Ablim3基因作为食管癌诊治标志物的用图
【专利摘要】本发明公开了一种用于食管癌早期诊断的分子标志物?ABLIM3基因及其表达产物。本发明利用QPCR和Western blot方法证明ABLIM3基因在食管癌组织和正常食管组织中存在差异表达，可以作为早期诊断食管癌的指标。另外，本发明还公开了ABLIM3基因及其表达产物可以作为食管癌治疗的靶标，用于指导新药的研发。
【专利说明】
ABLIM3基因作为食管癌诊治标志物的用途
技术领域
[0001] 本发明设及生物技术领域，具体地设及ABLIM3基因在食管癌的诊断、治疗中的用 途。
【背景技术】
[0002] 食管癌是我国常见的恶性消化道肿瘤，在各种癌症死亡率中居第6位。国际症研究 署发布的2008年世界癌症发病与死亡报告(Globocan 2008)报道，中国食管癌发病25.92万 例，全球食管癌发病48.16万例，占全球百分比超过一半高达53.82 %，同期全球死亡40.65 万例，中国21.11万例，占51.92%。且随着生活水平提高与生活方式改变有逐年上涨的趋 势。因此，对食管癌早期发现早期诊治方面的研究，特别是实验研究应成为科研工作者义不 容辞的一项任务。食管癌与其他恶性肿瘤一样，是在内、外因素共同影响下发生的多基因表 达调控失调的一种个体化疾病。传统治疗方法W手术为主，放、化疗为辅，尽管目前多种治 疗技术的改进，总体5年生存率仍然很低，尤其对于晚期食管癌效果不甚理想。食管癌的早 期发现和治疗，将会大大提高患者的生存机率。因此寻找一种早期诊断食管癌的方法是亟 待解决的事情。
【发明内容】
[0003] 为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种可用于食管癌早期诊断的 分子标志物。使用基因标志物来诊断食管癌具有及时性、特异性和灵敏性，从而使患者在疾 病早期就能知晓疾病风险，针对风险高低，采取相应的预防和治疗措施。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 本发明提供了检测ABLIM3基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。
[0006] 进一步，所述检测ABLIM3基因表达的产品包括检测ABLIM3基因 mRNA水平的产品、 和/或检测ABLIM3蛋白水平的产品。
[0007] 进一步，所述检测ABLIM3基因表达的产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、免疫检 、原位杂交或忍片检测ABLIM3基因及其表达产物的表达水平W诊断食管癌的产品。
[000引进一步，所述用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增ABLIM3基因的引 物;所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特异扩增ABLIM3基因的引物;所述 用免疫检测诊断食管癌的产品包括:与ABLIM3蛋白特异性结合的抗体;所述用原位杂交诊 断食管癌的产品包括:与ABLIM3基因的核酸序列杂交的探针;所述用忍片诊断食管癌的产 品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括与ABLIM3蛋白特异性结合的抗体，基因 忍片包括与ABLIM3基因的核酸序列杂交的探针。
[0009] 所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括的一对特异扩增ABLIM3基因的引 物如沈Q ID NO.3和沈Q ID NO.4所示。
[0010] 所述检测ABLIM3基因表达的产品可W是检测ABLIM3基因表达的试剂、也可W是包 含所述试剂的试剂盒、忍片、试纸等，也可W是使用所述试剂的高通量测序平台。
[0011] 所述诊断食管癌的工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台；高 通量测序平台是一种特殊的诊断食管癌的工具，随着高通量测序技术的发展，对一个人的 基因表达谱的构建将成为十分便捷的工作。通过对比疾病患者和正常人群的基因表达谱， 容易分析出哪个基因的异常与疾病相关。因此，在高通量测序中获知ABLIM3基因的异常与 食管癌相关也属于ABLIM3基因的用途，同样在本发明的保护范围之内。
[0012] 本发明还提供了一种诊断食管癌的工具，所述工具包括检测ABLIM3基因表达的试 剂;所述试剂包括检测ABLIM3基因 mRNA的引物和/或探针、检测ABLIM3蛋白的抗体。
[0013] 所述工具包括但不限于忍片、试剂盒、试纸、或高通量测序平台。
[0014] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白质忍片;所述基因忍片包括固相载体W及固定 在固相载体的寡核巧酸探针，所述寡核巧酸探针包括用于检测ABLIM3基因转录水平的针对 ABLIM3基因的寡核巧酸探针;所述蛋白质忍片包括固相载体W及固定在固相载体的ABLIM3 蛋白的特异性抗体;所述基因忍片可用于检测包括ABLIM3基因在内的多个基因（例如，与食 管癌相关的多个基因）的表达水平。所述蛋白质忍片可用于检测包括ABLIM3蛋白在内的多 个蛋白质(例如与食管癌相关的多个蛋白质）的表达水平。通过将多个与食管癌的标志物同 时检测，可大大提高食管癌诊断的准确率。
[001引其中，所述试剂盒包括基因检测试剂盒和蛋白免疫检测试剂盒;所述基因检测试 剂盒包括用于检测ABLIM3基因转录水平的试剂;所述蛋白免疫检测试剂盒包括ABLIM3蛋白 的特异性抗体。进一步，所述试剂包括使用RT-PCR、实时定量PCR、免疫检测、原位杂交或忍 片方法检测ABLIM3基因表达水平过程中所需的试剂。优选度，所述试剂包括针对ABLIM3基 因的引物和/或探针。根据ABLIM3基因的核巧酸序列信息容易设计出可W用于检测ABLIM3 基因表达水平的引物和探针。
[0016] 所述试纸包括检测ABLIM3基因表达的试剂。
[0017] 所述高通量测序平台包括检测ABLIM3基因表达的试剂。
[001引与ABLIM3基因的核酸序列杂交的探针可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合体、PNA或其它 衍生物。所述探针的长度没有限制，只要完成特异性杂交、与目的核巧酸序列特异性结合， 任何长度都可W。所述探针的长度可短至25、20、15、13或10个碱基长度。同样，所述探针的 长度可长至60、80、100、150、300个碱基对或更长，甚至整个基因。由于不同的探针长度对杂 交效率、信号特异性有不同的影响，所述探针的长度通常至少是14个碱基对，最长一般不超 过30个碱基对，与目的核巧酸序列互补的长度W15-25个碱基对最佳。所述探针自身互补序 列最好少于4个碱基对，W免影响杂交效率。
[0019]进一步，所述AMJM3蛋白的特异性抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体。所述AMJM3 蛋白的特异性抗体包括完整的抗体分子、抗体的任何片段或修饰(例如，，嵌合抗体、scFv、 化6、尸(曰6'）2、尸乂等。只要所述片段能够保留与48^13蛋白的结合能力即可。用于蛋白质水 平的抗体的制备时本领域技术人员公知的，并且本发明可W使用任何方法来制备所述抗 体。
[0020] 在本发明的具体实施方案中，所述检测ABLIM3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3 和SEQ ID NO.4所示的引物对。
[0021] 本发明还提供了 ABLIM3基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗食管癌的药物 中的应用。
[0022] 所述促进剂包括促进ABLIM3基因表达的试剂和促进ABLIM3基因表达产物的试剂； 所述促进ABLIM3基因表达的试剂包括促进基因转录的试剂、促进基因翻译的试剂、促进 ABLIM3蛋白含量的试剂;所述促进ABLIM3基因表达产物的试剂包括促进A化IM3基因表达产 物稳定性的试剂、促进ABLIM3基因表达产物活性的试剂、促进ABLIM3基因表达产物功能的 试剂。
[0023] 具体地，所述促进ABLIM3基因表达的试剂包括：含有ABLIM3基因的试剂、携带 ABLIM3基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有ABLIM3蛋白质的试剂。
[0024] 本发明的促进剂一方面可W用于补充内源性的ABLIM3蛋白的缺失或不足，通过提 局ABLIM3蛋白的表达，从而治疗因 ABLIM3蛋白缺之导致的食管癌。另一方面可W用于促进 ABLIM3蛋白的活性或者功能，从而治疗食管癌。
[0025] 本发明所述携带基因的载体是本领域已知的各种载体，如市售的载体、包括质粒、 粘粒、隧菌体、病毒等。
[0026] 在本发明中，术语"宿主细胞"包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的 例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物 细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如C册细胞、COS细胞等。
[0027] 本发明还提供了一种用于治疗食管癌的药物组合物，所述药物组合物包括上面所 述的ABLIM3基因和/或其表达产物的促进剂。
[0028] 进一步，本发明的药物还包括药学上可接受的载体，载体，运类载体包括(但并不 限于）：稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、薦糖等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙締化咯烧酬;湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸巧和碳酸氨钢;吸收促进剂季锭 化合物;表面活性剂如十六烧醇;吸附载体如高岭±和皂粘±;润滑剂如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0029] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可W分为体外或者体内的方式。体外方式 包括将含有ABLIM3基因的药物或者含有ABLIM3蛋白质的药物导入细胞中，再将细胞移植或 回输到体内。体内方式包括直接将含有ABLIM3基因的药物或者含有ABLIM3蛋白质的药物注 入体内组织中。
[0030] 本发明的药物还可与其他治疗食管癌的药物联用，多种药物联合使用可W大大提 到治疗的成功率。
[0031] 在本发明的上下文中/'ABLIM3基卸'包括ABLIM3基因 W及ABLIM3基因的任何功能 等同物的多核巧酸。A化IM3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中ABLIM3基 因（NC_000005.10)DNA序列具有70%W上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0032] 优选地，ABLIM3基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子：
[0033] (1)序列表中沈Q ID NO. 1所示的DNA序列；
[0034] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0035] (3)与（1)或(2)限定的DNA序列具有70%、优选地，90% W上同源性，且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0036] 在本发明的具体实施方案中，所述ABLIM3基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的 DNA序列。
[0037] 在本发明的上下文中，A化IM3基因表达产物包括ABLIM3蛋白W及ABLIM3蛋白的部 分肤。所述ABLIM3蛋白的部分肤含有与食管癌相关的功能域。
[003引 "A化IM3蛋白"包括ABLIM3蛋白W及ABLIM3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同 物包括ABLIM3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，等位变异体、天然 突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与ABLIM3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0039] 优选地，ABLIM3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质：
[0040] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0041] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个，较佳地1-30 个，更佳地1-20个，最佳地1-10个。
[0042] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性）， 更优选地，与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性，常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肤。
[0043] 在本发明的具体实施方案中，所述ABLIM3蛋白是具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸 序列的蛋白质。
[0044] 通常，已知的是，一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰，其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0045] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是ABLIM3蛋白的融 合蛋白。对于与ABLIM3蛋白融合的肤或者蛋白质没有限制，只要所得的融合蛋白保留 ABLIM3蛋白的生物学活性即可。
[0046] 本发明的ABLIM3蛋白也包括对SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的非保守修饰，只 要经过修饰的蛋白质仍然能够保留ABLIM3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突 变的氨基酸数目通常是10个或者更少，例如6个或者更少，例如3个或者更少。
[0047] 在本发明的上下文中，"诊断食管癌"既包括判断受试者是否已经患有食管癌、也 包括判断受试者是否存在患有食管癌的风险。
[0048] 在本发明的上下文中，"治疗食管癌"从疾病的状态变化来分，可W包括疾病的缓 解、疾病的完全治愈，还包括对于疾病治疗效果的评价。
[0049] 本发明的优点和有益效果：
[0050] 本发明首次发现了 ABLIM3基因表达与食管癌相关，通过检测受试者食管组织中 ABLIM3的表达，可W判断受试者是否患有食管癌、或者判断受试者是否存在患有食管癌的 风险，从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0051] 本发明发现了一种新的分子标记物-A化IM3基因，相比传统的检测手段，基因诊断 更及时、更特异、更灵敏，能够实现食管癌的早期诊断。
【附图说明】
[0052] 图1显示利用QPCR检测ABLIM3基因在食管癌组织和正常食管组织中的表达情况； [0化3] 图2显示利用Western blot检测ABLIM3蛋白在食管癌组织和正常食管组织中的表 达情况；
[0054]图3显示利用QPCR在转录水平上检测ABLIM3基因的过表达情况；
[0化5] 图4显示利用Western blot检测ABLIM3蛋白的过表达情况；
[0056] 图5显示利用MTT实验检测ABLIM3基因表达对食管癌细胞增殖的影响。
[0057] 具体的实施方式
[0058] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York = Cold Spring化rborLaboratoiy Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0化9] 实施例1正常食管组织和食管癌组织中ABLIM3基因的表达差异 [0060] 1、实验材料；
[0061 ]食管癌组织为医院胸外科手术切除的标本，正常组织为胃镜室镜下取出的标本， 手术切除的食管肿瘤组织离体后立即取材，取材时均佩戴一次性无菌手套，应用高压灭菌 的手术刀片切取。
[0062] 所有病例均经病理确诊。包括食管癌组织40例，正常食管组织30例。其中食管鱗癌 34例，食管腺癌6例。W正常食管组织作为对照组。所有患者术前均病理证实，术前均未行放 疗、化疗等治疗，且无其他部位的肿瘤等。所有组织均在手术半小时内液氮保存后，移入-80 度冰箱冻存。
[0063] 2、在转录水平上检测ABLIM3基因的差异表达
[0064] 2.1组织RNA的提取(利用No巧en RNA提取试剂盒）
[0065] 1)在较少RNase干扰的清洁区，使用含适量液氮的研鉢称取离体组织样本约20mg， 用巧棒研磨至粉末状；
[0066] 2)将样本转移到一个不含RNA酶的2mL的离屯、管中；
[0067] 3)加入300化Lysis solution,置于匀浆器内，充分研磨l-5min;
[0068] 4)12000旨，4°(：，离屯、10111111，转移上清至新的1.51111的离屯、管中；
[0069] 5)加入60化1 RNase-Free Water,用縱满器混匀；
[0070] 6)加入蛋白酶K，在55°C溫浴15min，不断满旋混匀；
[0071] 7)14000g，室溫，离屯、Imin,使细胞碎片沉淀于离屯、管底部，取上清转移到另外一 个不含RNA酶1.5mL的离屯、管中；
[0072] 8)加入45化1的95%乙醇，满旋混匀；
[0073] RNA吸附：
[0074] 9)取65化1含乙醇的裂解液加到离屯、柱中，14000g离屯、Imin;
[0075] 10)弃下层，重置收集管于柱上；
[0076] 11)依照裂解液的容量，重复9)~10)步；
[0077] 12)加入40化1 Wash solution,HOOOg离屯、2min;
[0078] 13)弃下层，将柱置于一新的收集管上；
[0079] DNase 处理：
[0080] 14)加入lOOul Enzyme Incubation Buffer和ISul DNase I，HOOOg离屯、Imin;
[0081 ] 15)将收集管中的溶液重新移入柱中；
[0082] 16)室溫放置 15min;
[0083] RNA 洗涂：
[0084] 17)加入400]il Wash solution, 14000g离屯、Imin，弃下层，重置收集管于柱上；
[00化]18)加入40化1 Wash solution,HOOOg离屯、2min，弃收集管；
[0086] RNA 洗脱：
[0087] 19)把柱子放入 1.7mL Elution管中；
[0088] 20)加入30iU Elution Buffer;
[0089] 21)200g离屯、2min，使溶液充分与柱结合，然后HOOOg离屯、Imin。
[0090] 2.2逆转录
[0091 ] 利用TAKARA公司的逆转录试剂盒进行RNA的逆转录。
[0092] 2.3 QPCR
[0093] (1)引物设计
[0094] 根据Genbank中ABLIM3基因和GAPDH基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海生 工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0095] ABLIM3 基因：
[0096] 正向引物为5'-GTATATCAGCAAGGATGGT-3'（SEQ ID N0.3);
[0097] 反向引物为5'-GGTCACAAGTCTCACATT-3'（沈Q ID N0.4),
[009引 GATOH基因：
[0099] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.5);
[0100] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（沈Q ID N0.6)。
[0101] (2)按照表1配制PCR反应体系：
[0102] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0103] 表1 PCR反应体系
[0104]
[0105]
[0106] (3 )PCR反应条件：95°C IOmin，（95°C 15s，60°C40s)*45个循环。WSYBR Green作为 巧光标记物，在Li曲t切cler巧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，A A CT法进行相对定量。
[0107] 2.4统计学方法
[0108] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时 具有统计学意义。
[0109] 2.5 结果
[0110] 结果如图1所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中ABLIM3基因的mRNA水平显著 降低，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0111] 3、在蛋白水平上检测ABLIM3基因的差异表达
[0112] 3.1提取组织总蛋白
[0113] 按照化i如化组织/细胞总蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋白提取的操作。
[0114] 3.2 Western blot检测
[0115] 将提取的蛋白定量进行SDS-PAGE电泳，之后进行转膜、封闭、一抗解育、二抗解育、 显色。
[0116] 3.3统计学处理
[0117] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，We-actin为内参，将目的白条 带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[011引 3.4结果
[0119] 结果如图2所示，与正常食管组织相比，食管癌组织中ABLIM3蛋白含量降低，差异 具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0120] 实施例2 ABLIM3基因表达质粒构建
[0121] UABLIM3基因表达载体的构建
[0122] 根据ABLIM3基因的编码序列（如SEQ ID NO. 1所示)设计扩增引物。从成人胎脑的 cDNA文库klontech公司，货号：638831)中扩增全长的ABLIM3基因的编码序列，将上述cDNA 序列插入真核细胞表达载体PCDNA3.1中，连接获得的重组载体PCDNA3.1-A化IM3用于后续 实验。
[0123] 2、食管癌细胞的培养与转染
[0124] 2.1细胞培养
[0125] 食管癌细胞系ECA109接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中、将其放置于37 °C、5 % CO播养箱内培养，待细胞达80 %融合时，用0.化％膜蛋白酶消化传代。
[0126] 2.2细胞转染
[0127] 将食管癌细胞按1 X 10^孔接种到24孔细胞培养板中，在37°C、5%C02培养箱中细 胞培养24h，转染按照脂质体转染试剂2000(购自于Invitrogen公司）的说明书转染，实实验 分为对照组(转染PCDNA3.1)和实验组(转染PCDNA3.1-AMJM3)，转染质粒的工作浓度是0.5 μg/mlO
[012引3、利用QPCR实验检测质粒转染的效果。
[0129] 3.1提取细胞总RNA利用常规方法进行操作。
[0130] 3.2逆转录
[0131] 步骤同实施例1。
[0132] 3.3 QPCR
[0133] 步骤同实施例1。
[0134] 3.4统计学方法
[0135] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0136] 4、Weste;rn 检测
[0137] 具体步骤同实施例1。
[013引5、结果
[0139] 如图3所示，与转染PCDNA3.1空载体的细胞相比，转染PCDNA3.1-A化IM3的细胞中 ABLIM3的mRNA水平显著上调，差异具有统计学意义(P<0.05);如图4所示，与转染PCDNA3.1 空载体的细胞相比，转染PCDNA3.1-ABLIM3的细胞中ABLIM3的蛋白水平显著上调，差异具有 统计学意义(P<〇.〇5)。
[0140] 实施例3 ABLIM3基因对食管癌细胞增殖的影响
[0141 ]采用MlT实验检测ABLIM3基因对食管癌细胞增殖能力影响。
[0142] 1、步骤:各组细胞转染12h后膜酶消化，制成单细胞悬液，W每孔6000个细胞接种 于96孔培养板中，每组分3个时间点，每个时间点设6个复孔。细胞贴壁后，进行第1次检测： 每孔加入5g/L的MTT液，继续培养地后，吸去培养基，加入DMSO 15化1，细屯、吹打，使紫 蓝色沉淀充分溶解，用酶标仪在490nm波长测吸光度值(A值）。然后每24h检测1次，连续测 7化，共3次。
[0143] 2、统计学方法
[0144] 实验都是按照重复3次来完成的，采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组 之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统计学意义。
[0145] 3、结果
[0146] 图5所示的结果显示：转染PCDNA3.1-A化IM3组的细胞生长速度明显低于转染 PCDNA3.1空载体组的细胞生长速度，差异具有统计学意义(P<0.05)上述结果表明ABLIM3表 达能够抑制食管癌细胞的生长。
[0147] 实施例4 ABLIM3基因对食管癌细胞周期的影响
[0148] 使用流式细胞仪检测细胞周期，在此过程中使用的PI单染试剂购自美国BD公司产 品。
[0149] 1、步骤:各组细胞转染4她后膜酶消化，制成单细胞悬液，PBS洗涂2次，70 %的乙醇 固定过夜。按操作说明加相应试剂，避光放置30min，流式细胞仪检测各组细胞周期。
[0150] 2、统计学方法
[0151] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具 有统计学意义。
[0152] 3、结果
[0153] 如表2中显示的结果，与转染PCDNA3.1空载体组细胞相比，转染PCDNA3.1-A化IM3 组细胞处于Gl期的细胞明显增多，处于S期的细胞明显减少。上述结果表明，A化IM3基因表 达能够抑制细胞周期。
[0154]表2细胞转染后细胞周期变化(百分比） rmssi
L0156」 注：与转染PCDNA3.1空载体组相比，冲<0.05。
[0157]上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核屯、思想。应当指出，对于本 领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可W对本发明进行若干改进 和修饰，运些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
【主权项】
1. 检测ABUM3基因表达的产品在制备诊断食管癌的工具中的应用。2. 根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括:通过RT-PCR、实时定量PCR、 免疫检测、原位杂交芯片或高通量测序平台检测ABUM3基因表达以诊断食管癌的产品。3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述用RT-PCR诊断食管癌的产品至少包括 一对特异扩增ABUM3基因的引物;所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至少包括一对特 异扩增ABUM3基因的引物;所述用免疫检测诊断食管癌的产品包括:与ABUM3蛋白特异性 结合的抗体;所述用原位杂交诊断食管癌的产品包括:与ABUM3基因的核酸序列杂交的探 针；所述用芯片诊断食管癌的产品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括与 ABUM3蛋白特异性结合的抗体，基因芯片包括与ABUM3基因的核酸序列杂交的探针。4. 根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述用实时定量PCR诊断食管癌的产品至 少包括的一对特异扩增ABUM3基因的引物如SEQIDN0.3和SEQIDN0.4所示。5. -种诊断食管癌的工具，其特征在于，所述工具包括检测ABUM3基因表达的试剂;所 述试剂包括检测ABUM3基因 mRNA的引物和/或探针、检测ABUM3蛋白的抗体。6. 根据权利要求5所述的工具，其特征在于，所述检测ABUM3基因 mRNA的引物包括SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物对。 7. ABUM3基因和/或其表达产物的促进剂在制备治疗食管癌的药物中的应用。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进ABLIM3基因表达的试剂、促进 ABUM3基因表达产物稳定性的试剂、促进ABUM3基因表达产物活性的试剂、促进ABUM3基 因表达产物功能的试剂。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，促进ABLIM3基因表达的试剂包括含有 ABUM3基因的试剂、携带ABUM3基因的载体或宿主细胞所形成的试剂、含有ABUM3蛋白质 的试剂。10. -种用于治疗食管癌的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括7-9中任一 项所述的促进剂。
【文档编号】A61K45/00GK105861740SQ201610472155
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年6月24日
【发明人】田子强, 温士旺, 李振华, 徐延昭
【申请人】河北医科大学第四医院