烟胺合成酶基因的用途和通过转基因植物提高植物耐逆性的方法

专利名称：：烟胺合成酶基因的用途和通过转基因植物提高植物耐逆性的方法
技术领域：
：本发明涉及烟胺合成酶基因的用途和一种利用转基因植物提高植物耐逆性(抗旱或耐盐等)的方法。
背景技术：
：目前，干旱、盐碱成为公认的全球化环境问题，据统计，全球干旱、半干旱地区约占土地总面积的36％，占耕地面积的43％，而土壤干旱又常常伴随着盐渍化。在我国盐渍化土地占耕地面积的20％。造成缺水胁迫的环境因子，如干旱、高盐和极端的温度是严重影响栽培植物生长发育的非生物胁迫因素，并且是限制植物生产力的主要因子。为了应付日益膨胀的人口和日益恶化的环境，需要培育出更多耐受胁迫的作物。由于植物的胁迫耐性大多属于数量性状，用传统育种技术和用标记物辅助进行筛选的方法来改良植物的胁迫耐性费时、费力、困难大。自从1984年首次获得转基因烟草以来，植物转基因技术在植物改良方面日益得到广泛的应用，已有200多种植物相继转化。运用基因工程技术，极大缩短育种年限，加快育种进程；更为重要的是基因转化打破了物种间基因交流的界限，将不同来源的基因(包括不同植物、动物、微生物、真菌等)导入现存的优良植物品种中，获得更理想性状的品种。而通过基因工程方法直接导入外源抗性基因具有所需周期短，目的性强等优点。通过与传统育种技术共同作用将大大加快植物优良性状新品种的培育。但由于逆境胁迫响应在遗传上和生理上表现出很强的复杂性，人们对逆境胁迫的耐受机制如逆境信息的感知、传递以及代谢途径的变化等认识还远远不够，限制了基因工程技术的应用。随着分子生物学的发展，人们能够从基因组成、表达调控及信号传导等方面来认识植物逆境胁迫耐受性机理。并且已经克隆到来自微生物、植物等有机体的编码生化代谢关键酶基因和在逆境胁迫信号传导过程中起重要作用的基因，采用重组DNA和转基因技术向作物中导入这些外源基因已成为提高植物耐胁迫性的新途径。尽管植物本身具有防御逆境胁迫的能力，但是植物间对非生物胁迫的耐受性差别很大，特别是一些栽培植物，耐逆境胁迫能力较低。现在改良植物胁迫耐性更为迅速和有效的策略是转移编码生化途径的关键酶或参与信号传导途径的一个或几个基因。目前，应用于植物胁迫改良的外源目的基因包括编码催化渗透调节产物合成的酶、膜修饰酶、活性氧解除酶、胁迫诱导蛋白等基因。铁元素是影响植物生长发育的限制营养元素。铁参与植物的光合作用、呼吸作用、生物固氮及DNA合成复制等许多重要的生物过程(Welch，1995)。缺乏铁元素则会影响植物体内叶绿素和豆血红素的生物合成，使得植物出现缺绿症。pH极高的盐碱土严重影响农业生产，其中，铁在盐碱土中的溶解性极低，更不易被植物吸收利用，因而生长在高pH土壤环境中的植物易发生严重的缺绿症。研究发现植物对铁元素的缺乏与体内烟胺(Nicotianamine，NA)含量的不足有很大关系。NA是Fe2+、Cu2+、Zn2+.Mn2+等离子在木质部和韧皮部运输过程中形成稳定态所必需的螯合物，参与这些离子运输。NA与Fe2+形成的复合物比与Fe3+形成的复合物更加稳定，这样更能保持Fe2+的稳定。VonWiren(1999)还发现NA能保护细胞，防止氧化破坏。因此参与NA合成的烟胺合成酶基因(nicotianaminesynthase，NAS)的作用显得十分重要。目前研究人员已从许多植物体内克隆出NAS基因，如大麦中克隆的NAS基因(accessionNo.AF136941，AF136942，AB011264，AB011266，AB011268，AB011269，AB019525，AB010086，AB011267)，水稻中克隆的NAS基因(accessionNo.BE607438，AB046401，AB023819，AB023818，AB021746)，大豆(accessionNo.BM892247)，玉米中的NAS基因(accessionNo.AB042551，BU493605)，拟南介中克隆的NAS基因(accessionNo.AB021936，AB021935，AB021934，BE845347AY072364，AY140031)，西红柿中克隆的NAS基因(accessionNo.BG791292)等，并发现NAS基因的表达受缺铁条件诱导(Higuchi，2001；Ling等，1999；Suzuki等，2001)。由于NAS表达受缺铁条件诱导，且NAS的表达能有利于提高植物耐缺铁环境，研究人员试图将NAS基因导入植物体内，以期增加缺铁环境中植物的抗性，提高植物的生长发育。目前还未见到转NAS基因具有提高植物耐逆(耐干旱及盐碱)的报道。我们以黑麦草为转化受体，首次将NAS基因导入植物体，发现转基因植物的耐逆能力尤其是耐旱及耐盐性能具有较大提高。发明目的本发明的一个目的是提供一种烟胺合成酶(nicotianaminesynthase)基因的用途。本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐逆性的方法。技术方案因而，本发明提供了一种烟胺合成酶基因在提高植物耐逆性中的用途。本发明提供了一种利用转基因植物提高植物耐逆性的方法，包括以下步骤(a)构建一种DNA片段，使其包含一种由组成性或组织特异性或诱导表达启动子控制的烟胺合成酶基因；(b)用所构建的DNA片段或含有上述DNA片段的质粒转化植物细胞；(c)筛选出被转化的植物细胞；(d)使被转化的植物细胞再生出完整植株；在将转化的植物细胞再生出完整植株后，可对转基因植株的进行扩繁，并使转基因植物的耐逆性(耐旱或耐盐碱)的进一步改善和提高。所述的转化植物的扩繁包括无性繁殖和种子繁殖或两者之组合。所述的耐逆性提高包括抗旱或耐盐、耐低温、抗病虫害等性能的改善和提高。在本发明的方法中，所述的组成性表达启动子可以是CaMV35S，玉米Ubiquitin，水稻actinl启动子等；所述的组织特异性表达启动子可以是根特异性表达启动子、叶片特异性表达启动子或维管特异性表达启动子。在本发明的方法中，所述的DNA片段指含有由组成性或组织特异性表达或诱导表达(ABA、干旱、盐碱或化学诱导等)启动子控制的烟胺合成酶基因的DNA分子；也可是人工合成的DNA片段。也可在包括在用于根瘤农杆菌或发根农杆菌转化植物的双元载体质粒如pBin19，pCambia，pBI101等和可在原核生物中繁殖的其他质粒如pUC，pBluescript，PCR载体质粒中。这些质粒以及使用这些质粒的构建方法可通过现有技术中已知的方法进行。所述的烟胺合成酶基因可以是来源于不同生物(包括植物或非植物)。可以是任何一种现有技术中已知的烟胺合成酶基因，例如如大麦中克隆的NAS基因(accessionNo.AF136941，AF136942，AB011264，AB011266，AB011268，AB011269，AB019525，AB010086，AB011267)，水稻中克降的NAS基因(accessionNo.BE607438，AB046401，AB023819，AB023818，AB021746)，大豆(accessionNo.BM892247)玉米中的NAS基因(accessionNo.AB042551，BU493605)、拟南介中克降的NAS基因(accessionNo.AB021936，AB021935，AB021934，BE845347AY072364，AY140031)，西红柿中克隆的NAS基因(accessionNo.BG791292)等(Higuchi，2001；Ling等，1999；Suzuki等，2001)。在上述方法的步骤(a)中所构建的DNA片段还可以另外包括一种植物筛选标记基因。所述的植物筛选标记基因可以是抗生素筛选标记基因，如抗卡那霉素筛选标记基因新霉素磷酸转移酶(NPTII)，抗潮霉素筛选标记基因潮霉素磷酸转移酶(hpt)；或非抗生素筛选标记基因如木糖异构酶等。所述的控制烟胺合成酶基因(nicotianaminesynthase)的诱导系统可以是酒精可诱导系统(alc)，糖甾醇可诱导系统，四环素可诱导系统(tet)，乳糖可诱导系统(lac)，铜离子可诱导系统，及植物内源诱导系统如热激(heatshock)，除草剂(safener)，损伤诱导系统等。本发明的方法中，所述的植物细胞指来源于如牧草、草坪草、杨树、桉树、水稻、小麦、玉米、油菜、棉花、大豆等所有植物的细胞、组织或植株。细胞或植物的转化指通过原生质体-化学介导法(Ca2+，PEG)，基因枪介导法，农杆菌介导法，电激法，花粉管导入，微注射等任何一种方法或几种方法的组合。本发明的方法中，所述的转化细胞(或植物愈伤组织，植株)指利用上述转化方法将烟胺合成酶基因导入并通过分子手段证明是阳性的植物。本发明的方法中，所述的转化细胞(或植物愈伤组织，植株)的筛选指利用抗生素或其他筛选标记基因，如含新霉素磷酸转移酶(NPTII)基因的细胞或愈伤组织可由卡那霉素或其替衍生代物如G418等进行筛选；含潮霉素磷酸转移酶基因的细胞或愈伤组织可由潮霉素进行筛选等。在获得抗性愈伤组织细胞后可采用Southern或PCR法，点杂交等分子检测手段对其进行检测，以确定其含有烟胺合成酶基因。本发明的方法中，使被转化的植物细胞再生出完整植株主要指通过离体由包含有上述DNA元件的转化细胞再生的植株，也包括非离体的其他营养繁殖方法再生的植株。附图简要说明图1用于耐受胁迫转化质粒的构建。CaMV35S启动子控制下的烟胺合成酶基因(nicotianaminesynthase，NAS)质粒。卡那霉素抗性基因(NPTII)由NOS启动子调控。LB-leftborder；RB-rightborder.图2几种黑麦草的组培再生试管苗。(a)、卓越；(b)、凯；(c)、百盛。图3黑麦草遗传转化过程。依次为胚性愈伤组织的培养(a)、愈伤组织转化后的抗性筛选(b)、分化出苗(c)、生根培养(d)、壮苗生长(e)等几个关键过程。图4转NAS基因黑麦草植株的PCR鉴定。1.DNA分子量标准；2.阳性对照；3.阴性对照植株；4-9，为独立拟转基因植株。图5转基因黑麦草植株的Southern杂交检测。对pBNA转基因阳性植株基因组DNA、质粒pBNA及非转化植株基因组DNA用EcoRI完全酶切，电泳转膜，用NTPII基因片段做探针进行Southern杂交，在转基因植株中出现特征带。由于内切酶EcoRI在NTPII基因内没有酶切位点，所以从Southern杂交结果中显示的条带数，初步确定了pBNA质粒在转化植株基因组中的插入位点。图6转基因黑麦草植株的在温室中的耐旱性鉴定。将检测后的阳性转基因黑麦草植株和对照植株移栽到温室后，进行干旱胁迫处理；对照植株(A)经10天干旱胁迫即完全枯死，而转基因植株在两周后仍未死亡(B)。此外，转基因抗性黑麦草植株叶绿素含量明显高于对照植株，这可能与外源NASHOR1基因的导入有关，增加了黑麦草在干旱条件下铁元素的吸收利用和运输，加强植物生理生化作用，从而提高和改善了植物在不良环境条件下的生长状态。图7转基因黑麦草植株的在北京地区的小面积田间鉴定。2002年将转基因黑麦草植株和对照植株移栽到北京中国科学院遗传与发育生物学研究所农场试验田间后，整个夏季依自然灌溉，未辅以人工浇水灌溉；转基因黑麦草植株(B)生长势明显优于对照植株(A)。实施例多年生黑麦草(L.perenneL.)是一种重要的禾本科牧草和草坪草，广泛分布于温带地区。一般用作饲料牧草和草坪草。黑麦草具有建植速度快、抗病虫害能力强、分蘖能力强等特性，能够迅速覆盖地面，为其它植物的生长提供良好的环境。实施例1抗逆性质粒pBNAS的构建根据大麦烟胺合成酶(NASHOR1)cDNA序列，合成一对针对大麦烟胺合成酶序列特异性引物N端5‘-GGATCCATGGATGCCCAGAACAAGGAG-3’C-端5‘-GGATCCCAACGATCAGAAGGCCACT-3’PCR反应条件依据高保真Taq酶扩增体系说明书进行。变性温度为94℃，退火温度为60℃，延伸温度72℃，30个循环后，72℃保温10min。PCR产物经博大科技公司的DNA快速纯化回收试剂盒回收后，与T-Veeter在4℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，产生重组质粒pBUC，挑选白色菌落，经酶切鉴定后并测序。质粒pBNAS详细的构建见图1。质粒保存在大肠杆菌DH5α。含有CaMV35S启动子调控的大麦NAS基因，大小为0.987Kb，为BamHI酶切。另外含有pNOS调控的NPTII基因，大小为795bp。实施例2黑麦草的组织培养系统的建立与植株再生黑麦草(LoliumperenneL.)品种凯，百盛，春潮(黑麦草X高羊茅)、卓越2000等种子(Clover公司)用于该实验(图2)。将成熟的种子用20％NaClO浸泡60分钟，用无菌水冲洗3-4次，接种在诱导培养基上。待长出愈伤组织后转至继代培养基上培养。每3-4周继代一次。当愈伤组织形成大量结构致密、颗粒状、显黄白色的胚性愈伤组织后，即可。将胚性愈伤组织转至分化培养基上进行1-2个月的培养后，可长出1-2cm的幼苗，再将其转移到生根培养基。待苗长大并长出根后经2-3天的温室炼苗后移植到土中。愈伤组织的诱导和继代培养在黑暗中进行，愈伤组织的分化和幼苗生根培养的培养条件为25-26℃，每日光照12h，光强2000lux。各培养基配方如下MS基本培养基MS大量元素+MS微量元素+MS有机成分+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegal，pH5.8NB基本培养基N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+500mg/L脯氨酸+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegalpH5.8CC基本培养基CC大量元素+CC微量元素+CC有机成分+30g/L蔗糖+3-4g/LPhytegal，pH5.8诱导及继代培养基MS、NB和Cc基本培养基+2or5mg/L2，4-D+0.05mg/LBAP+2mg/LABA+1g/L水解酪蛋白预分化培养基MS、NB和CC基本培养基+2mg/LBAP+1mg/LNAA+2mg/LABA分化培养基MS、NB和CC基本培养基+mg/LBAP+1mg/LNAA+0.5-1mg/LTDZ壮苗培养基1/2MS无机盐+B5有机+0.5-1mg/LNAA+1mg/LMET实施例3黑麦草的转化与转基因植物的获得金粉DNA复合体的制备称取60mg金粉(＝1.0um)放入1.5ml灭菌的离心管中，加入1ml无水乙醇，振荡1min，10000rpm离心10秒，弃上清。重洗一次后，将金粉悬浮于1ml无菌水中，现用或-20℃保存。吸取50μl金粉悬浮液，20μl0.1M亚精胺，20μl2.5MCaCl2，5μgDNA，振荡3分钟，10000rpm离心20秒，弃上清，以无水乙醇漂洗两次，加入60μl无水乙醇，重悬。受体材料的轰击选用适当型号的压力膜，与轰击膜一起，在70％的酒精中浸泡0.5~2小时，取出晾干，取10μl制备好了的金粉-DNA复合体，用无水乙醇作适当稀释后，无效产地涂布于轰击膜上，晾干后进行轰击，每皿轰击两次。受体材料的预处理选取生长状态良好为转化受体材料，轰击前将其转至含甘露醇(90g/L)的高渗培养基上培养12~24h，使用1100psi的压力膜，以每枪使用500μg金粉吸附1μgpBNAS质粒DNA的用量、6cm的轰击距离、每皿材料轰击2枪。轰击后继续在高渗培养基上培养24h；再将其转入不含筛选剂的继代培养基中恢复培养一周左右，然后再进行筛选培养。转化子的筛选和培养转化后的愈伤组织先在较低选择压G41850mg/l的继代培养基上筛选3-4周，再转至较高选择压G41875mg/l的培养基上筛选3-4周；然后选取成活的抗性愈伤组织块转至上述选择压的预分化培养基上进行预分化培养，10天后至分化培养基上进行分化培养，每隔20天左右更换一次培养基待幼芽长出1-2cm后，将抗性苗移入生根培养基上进行生根培养。参照前人(Altpeter等，2000，Spangenberg等，1995；Wang等，1992；Wang，1997；Wu等，1997；Xiao等，1997；Ye等1997，2000；Zhong等，1993)在水稻、小麦、大麦、高羊茅、黑麦草等单子叶禾本科植物中采用的基因枪转化方法，建立了禾本科草坪草黑麦草的基因枪转化技术体系(图3)。实施例4拟转化植株分子鉴定按照Dellaporta等(1983)的方法提取拟转化植株的基因组DNA，以NPTII基因编码区特异的引物进行PCR扩增，筛选出转基因植株(图4)。为了进一步证实目的基因在转化植株总基因组中的整合，按照Sambrook等(1989)的方法，用BamHI酶切pBNAS质粒DNA，回收带有NPTII基因的795bp大小的DNA片段作为探针，对PCR检测的阳性植株进行Southern杂交，结果如图5所示转基因植株的总DNA中有特征带，而在未转化的阴性植物中没有出现任何带，这表明外源基因已整合到植物基因组中。实施例5转基因植株的干旱节水实验将检测后的阳性转基因黑麦草植株和对照植株移栽到温室后，进行干旱胁迫处理；两周时间的干旱胁迫使得转基因阳性植株与阴性对照植株之间生长状态的差异极为明显(图6)。此外，转基因抗性黑麦草植株叶绿素含量明显高于对照植株，这可能与外源NAS基因的导入有关，增加了黑麦草在干旱条件下铁元素的吸收利用和运输，加强植物生理生化作用，从而提高和改善了植物在不良环境条件下的生长状态。实施例6转基因植株在田间小规模的干旱胁迫实验转基因黑麦草植株的在北京地区的小面积田间鉴定。2002年将转基因黑麦草植株和对照植株移栽到北京中国科学院遗传与发育生物学研究所农场试验田间后，整个夏季未辅以人工浇水灌溉，仅依自然降雨灌溉；转基因黑麦草植株(图7B)生长势明显优于对照植株(图7A)。参考文献AltpeterF，XuJP，SalahuddinA，PosseltUK，SchubbertJ.RNA-mediatedvirusresistanceinfertiletransgenicperennialryegrassplants.Abstracts2ndInternationalsymposiummolecularbreedingofforagecrops，2000，p103AltpeterF，XuJP.Rapidproductionoftransgenicturfgrass(Fescuerubra)plants.J.PlantPhysiol.，2000，157441-448Cornejo，MJ，Luth，D，Blankenship，KM，Anderson，OD，andBlechl，AE.Activityofamaizeubiquitinpromoterintransgenicrice.PlantMol.Biol.1993，23，567-581.Dellaporta，SL，Wood，J，andHicks，JB，ArapidmethodforDNAextractionfromplanttissue.PlantMol.Biol.Rep.1983，1，19-21.HiguchiK.，TaniK.，NakanishiH.，YoshiwaraT.，etal.TheexpressionofabarleyHvNASlnicotianaminesynthasegenepromotor-gusfusiongeneintransgenictobaccoisinducedbyFe-deficiencyinroot.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2001，651696-1697Ling，HQ，Koch，G，Bumlein，H，andGanalM，Map-basedcloningofchloronerva，ageneinvolvedinironuptakeofhigherplantsencodingnicotianaminesynthase，ProcNatlAcadSciUSA1999，96(12)7098-103。MassHMVander，JongERde，RuebS，HensgensLAM，KrensFA.Stabletransformationandlong-termexpressionofthegusAreportergeneincalluslinesofperennialryegrass.PlantMol.Bio.，1994，24401-405Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，andManiatis，T.MolecularCloningALaboratoryManual1989.NewYorkColdSpringHarborLaboratoryPress.SpangenbergG，WangZY，NagelJ，IglesiasVA，PortrykusI.Transgenictallfescueandredfescueplantsfrommicroprojectilebombardmentofembryogenicsuspensioncells.J.PlantPhysiol.，1995，145693-701SuzukiK，NakanishiH，NishizawaNK，MoriS.AnalysisofupstreamregionofnicotianaminesynthasegenefromArabidopsisthalianapresenceofputativeERE-likesequence.BiosciBiotechnolBiochem.2001，65(12)2794-7.VonWirenN.，KlairS.，BansalS.，BriatJ.F.，etal.NicotianaminechelatesbothFe3+andFe2+implieationformetaltransportinplants.PlantPhysiol.，1999，1191107-1114WangGR，etal，FertiletransgenicplantsfromdirectgenetransfertoprotoplastsofLoliumperenneandL.multiflorum.J.PlantPhysiol.，1997，151149-154WangXL.Genetransfertoryegrassesdown-regulationofmajorpollenallergensintransgenicplants.ProcXVIIIIntlGrasslandCongress，WinnipegandSaskaton1997，3WangZY，BindingH，PosseltUK.TransgenicplantsoftallFescueobtainedbydirectgenetransfertoprotoplasts.Bio/Tech.，1992，1069-73WelchR.M.Micronutrientnutritionofplants，Crit.Rev.PlantSci.，1995，14149-82WuXL，YeXD，WangZY，PotrykusI，SpangenbergG.Genetransfertoryegrassesdown-regulationofmajorpollenallergensintransgenicplants.Proc.XVIIIInt.GrasslandCongress，WinnipegandSaskatoon，1997，3XiaoL，HaSB.Efficientselectionandregenerationofcreepingbentgrasstransformantfollowingparticlebombardment，PlantCellReports，1997，16874-878YeX，WangZY，XuX，PotrykusI.TrahsgenicItalianryegrass(Loliummultiflorum)plantsfrommicroprojectilebombardmentofembryogenicsuspensioncells.PlantCellReports，1997，16379-384YeX，WangZY，ZhaoH，FreherM，NoesbergerJ，PotrykusI，Span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