转基因烟草nhx1定性标准样品及其制备、定值方法
【专利摘要】本发明公开一种转基因烟草NHX1定性标准样品及其制备、定值方法，其属于烟草检测用实物标准样品及其制备方法【技术领域】，具体包括转基因烟草NHX1品系的原料选取、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定性检定、定值等过程，其中样品的制备方法包括：将原料粉碎、混匀，经冻干机冷冻干燥后分装、定值、辐照、标识、0-4℃温度条件下贮存的步骤，此外，标准样品的最小取样量、均匀性检验使用相对G-S指数检验法，保证了标准样品的均匀性、稳定性、定值结果等技术指标达到国家标准样品的要求，对积极开展我国转基因产品检测定性标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
【专利说明】转基因烟草NHX1定性标准样品及其制备、定值方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物检测用实物标准样品及其制备方法【技术领域】，具体涉及转基因烟草NHXl定性标准样品及其制备方法。
【背景技术】
[0002]1983年，世界上第一例转基因植物诞生。1984年，英、美、法等国开始以烟草为材料进行转基因研究。Horsh等人首创叶盘转化法，用根癌农杆菌感染烟草叶片外植体，在培养基上获得转基因烟草，开创了用烟草外植体为材料进行转基因的新途径。1986年，美国的Powell-Abel首次将烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因导入烟草并获得抗TMV的转基因烟草植株。从此，烟草转基因研究得到了快速的发展，并取得了很大成就。目前，国际上已报道有45例以上的成功转基因抗病毒烟草，近百例转基因烟草进入大田试验。转基因烟草所用基因有:外壳蛋白基因、反义RNA基因、卫星RNA基因、复制酶基因、运动蛋白基因、抗毒素基因、胰蛋白酶抑制剂基因、几丁质酶基因、神经肽基因、动物干扰素基因、玉米醇溶蛋白基因等。成功的转基因烟草有:抗病毒病烟草；抗真菌、细菌病害烟草；抗除草剂烟草；抗根线虫病烟草；抗烟青虫害烟草；抗蚜虫烟草、单克隆抗体烟草等。首例批准商业化种植的转基因烟草是被欧盟1994年批准的SEITA公司的转bxn基因的抗除草剂溴苯腈烟草。该转基因烟草能抗高出常用浓度16倍的溴苯腈，且其农艺性状、品质、评吸品质又与对照无明显差异。但由于遭到一些国家的反对而未大面积推广种植。1988年，北京大学首次用TMV外壳蛋白基因转成抗TMV的香 料烟品种，并在丹东农科所田间试验。同年，中科院微生物所与河南农科院植保所合作用卫星RNA的互补DNA转化烟草也获得了抗TMV、CMV(黄瓜花叶病毒)的双抗病毒烤烟品种烟草。随后许多单位开展了用不同来源的目的基因向烟草转移的研究。国内曾立项开展烟草转基因研究的有10项之多，涉及受体品种有10多个，涉及的研究单位有20多个。
[0003]然而，人们对转基因食品的安全性问题存在着很多的争论。转基因作物的生态风险、可能带来的环境问题、作为食品对人体健康影响的问题、产品加贴标签问题、运输问题、国际贸易问题、知识产权问题等已引起世界广泛性的关注。转基因产品的安全性问题已由学术观点分歧，发展到知识产权、环境问题、经济问题甚至政治问题。欧盟和一些国家相继出台了转基因产品管理法规，我国于2002年3月开始实施《农业转基因生物安全管理条例》及其三个配套管理办法。2001年，欧盟要求对转基因食品进行标识管理，并提出对非转基因食品只要不是有意污染，允许含有1%的转基因产品(阈值)，而不用标识。日本、韩国、澳大利亚等不同国家的限量阈值不同，从1% -5%不等。
[0004]转基因食品的检测是旨在保护生物和生态安全、维护消费者权益、促进贸易和经济健康发展的法规和政策的基本依据，其标准化将为制订、实施和改进相关法规和政策提供有力保证。国内外转基因食品的检测研究刚刚起步，许多问题都有待解决，标准样品则是该领域尚未解决的重要问题。开展转基因成分检验标准样品的研制在保证测试结果的可比性和溯源性、保障食品安全、解决贸易争端，促进经济发展等方面均具有重要的意义。更为严峻的问题是目前国外仅有转基因大豆粉、转基因玉米粉M0N810等少数几个品种的标准物质，价格非常昂贵，手续繁多，周转时间长，不能适时地满足检验检疫工作的需要；日本正在加紧研制转基因产品检测的分子DNA参考标准物质，用于转基因产品的定量检测；2005年，国内研制成功了转基因大豆粉国家二级标准物质，填补了我国在转基因成分检测标准样品方面的空白，之后研制成功了转基因油菜籽、转基因玉米、转基因棉花籽等标准样品，但转基因烟草标准样品的研制还是空白，并且对于定性标准样品的均匀性评价一直是一个难点，至今未有科学的统计学方法引入，鉴于国内转基因烟草标准样品紧缺和均匀性评价困难的状况，本项标准样品的制备完成，为转基因烟草定性标准样品研究提供了制备技术、均匀性评价和稳定性保证技术，对积极开展我国转基因产品检测定性标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明为了完成本项标准样品的制备工作，辽宁出入境检验检疫局成立了研制工作小组，进行了转基因烟草NHXl品系的原料检测引物确定、原料选取、定性检定、资料查询、标准样品的制备、均匀性和稳定性检查、定值等多项工作，具体的:
[0006]本发明的一方面涉及转基因烟草NHXl定性标准样品，是将转基因检测工作中收集的烤烟叶阳性样品(NHX1品系)原料粉碎、混匀，经冻干机冷冻干燥后分装、定值、最后经fwCJkGy辐照，样品加贴唯一性标识，0-4°C温度条件下贮存。其制备工艺流程见图1，具体的制备步骤包括:
[0007]a.取500g转基因烟草NHXl原料粉碎后过100目标准筛；
[0008]b.将步骤a中获得的转基因烟草粉加水(质量比1:1)混匀后放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥，冷冻速度TC /min，早期冷冻点-rc、15min，冷冻温度_40°C，共熔点_26°C，加热温度20°C 120min制备成混合冻干粉；
[0009]c.将步骤b中获得的混合冻干粉分装于经160°C干热处理2h的洁净的7mL棕色玻璃瓶中封盖密封，每瓶内装混合冻干粉样品lg，再将分装好的样品经fwCJkGy辐照Ih后，放置于干燥处O~4°C贮存；
[0010]d.使用相对G-S指数检验法检验步骤c中获得的样品的均匀性。
[0011]本发明上述技术方案中，所述的使用相对G-S指数检验法检验步骤d中获得的样品的均匀性是指利用G-S指数法统计评价样品的均匀性。此为本申请的创新之处，在现有的技术文献中未见报道，其相比传统方法有显著的进步，有益之处体现在将G-S指数法引入定性标准样品的均匀性评价，使定性标准样品的均匀性评价更具科学性，可靠性；
[0012]相对Gin1-Simpson指数检验法:对于定性属性值仅能取“是”、“否”两个值等的二态属性情况，采用Gin1-Simpson指数计算物品间的定性属性值分散程度以及在均匀分布时属性值的分散程度，两个指数的比值可表示相对分散程度，即相对均匀度。由于一般使用不均匀程度来表示均匀性，因此，用I减去相对均匀度得到不均匀度。
[0013]有时，标准样品在当前水平下的不均匀性可能并不能被现有测量方法检出，例如，所有测量结果均为“阳性”，这时，将标准样品稀释或缩小子样量直至出现二态属性两个值的出现概率均不为I (在部分测量领域所谓的“Cutoff”值附近)的范围，在该范围内采用相对Gin1-Simpson指数评估其不均匀性，然后根据不均匀度与水平之间的关系得到标准样品的不均匀度。很多情况下，被稀释的标准样品的不均匀度与标准样品的不均匀度的比值约为稀释比的平方根倍。
[0014]计算方式为:
[0015]对m个样品中的每个进行η次测量，使用“ I ”和“O”分别表示待测属性“存在”和“不存在”的情况，设第i个能力验证物品取得结果“I”的比例为Pi，按下式计算Gin1-Simpson指数(缩写为GS指数):
[0016]
【权利要求】
1.一种转基因烟草NHXl定性标准样品，其特征在于，制备步骤包括: a.取转基因烟草NHXl原料粉碎后过100目标准筛； b.将步骤a中获得的转基因烟草粉加水，以质量比1:1混匀后放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥，冷冻速度1°C /min，早期冷冻点_rC、15min，冷冻温度-40°C，共熔点_26°C，加热温度20°C、120min制备成混合冻干粉； c.将步骤b中获得的混合冻干粉分装于经160°C干热处理2h的洁净的棕色玻璃瓶中封盖密封，再将 分装好的样品经fwCJkGy辐照Ih后，于干燥处O~4°C贮存； d.使用相对G-S指数检验法检验步骤c中获得的样品的均匀性。
2.—种转基因烟草NHXl检测试剂盒，其特征在于，包括检测引物:SEQ ID N0.1~4和权利要求1所述的NHXl标准样品。
【文档编号】C12Q1/68GK103937906SQ201410198606
【公开日】2014年7月23日 申请日期:2014年5月12日 优先权日:2014年5月12日
【发明者】蒋丹, 曹际娟, 刘冉, 徐伟 申请人:蒋丹, 曹际娟, 刘冉, 徐伟