专利名称：一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法及其专用引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种利用分子标记辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法及其专用引物。
背景技术：
近年来以生物诱导为基础的单倍体育种技术已逐步成为玉米育种中的关键技术，与转基因技术、分子标记辅助选择并称为现代玉米育种中得三项核心技术。玉米育种中玉米单倍体产生的主要途径是诱导系杂交诱导途径产生母本(雌性)单倍体，简称为孤雌生殖单倍体° Coe (Coe E H.A line of maize with high haploid frequency [J].Am Nat,1959,93:381-382)在1959年发现了玉米孤雌生殖诱导系Stock6。由于Stock6缺乏用以鉴别杂交诱导的单倍体穿的遗传标记基因，无法在生产中直接利用。在此基础上，人们不断对其进行改造，如转入Navajo (ACR-nj)遗传标记基因，通过籽粒颜色和植株颜色鉴定出单倍体，从而使杂交诱导单倍体进行单倍体育种成为了可能。但是在实践应用中也发现，Stocke的诱导率也很低(约为3% )，并且存在很多严重的缺陷，如雄花对温度敏感，自交结实性差，穗粒腐病严重，Navajo遗传标记较弱。因此，利用Stock6诱导单倍体的关键是要在保持其诱导能力的前提下克服上述缺点。国外在这方面起步较早，并已取得了较大进展，选育出了一些优良的诱导系，如法国的WS14(Lashermes P,Beckert M.Genetic controlof maternal haploidy in maize(Zea mays L.) and selection of haploid inducinglines [J].Theor Appl Genet, 1988, 76 (3):405-410)、前苏联的 KEMS (Shatskaya 0 A.etal, Mass induction of maternal haploids in corn[J].Maize Genet Coop Newslett,1994,68:51),摩尔多瓦的 MHI (Chalyk S T.Creating new hap1id-1nducing lines ofmaize [J].Maize Genet Coop Newslett, 1999,73:53-54),德国的 RWS (F.K.Rober et al.，In vivo haploid induc tion in maize-Performance of new inducers and significanceof doubled haploid lines in hybrid breeding [J].Maydica, 2005, 50:275-283)等等。这些新选的诱导系不但适应当地的环境，而且其诱导率及遗传标记也进一步提高，利用价值已经大大超出了 Stock6。诱导系的选育是耗时费力的过程，一个诱导系的选育往往要花费7-10年时间。由于诱导系的选育需要每代单株测验诱导率，选育规模越大所需的工作量越大。例如某世代测验规模为400个株系，每个株系有10株，每株测验3穗测验种，就将测验12000个果穗，仅田间种植就将需要5亩试验地。收获后，对得到的杂交果穗挑选单倍体，测定单株诱导率。单倍体的筛选在世界范围内均为手工操作，一个熟练工每日可完成30个果穗的单株诱导率测定工作，那么仅考种一项，就需要10个熟练工连续工作40天。如果缩小育种规模在常规选育条件下往往会丢失掉诱导性状。由于诱导性状选育的复杂性，很难在选择诱导率的同时兼顾农艺性状等，造成诱导系本身适应性差。我国各生态区域气候条件复杂，现有的诱导系很难在全国各地广泛使用，加之在不适合的气候条件下，诱导系可能会不散粉、不结实等，造成巨大经济损失。因此有必要在不同生态区域选育适合当地气候条件的诱导系，有必要突破常规方法，降低单倍体诱导性状的选育难度，提高诱导系选育效率，使得诱导系的选育过程中诱导率与农艺性状能够被兼顾。分子标记辅助选择(MAS)是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分子育种。对于诱导率测定这种耗时费力的性状，可以在研究其遗传机制的基础上，开发出与目标性状紧密相关的分子标记来进行辅助选择，以增强育种效率。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用于鉴定玉米单倍体诱导系的引物对。本发明所提供的用于鉴定玉米单倍体诱导系的引物对，为SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2所示的引物对。本发明的另一个目的是提供第一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法。本发明所提供的辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:以待测玉米的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再检测PCR扩增产物；若所述PCR扩增产物为204bp的条带，则确认所述待测玉米为候选单倍体诱导系。上述第一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法中，所述待测玉米的基因组DNA为待测玉米籽粒胚乳DNA。 本发明的另一个目的是提供第二种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法。本发明所提供的第二种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:以待测玉米的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物I ;以已知的玉米单倍体诱导系的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物II ;检测所述PCR扩增产物I与所述PCR扩增产物II是否相同，若相同，则确认所述待测玉米候选为玉米单倍体诱导系。上述第二种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法中，所述基因组DNA为玉米籽粒胚乳 DNA。上述第二种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法中，所述已知玉米单倍体诱导系为高频单倍体诱导系CAU5。本发明的利用分子标记进行辅助鉴定单倍体诱导系的方法，可以不通过单株诱导率测验，在苗期即可淘汰掉大量无诱导率单株，增大单倍体诱导系的选育效率，省时省力，加速单倍体诱导系的选育进程。在与以往相同选育规模下，可以更加注重对农艺性状的筛选。
图1为以N1680、CAU5、F1及F2群体的基因组DNA为模板，利用引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物的带型。图2为以玉米自交系CAU5、CAUHO1、CAU2、UH400、N1680、B73的基因组DNA为模板，利用利用引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物的带型。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。1、高油玉米自交系N1680:N1680为高油自交系，平均油份达到8%，雄穗发达，花粉量大，无单倍体诱导率，无R-nj标记，可以从中国农业大学国家玉米改良中心获得；高油玉米自交系N1680在文献“陈绍江，姜海鹰，宋同明.玉米显性高油基因存在的若干证据[J]，中国农业大学学报9 (6) 7-8”中公开过，公众可以从中国农业大学获得。2、高频单倍体诱导系 CAU2、CAU3、CAU5、CAU079:单倍体诱导系 CAU2、CAU3、CAU5、CAU079为中国农业大学选育的二代单倍体诱导系，平均诱导率均达到10%以上，具有R-nj标记，在“陈绍江，黎亮，李浩川.玉米单倍体育种技术[M].中国农业大学出版社，2009.”一书中公开过，公众可以从中国农业大学获得。3、高油单倍体诱导系CAUHO1:CAUH0I为高油单倍体诱导系(Liang Li, XiaoweiXu, Weiwei Jin, Shaojiang Chen.Morphological and molecular evidences for DNAintrogression in haploid induction via a high oil inducer CAUHOI in maize.Planta，2009，230:367-376)，诱导率在2 %，具有R_nj标记，公众可以从中国农业大学获得。4、高频单倍体诱导系UH400:UH400单倍体诱导率达到8%左右，在文献“PriggeV, Sanchez C, Dhillon BS, Schipprackff, Araus JL,Banziger M, Melchinger AE.Doubledhaploids in tropical maize:1.Effects of inducers and source germplasm on invivo haploid induction rates.Crop Sci, 2011, 51:1_9.” 中公开过，由德国霍恩海姆大学选育，公众可以从中国农业大学获得。5、高油玉米自交系GY923、BY815在文献“姜海鹰，陈绍江，高兰锋，邢吉敏，宋同明，戴景瑞.高油玉米自交系的杂种优势群划分和优势模式分析[J]，作物学报，2005，361-367.”中公开过，公众可以从中国农业大学获得。6、B73、Mol7、178、黄C为常规自交系，在“曹广才，徐雨昌.实用玉米自交系[M].气象出版社，2000.”一书中详细介绍。公众可以从中国农业大学获得。7、郑单958可以从北京德农种业购得。实施例1、单倍体诱导性状QTL qH1-Ι的发现利用高油玉米自交系N1680与诱导系CAU5进行杂交和自交，构建了 F2群体，再利用SSR标记在诱导系CAU5的第一号染色体上发现了一个控制单倍体诱导能力的主效QTL。在此基础上，扩大F2群体的规模，利用F2代搜寻交换单株，F2:3鉴定表型的方法，对该QTL进行精细定位，将其定位到一号染色体1.04区域上的分子标记X18与X93之间的800kb范围内，将其命名为qH1-Ι，田间试验证明携带该基因的单株诱导率在2% -15%之间，不携带该基因的植株没有单倍体诱导能力或单倍体诱导能力很低(单倍体诱导率均值仅为
0.52% )。实施例2、玉米单倍体诱导性状QTL qH1-Ι的应用一、引物设计及带型分析利用实例I获得的QTL qH1-Ι所在区域玉米自交系B73的序列，利用PrimerPremier 5.0软件设计得到辅助筛选单倍体诱导性状的引物，命名为X18，是由SEQ ID NO:1与SEQ ID NO:2组成的一对引物，引物序列如下:SEQ ID NO:1:CGGTGAAGGCATCAGAAGGG ；SEQ ID NO:2:GGGAGGACGGCAAGCAAGAG。二、本发明方法1、制备F2代植株以高油玉米自交系N1680做母本，CAU5为父本配置F1。诱导系CAU5为早熟材料，在中国农大北京上庄实验站，播种至散粉需65天；N1680为中晚熟材料，播种至散粉需75天，为使花期协调，需将N1680提前播种10天。得到的杂交种子为Fl代种子，将Fl代种子进行播种得到的植株即为Fl代植株；将Fl代植株自交，得到的种子为F2代种子。2、玉米单倍体诱导性状QTL qH1-Ι的筛选首先选取F2代种子中有R-nj标记的籽粒，提取籽粒胚乳DNA。提取的方法为:首先用水稍微浸泡一下籽粒，而后切取少许胚乳至96孔PCR板内，随后向孔内加100 μ 10.1M的 NaOH，99.9。。煮 10_12min(PCR 仪)，而后 12°C保存。IOOOrpm 离心 Imin 后，加 100 μ II XTE 2.0 (用HCL调至PH 2.0)，混匀后，2000rpm离心5min后，上清液即为提取好的胚乳基因组DNA。
利用上述SSR引物进行对胚乳基因组DNA进行PCR扩增。PCR的反应体系为:玉米胚乳基因组 DNA 5ul，正向引物 0.75“11101，反向引物0.75 4 11101，10(^11101 dNTPs, 1.5 μ I10XPCR缓冲液，Taq酶1U，用超纯水补足15 μ I。循环扩增程序为:95°C预变性5分钟，进入循环:94°C变性50秒；58°C复性50秒；72°C延伸50秒；循环32次后在72°C延伸5分钟，置于4°C下保存。扩增产物利用聚丙烯酰胺凝胶电泳银染法显示，照相，统计带型。共选取了 1000个有R-nj标记的籽粒进行分子标记检测，扩增带型如图1所示，图中，I:N1680,2:CAU5，3:F1，4_43:F2群体。共有如下三种带型:I)与诱导系CAU5 —致的带型:扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上显示200bp的条带，该条带的理论大小为204bp ；2)与自交系N1680 —致的带型:扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上显示180bp的条带，该条带的理论大小为186bp ；3)杂合带型:扩增产物在聚丙烯酰胺凝胶上同时显示ISObp与200bp的条带。若扩增产物带型与诱导系CAU5带型一致，则确认其对应的F2籽粒为单倍体诱导系O结果，1000个有R-nj标记的籽粒中，扩增产物带型与诱导系CAU5 —致的有115粒；扩增产物带型与自交系N1680 —致的为365粒；扩增产物带型与Fl —致表现为杂合的有520粒。如果扩增产物为与诱导系CAU5 —致的带型或杂合带型，则认为该模板DNA所对应的F2籽粒具有单倍体诱导性状QTL qH1-Ι，这样共计有635个籽粒符合目标，但是考虑到杂合型籽粒后代仍会分离以及田间工作量，选取了只具有与诱导系CAU5 —致的带型的115个籽粒作为目标籽粒进行田间种植。苗期取植株叶片DNA，利用上述分子标记检测植株基因型，验证利用胚乳DNA进行基因型分析的效果。结果显示:叶片DNA检测结果与胚乳DNA检测结果保持一致。
对分子标记鉴定为阳性的84个F2植株用传统方法(田间鉴定)进行鉴定。将此84个F2代单株作为目标单株进行自交，并分别采集F2代单株花粉与5穗郑单958杂交，从得到的杂交种子挑选单倍体，统计每个F2单株的单倍体诱导率，根据诱导率确定该F2代单株是否具有单倍体诱导性状。鉴定杂交种子是否是单倍体方法:1)、胚芽颜色鉴定:采用颜色标记法进行初步鉴定，即依据杂交当代籽粒胚芽的Navajo标记来进行鉴别:糊粉层为紫色、紫色胚芽的杂交当代籽粒为杂合籽粒；糊粉层为紫色、无紫色胚芽的杂交当代籽粒为拟单倍体籽粒。2)、将拟单倍体种植于上庄实验站，根据植株颜色、株高、育性三个标准进行鉴定:单倍体植株浅绿、株高显著低于正常二倍体，叶片较窄且上冲，散粉期表现为高度不育或部分可育；如果植株矮小、叶片上冲且在散粉期雄穗不育可判断为单倍体，植株高大、叶片披散且雄穗育性良好为杂合二倍体。单倍体诱导率的统计方法如下:I)、统计同一 F2单株诱导的5穗郑单958杂交种子中，有标记籽粒总量、拟单倍体总量、拟单倍体田间出苗数、田间单倍体数；2)、拟单倍体诱导率=拟单倍体籽粒数量/有标记总籽粒数量X 100% ；3)、矫正系数=田间单倍体数/拟单倍体田间出苗数；4)、单倍体诱导率=校正系数X拟单倍体诱导率。结果:分子标 记鉴定为阳性的且收集到表型的84个F2植株，单倍体诱导率介于
1.7% -15.45%之间，均值为6.24% ±2.97%，这些阳性植株都具有单倍体诱导能力，鉴定的假阳性率为O。其中有51个单株的诱导率大于5%，诱导率大于7%的单株有26个。实施例3、用筛选标记X18进行鉴定一、材料玉米自交系N1680、CAU5、CAUHO1、CAU2、CAU3、CAU079、UH400、B73、Mol7、GY923、BY815、178、黄 C。其中 CAU5、CAUHO1、CAU2、CAU3、CAU079、UH400 为单倍体诱导系；N1680、B73、Mol7、GY923、BY815、178、黄C为常规自交系，S卩非单倍体诱导系。二、用分子标记进行鉴定按照实施例2中分子标记进行鉴定方法，用引物对SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对以上13个自交系进行基因型分析。检测结果如图2 所示。图 2 中，I:N1680,2:CAU5,3:CAUH0I,4:CAU2,5:CAU3,6:CAU079，7:UH400,8:B73,9:Mol7,10:GY923,11:BY815,12:178,13:黄 C。结果表明引物在7个诱导系中，均可扩增出与CAU5相同的带型。在7个无诱导率材料中，除自交系Mo 17外，其余均可扩增出与N1680 —致的带型。具体鉴定结果如表I。三、田间方法鉴定按照实例2中田间鉴定方法，对以上13个自交系进行单倍体诱导率的测定，单倍体诱导率结果如表I。表1:13个玉米自交系单倍体诱导率的分析结果~m玉米自交系I传统方法鉴定单倍体诱导I分子标记鉴定
权利要求
1.一种用于鉴定玉米单倍体诱导系的引物对，为SEQ ID NO:1和SEQ ID N0:2所示的引物对。
2.一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:以待测玉米的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物，再检测PCR扩增产物；若所述PCR扩增产物为204bp的条带，则确认所述待测玉米为候选单倍体诱导系。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述待测玉米的基因组DNA为待测玉米籽粒胚乳DNA。
4.一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法，包括如下步骤:以待测玉米的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物I ;以已知的玉米单倍体诱导系的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对进行PCR扩增，得到的PCR扩增产物记作PCR扩增产物II ;检测所述PCR扩增产物1与所述PCR扩增产物II是否相同，若相同，则确认所述待测玉米候选为玉米单倍体诱导系。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于:所述基因组DNA为玉米籽粒胚乳DNA。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于:所述已知玉米单倍体诱导系为高频单倍体诱导系C AU5。
全文摘要
本发明公开了一种辅助鉴定玉米单倍体诱导系的方法及其专用引物。本发明提供的用于鉴定玉米单倍体诱导系的引物对，为SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的引物对。本发明的利用分子标记进行辅助鉴定单倍体诱导系的方法及引物对，可以不通过单株诱导率测验，在苗期即可淘汰掉大量无诱导率单株，增大单倍体诱导系的选育效率，加速单倍体诱导系的选育进程。在与以往相同选育规模下，可以更加注重对农艺性状的筛选。
文档编号C12N15/11GK103088109SQ20111033234
公开日2013年5月8日 申请日期2011年10月27日 优先权日2011年10月27日
发明者陈绍江, 徐小炜, 黎亮, 董昕 申请人:中国农业大学