烟草根特异启动子NtR2及其在转基因植物上的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及烟草根特异启动子NtR2及其在转基因植物上的应用，属于植物基因工程【技术领域】，本发明利用特异启动子来安全有效的解决烟草生产过程中的根部病虫害。所述烟草根特异启动子，其至少含有SEQIDNo.1所示的核苷酸序列。在pBI121上构建由NtR2::GUS融合基因的植物表达载体，遗传转化本生烟草，通过GUS染色，表明该启动子只在烟草根部表达，而不在烟草的其它器官表达，具有较强的特异性。
【专利说明】烟草根特异启动子NtR2及其在转基因植物上的应用
[0001]【技术领域】
本发明涉及一种烟草根特异启动子NtR2及其在转基因植物上的应用，属于植物基因工程【技术领域】。
[0002]【背景技术】
长期以来烟草根部病害是影响烟草产量和品质的主要病害，如烟草青枯病、根腐病等，烟草青枯病是毁灭性病害，病菌从根部侵入，烟草青枯病是我国南方和长江流域的重要病害，属细菌性病害，主要从根部侵入，很快导致植株枯萎死亡；由于尚无有效的防治药剂，植物青枯病长期以来一直未能解决，对烟草青枯病的防治至今没有特效药可治。
[0003]关于根部特异表达的启动子报道较少。Schneider K等利用T-DAN标签技术分离克隆了可在Arabidopsis根毛表皮细胞中特异表达的核蛋白基因；Xu Y等对编码水稻根部特异表达蛋白的两个cDNA克隆(RCc2和RCc3的特性进行深入分析，发现其编码的蛋白主要在幼根中表达)。目前在烟草上已克隆出一些组织特异性的启动子，如种皮特异性启动子、花药特异启动子TA29等(Fobert, 1994;李国胜等，1995)。Yamamoio等人(1991)报道烟草根特异表达的TobRB7基因的cds片段5’上游ISOObp区段中的片段，具根组织特异表达调控功能，但主要在烟草幼根中表达。
[0004]福建农林大学油料所庄伟建等人(2010)报道烟草根特异启动子NtR12，在烟草根部表达，表达量大大超过对照Pbi 121载体，茎部也微量表达，目前尚未见将烟草组织特异表达启动子应用于转外源目的基因的报道。
[0005]由于烟草是四倍体，遗传背景及其复杂，选育良好的栽培种非常困难，而目前主要栽培的品种经过多年栽培，已经容易产生根部病虫害。植物基因组学与功能基因组学的快速发展，通过分子育种来解决以往常规育种没有办法解决的科学难题已经成为了可能。定向的分子育种首先要考虑到启动子，不同类型的启动子给植物生长也带来不同的影响，随着转基因安全性得到了普遍关注，因此选择有效的启动子成为了当前分子安全育种的热点与难点。
[0006]
【发明内容】
本发明提供了一种烟草根特异启动子NtR2及其在转基因植物上的应用，利用特异启动子来安全有效的解决烟草生产过程中的根部病虫害。
[0007]本发明的烟草根特异启动子，其至少含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
[0008]克隆该烟草根特异启动子的方法，是利用基因芯片进行了烟草各器官RNA差异杂交和表达谱分析，从中又筛选分离了高效根特异表达基因，RT-PCR鉴定特异基因的时空表达，克隆全长基因序列，进而克隆上游特异启动子；所述全长基因序列的核苷酸序列如SEQID N0.2 所示。
[0009]具体地说，是 利用基因芯片进行了烟草各器官RNA差异杂交和表达谱分析，从中又筛选分离了高效根特异表达基因，对筛选得到的根特异表达基因进行鉴定，并克隆得到了全长特异基因，进而克隆特异基因上游的启动子，构建特异启动子驱动GUS基因的植物表达载体，经农杆菌介导将目的启动子导入本生烟草上，对转基因烟草进行GUS组织化学鉴定，确定了烟草启动子的特异性。具体如下:
1、利用基因芯片进行了烟草各器官RNA差异杂交和表达谱分析，从中又筛选分离了高效根特异表达基因；
2、烟草特异启动子NtR2的核苷酸序列如SEQID N0.1所示；
3、构建的植物表达载体为pBim-NtR2::GUS ;所述的pBim- NtR2::GUS指以财似为启动子，GUS为报告基因，Nos为终止子，Kam为筛选转基因阳性植株的植物表达载体；
4、通过农杆菌介导法，获得转基因烟草阳性植株，通过染色，证实了烟草启动子NtRl2的特异性。
[0010]根据上述培育方法，已经成功获得转NtR2:..载体的转基因烟草，通过与35S组合型启动子进行对比鉴定，在根部的表达量高于35S，而在转基因烟草茎部、叶片不表达，证实了烟草NtR2启动子的特异性，为烟草转基因安全育种提供了有利的前景。
[0011]本发明利用基因芯片进行了烟草各器官RNA差异杂交和表达谱分析，从中又筛选分离了高效根特异表达基因，克隆得到烟草根特异启动子财似，并利用特异启动子构建植物表达载体，建立以抗生素为筛选剂的转基因遗传体系，以及快速、高效的转基因检测技术，确定了烟草根部特异启动子的遗传表达，为分子育种烟草抗根部病害品种的培育奠定了良好的技术基础。
[0012]本发明的烟草根部特异启动子在转基因植物上的应用:所述转基因植物的制备方法，包括下述步骤:
(I)将烟草根部特异启动子序列插入表达载体中，构建带该特异启动子驱动功能基因的植物表达载体。
[0013](2)利用所述植物表达载体导入农杆菌，获得转化体。
[0014](3)将所述的转化体转化植物，获得转基因植株。
[0015]通过PLANTCARE分析该烟草根部特异启动子NtR12启动子序列中存在基本的启动子序列TATA-box、GATA-box和CAAT_box。序列的碱基组成含量显示:NtR2启动子AT占64.6%,GC占35.8%。AT丰富序列的低复杂度有利于DNA双链结构的解螺旋，提高基因的转录效率。启动子存在GC盒，因为GC盒一般位于TATA-box和CAAT_box的上游，所以猜测这两个基因启动子序列可能都接近完整的启动子。使用PLANTCARE预测显示，这两个基因启动子都存在根启动子的保守序列盒，这为下一步连入抗病基因，进一步进行烟草转基因鉴定打下坚实的基础。
[0016] 已有报导TobRB7基因启动子是唯一的烟草根特异表达启动子，主要在根端即幼根的伸长区表达，不在整个根系表达和伸长区以后的根部表达，因此不能满足烟草根部病害的转基因分子育种；而本发明得到的NtR2启动子只在烟草根部表达，将NtR2启动子转到PBI121载体上，遗传转化本生烟草，通过⑶S染色，表明该启动子只在烟草根部表达。
[0017]本发明的烟草根特异启动子有以下优点:传统的分子育种所用的启动子为组合型35S启动子，它在植株各组织器官发育的不同阶段均表达，随着转基因安全性受到普遍的关注，组合型35S启动子已经不能满足转基因发展的需要，而且35S组合型启动子容易发生基因沉默；本研究所得到的财似根部特异启动子，在烟草的根部表达量比35S启动子要高，而叶片不表达，烟草是以收获叶片器官的经济作物，叶片上基因不表达，能提高烟草转基因的安全性。[0018]大田烟草种植过程中容易受到许多根病虫害的危害，而给烟草生产和品质造成很到的损失，克隆烟草根特异启动子，通过分子设计育种，能够安全有效的解决烟草种植过程中的根茎病虫害。如图1所示，为烟草特异启动子驱使GUS基因在本生烟草的表达情况。从图中可以看出烟草特异启动子只在烟草根部表达，而不在烟草的其它器官表达，具有较强的特异性。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为烟草特异基因pBim- NtR2::GUS的RT-PCR结果。
[0020]图2为转pBI121 - NtR2:..基因烟草⑶S染色。
[0021]【具体实施方式】
【实施例1】烟叶根与叶片总RNA的提取
将K326原种盘栽，待烟株长至旺长期时，取烟株倒2、倒3、倒5、倒6、倒9叶位的叶片洗净，迅速将叶片以主 脉为界，倒2、倒3叶位的叶片二等分；倒5、倒6叶位的叶片4等分，倒9叶位的叶片取叶片中间部位四等分，各取一份置于液氮中冷冻后置_80°C冰箱中保存。待叶片取样完毕时，迅速将根洗净，取白根置于液氮中冷冻后置_80°C冰箱中保存。取2.5g根(实验组Tester)与叶(驱动组Driver)置于研钵中加液氮研磨,取0.1g倒入预冷的0.5ml异硫氰酸胍变性匀衆液中，充分混匀lmin。加入0.1ml 2mol/L NaAc (pH4.0)混匀Imin ;加入0.5ml水饱和酚，振荡30秒，冰浴5min。加入0.2ml氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡2次3min，冰上放置lOmin。4°C，12000g离心15min。小心移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，振荡2次3min，冰上放置5min。4°C，12000g离心10-15min，移取上层水相，弃去中间和下层有机相。加入等体积异丙醇，放置_20°C 30分种以沉淀RNA。4°C，12000g离心15min收集RNA沉淀，用75%乙醇洗涤沉淀；将RNA沉淀在空气中干燥。用30ul RNase-free ddH20或去离子甲酰胺溶解RNA沉淀。
[0022]【实施例2】利用DNA芯片分离目的基因
利用烟草青枯菌接种处理烟草植株，将受烟草青枯菌处理的烟草植株于3天、6天、9天、12天、15天后取烟草样品，对不同抗感烟草青枯病品种转录出来的所有mRNA标记，与DNA芯片杂交，通过分析杂交位点及信号强弱，可得知在不同时间、不同烟草部位各基因的表达程度。根据表达图谱进行不同条件下基因表达的对比分析，可找到在外部环境、各种细菌侵染时，哪些基因表达发生变化，变化多大，从而分析这些基因在受外部环境下，关键基因发生的生理功能，进而找出该生理功能的相关功能基因。通过分析基因表达，找出只在烟草根部表达量大的基因。相对于其他器官的表达，由于芯片的误差，几乎可以忽略不计。NtR2基因具体表达如表1所示。
[0023]表1基因芯片中NtR2基因在烟草各组织基因表达情况
【权利要求】
1.一种烟草根特异启动子，其至少含有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列。
2.—种含有权利要求1所述的烟草根特异启动子的植物表达载体。
3.如权利要求1所述的 烟草根部特异启动子在转基因植物上的应用。
【文档编号】C12N15/113GK103966218SQ201410203765
【公开日】2014年8月6日 申请日期:2014年5月14日 优先权日:2014年5月14日
【发明者】陈华, 蔡铁城, 巫升鑫, 潘淑芳, 张冲, 陈顺辉, 庄伟建 申请人:福建农林大学