染已成为当今世界重要的环境问题 之一。而儒污染在我国所有±壤污染物中排名第一，±壤儒污染超标面积已达我国国±总 面积的7%。重金属污染一个重要的特点就是不能被降解，可W长期存在于环境中，并通过 食物链进入人体，最终危害人体健康。针对环境的重金属清除技术包括微生物修复和植物 修复技术，将金属硫蛋白基因应用于生物工程，用于改造微生物和植物，提高其对重金属的 富集能力，具有重要的意义。目前，还没有文献报道烟草体内的金属硫蛋白基因是否能影响 重金属(特别是儒)在生物体内，特别是烟草中的的耐受或者积累。
[0004] 在本发明中，我们主要公开了烟草体内的五个金属硫蛋白基因，该类基因在烟草 体内的表达对重金属儒胁迫响应。金属硫蛋白基因的表达能够影响重金属儒在生物体内的 积累，提供了将该类基因应用于工程菌一一酿酒酵母的耐儒遗传改造的应用，也可应用于 针对儒污染微生物修复工程菌的遗传改造;本发明也阐述了可将该基因应用于植物的遗传 改造，培育用于重金属儒污染植物修复的转基因重金属超积累植物。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是提供五个烟草金属硫蛋白化MT1，化MT2,化MT3,化MT4和 化MT5;及其编码基因化MT1，化MT2，化MT3，化MT4和化MT5的新应用。
[0006] 实现上述目的的技术方案如下：
[0007] NtMTl，NtMT2，NtMT3，NtMT4和化MT5基因在改良植物对重金属儒的耐受性或富集 性中的应用，所述化MT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和化MT5基因的cDNA分别为如沈Q ID NO. 1， 569 10顯.3,569 10顯.5,569 10^.7和569 10^.9所示的核巧酸序列，或分别为与 沈Q ID NO. 1，SEQ ID NO.3,沈Q ID NO.5,SEQ ID NO.7和沈Q ID NO.9互补配对的的核巧 酸序列，或分别为编码SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.4，SEQ ID N0.6，SEQ ID N0.8和SEQ ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白的核巧酸序列。
[000引 氨基酸序列分别如SEQ ID N0.2，SEQ ID N0.4,沈Q ID N0.6，SEQ ID ^.8和沈9 ID NO. 10所示烟草金属硫蛋白化MTl，化MT2，化MT3，化MT4和化MT5在改良植物对重金属Cd 的耐受性或富集性中的应用。
[0009] 本发明的五个烟草金属硫蛋白化MT1，化MT2，化MT3，化MT4和化MT5，其氨基酸序列 分别如序列表中沈〇1〇側.2,569 10側.4,56〇10側.6,569 10側.8和沈〇10側.10所 示，其编码基因 NtMTl，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5的cDNA核巧酸序列分别如序列表中沈Q ID NO. 1，沈Q ID NO.3,SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.7和沈Q ID NO.9所示。应当理解，考虑到 密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述编码基因的核巧酸序列进行修改， 也属于本发明的保护范围内。
[0010] 本发明将上述五个烟草金属硫蛋白基因应用于植物基因工程中，用于改变转基因 植物对重金属儒的耐受和富集的可能性。本发明公开了五个烟草金属硫蛋白基因在儒胁迫 下的诱导表达特征，表明了该基因参与重金属儒的应答及解毒。本发明采用real time RT-PCR的方法鉴定了五个烟草金属硫蛋白基因在重金属Cd胁迫下的表达特征，论证了该基因 为烟草体内应答重金属胁迫的重要基因，进一步延伸了该基因作为影响烟草重金属积累和 胁迫的候选功能基因。
[0011] 本发明的另一目的是公开一组酿酒酵母重组表达载体W及相应的酿酒酵母及其 应用，该重组载体插入了五个烟草金属硫蛋白基因。将该重组载体转化进入酿酒酵母中，通 过半乳糖诱导该基因在酵母中的超表达，能够在儒胁迫下，提高酵母对重金属儒的耐受，并 改变酵母细胞内儒积累。
[0012] 具体技术方案如下。
[0013] 插入有上述化MT1，化MT2，化MT3，化MT4和化MT5基因的cDNA阅读框序列的酿酒酵 母重组表达载体。
[0014] 上述酿酒酵母重组表达载体在改良工程菌株酿酒酵母对重金属儒的耐受性或富 集性中的应用。
[0015] -种酿酒酵母，其转化有上述的酿酒酵母重组表达载体。该酿酒酵母在对环境中 重金属儒污染的微生物修复工程中的应用。
[0016] 本发明的另一目的是提供一种改良烟草中重金属儒的耐受性或富集性的生物制 剂。
[0017] 实现上述目的的技术方案如下。
[0018] -种改良烟草中重金属儒耐受性或富集性的生物制剂，其活性成份来源于上述酿 酒酵母重组表达载体或酿酒酵母，或其活性成份含有化MT1，化MT2,化MT3,化MT4和/或 化MT5基因，所述化MT1，化MT2,化MT3,化MT4和NtMT5基因的cDNA分别为如沈Q ID NO. 1，SEQ ID NO.3，SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.7和沈Q ID NO.9所示的核巧酸序列，或分别为与沈Q ID NO. 1，SEQ ID NO. 3,SEQ ID NO. 5,SEQ ID NO. 7和沈Q ID NO. 9互补配对的核巧酸序列，或 分别为编码沈Q ID NO.2,SEQ ID NO.4,SEQ ID NO.6,SEQ ID NO.8和SEQ ID NO. 10所示烟 草金属硫蛋白的巧酸序列。
[0019] 本发明的另一目的是提供一种调控烟草中重金属儒的耐受性或富集性的方法。
[0020] -种调控烟草中重金属儒的耐受性或富集性的方法，该方法步骤中包括调控烟草 中上述化MT1、化MT2、化MT3、化MT4、和/或NtMT5基因的表达。
[0021 ]本发明的有益效果如下：在本发明中，我们通过对筛选文库获得的五个烟草金属 硫蛋白基因化MT1，化MT2，化MT3，NtMT4和化MT5的进行应用性探索，阐述了该类基因 W下应 用方式：（1)五个烟草金属硫蛋白在烟草体内的表达均具备重金属Cd诱导表达的特征，表明 该类基因具有重金属胁迫应答的基本功能，可将该类基因应用于植物(作物)针对重金属儒 的遗传育种，改良植物(作物)对重金属的耐受性或富集性。（2)五个烟草金属硫蛋白基因在 酿酒酵母中的超量表达能够提高酵母对重金属儒的耐受性，可将该类基因应用于工程菌针 对重金属儒的耐受性遗传育种；（3)五个烟草金属硫蛋白基因在酿酒酵母中的超量表达能 够提高酵母细胞对重金属儒的积累，促进酵母对外界环境中儒的富集。可将该类基因应用 于针对重金属儒污染的微生物修复工程菌的遗传改造。
[0022] 本发明可推广至重金属儒污染的微生物和植物修复领域，通过运用该类基因的转 基因遗传改造，获得重金属儒超富集的微生物或植物。同时，本发明也可延伸至农业生物技 术领域，通过改变烟草金属硫蛋白基因在农作物中的表达，调控农作物对重金属儒的耐受 和富集，W及参与农作物对儒污染环境的适应性改造。本发明还可W通过调控该化MT1、 化脚'2、化脚'3、化脚'4、和/或化脚'5在植物中的表达，获取重金属儒超积累的转基因植物，用 于重金属污染的植物修复工程。
【附图说明】
[0023] 图1示五个烟草金属硫蛋白基因在表达中受到重金属儒、莱莉酸JA和甘露醇的调 控。
[0024] 图2示构建完成的酿酒酵母重组表达载体化]?1'1可￥65260、化]\0'2可￥65260、化]\0'3-PYES260、NtMT4-pYES260 和化 MT5-PYES260示意图。
[00 巧]图 3 示转化化 MT1-PYES260、化 MT2-PYES260、化 MT3-PYES260、化 MT4-PYES260 和 NtMT5-pYES260的转基因酵母Aycfl对儒的耐受性提高，可W在含有0.075mM的CdCl2的固 体培养基上生长。
[00%]图 4 示转化化 MT1-PYES260、化 MT2-PYES260、化 MT3-PYES260、化 MT4-PYES260 和 NtM^-pYESSeO的转基因酵母WT和Δ yen在添加 15μΜ的CdCl2的液体培养基发酵24小时后， 酵母体内的重金属儒含量增加，表明烟草金属硫蛋白基因在酵母中的表达能够影响重金属 儒在酵母细胞内的积累。
【具体实施方式】
[0027] 本发明描述了该类化MT1，NtMT2，NtMT3，NtMT4和NtMT5基因在生物工程方面的应 用。本发明首先阐述了五个烟草金属硫蛋白基因受重金属Cd诱导表达的特征。W生长2周的 烟草SR1幼苗为材料，分别用重金属CcUJA和甘露醇进行胁迫诱导，采用real time RT