专利名称：一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴定啤酒酵母单倍体的方法，特别是一种基于菌落PCR和流式细胞技术的方法，属于微生物鉴定领域。
背景技术：
酵母是啤酒酿造的灵魂，对啤酒质量起至关重要的作用。工业啤酒酵母包括上面酵母(ale brewing yeast, Saccharomyces cerevisiae)和下面酵母(lager brewingyeast, Saccharomyces pastorianus)两大类，市售啤酒90%以上是由下面酵母发酵而成，所以对工业啤酒酵母的研究也大多是针对下面酵母的。下面酵母又称卡尔酵母，为异源杂合的多倍体或非整倍体，他们复杂的倍性给酵母改良和遗传研究带来了诸多困难。酵母单倍体菌株只有一套染色体，基因情况简单明了，常被用作遗传学和育种工作的模式菌株，既为性状遗传分析所必需，又可为杂交作好亲本的准备。而且，单倍体菌株具有细胞小、蛋白酶A产量低、自溶性能好等优势，在理论研究和实际应用中都具有深远意义。但因为工业啤酒酵母长期生活在营养充足的环境里，产孢能力退化，单倍体分离率和成活率低，而且缺乏行之有效的鉴定方法，因此此方面的研究并不多。
发明内容
本发明要解决的技术问题是建立一种能精确、高效鉴定啤酒酵母倍性的方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案为首先采用菌落PCR进行初步判定，然后通过流式细胞仪检测DNA含量确定倍性；菌落PCR的特异性引物为MAT 特异性引物(5' -AGTCACATCAAGATC GITTATGG-3')；MATa 特异性引物(5' -ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3')；MATa 特异性引物(5' -GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3')。本发明的具体检测步骤如下(I)待检测的菌种稀释涂布YEH)平板，28°C培养2-3天后，用牙签小心挑取适量菌体到I. 5mL离心管，为避免琼脂干扰PCR结果，可先将细胞洗涤2-3次，收集菌体后进行菌落 PCR。(2) PCR反应中所用三种引物分另Ij为MAT特异性引物(5 ' -AGTCACATCAAGATCGTTTATGG-3 ' ) ；MATa 特异性弓I物(5 ' -ACTCCACTTCAAGTAAGAGTTTG-3 ' ) ；MAT a 特异性弓| 物(5' -GCACGGAATATGGGACTACTTCG-3' )。PCR 反应体系中(100 y L)加入适量细胞、三种引物各 2iiL、dNTP 8 u LUOXbuffer 10 y L、rTaq 酶 0. 5 y L、ddH20 75. 5 y L，适当混匀后置于 TECHNE TC-5000PCR 仪进行 PCR 反应，条件为 95°C变性 5min ;94°C变性 l_2min，50°C退火 30-60s，72°C延伸 l-2min, 25-40 个循环；72°C总延伸 5min。。(3)PCR产物进行I. 2% -2%的琼脂糖电泳。单倍体菌株的电泳结果只有一条条、带，其中MATa型的为544bp，MATa型的为404bp，杂合二倍体和多倍体菌株同时有两条条带，纯合二倍体和多倍体菌株只有相应的一条条带。(4)选取电泳结果只有一条条带的菌种(单倍体或纯和多倍体、杂倍体)进行流式细胞分析。(5)将选出的菌株与单倍体标准菌分别接种于YEH)液体培养基，28°C振荡培养12-24h。取 0. 5-lmL 菌液到 I. 5mL 离心管中，8，000 X g-12, 000 X g 离心 5-lOmin 收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤2-3次，然后用PBS溶解。(6)将菌液沸水浴2-8min杀死细胞。加入10-12 u L 10mg/mL的RNaseA，50°C水浴 30_50min,然后加入 20-24 u L 20mg/mL proteinase K, 50°C水浴 30_50min。离心后收集菌体，重悬于PBS后适当稀释，超声10-20s，间隔2-3s，重复2-3次。(7)上机前每mL样品加入5-10 ii L lmg/mL的碘化丙锭(PI),避光反应5-lOmin。
(8)样品倍性用Becton Dickinson FACSCalibur流式细胞仪进行分析。超纯水作为流动鞘液，用氩离子激发荧光，激发波长为488nm，使用660/16nm带滤光片作PI荧光分析，每个样品至少检测I X IO4个细胞，得到FCM图谱。(9)酵母菌株的倍性用DNA含量表示，通过与单倍体标准菌的对比得出若待测菌与标准菌具有相同或相似的DNA含量,则为单倍体菌株；若DNA含量为标准菌的倍数,则为相应倍性的纯和多倍体或杂倍体。稳定性和可重复性分析MAT PCR、琼脂糖电泳和流式细胞技术都是稳定性和可重复性良好的实验方法。经检验，当流式细胞仪荧光强度的线性相关系数(I)在0. 98以上，前向角散射光检测灵敏度< I U m，前向角散射光和荧光信号的荧光通道全峰宽或半峰宽CV值< 5%时，可以保证实验结果的准确性和可重复性。本发明提供了一种客观有效的鉴定啤酒酵母单倍体的方法，其特征是基于MATPCR和流式细胞技术联用的实验策略，高效、精确、可重复性好。相较于传统的单倍体鉴定方法(长时间培养、染色镜检)而言，该发明能在极短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果也更加真实可信。而且，该发明能够同时鉴定出单倍体菌株的交配型(MATa/MAT a )，并能将酿酒酵母单倍体标准菌对实验结果的影响降到最小。该发明中，MT PCR不仅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鉴定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干扰。
图I为单倍体标准菌(W303-1A MATa, W303-1B MAT a )、四株单倍体疑似菌(H2、H5、H12、H18)和一株啤酒酵母工业菌株G-03(倍性不明)MAT PCR产物的琼脂糖电泳图。M marker ；1 W303-1A ；2 W303-1B ；3 H2 ；4 H5 ；5 H12 ；6 H18 ；7 :G_03。图2为单倍体标准菌W303-1B的FCM图谱。图3为四株单倍体疑似菌的FCM图谱。
具体实施例方式实例I以实验室保存的四株单倍体疑似菌(H2、H5、H18)、一株啤酒酵母工业菌株G_03(倍性不明)、单倍体标准菌W303-1A、W303-1B (购于中国高校工业微生物资源和信息中心，CICIM-CU)作为实验菌株验证本发明方法的可行性与准确性。(I)将五株菌和单倍体标准菌稀释涂布YEH)平板，28°C培养2天后，用牙签挑取约1/2菌落的菌体到I. 5mL离心管，用ddH20洗涤3次，收集菌体后进行菌落PCR。(2)每个反应体系中(IOOiiL)加入三种引物各L、dNTP 8 U LUOXbuffer10 u L、rTaq 酶 0. 5 y UddH2O 75. 5 u L，适当混匀后置于 TECHNE TC-5000PCR 仪进行 PCR 反应,条件为:95°C变性5min ;94°C变性lmin，50°C退火30s，72。。延伸lmin,30个循环；72°C总延伸5min。(3)PCR产物进行2%的琼脂糖电泳。如图I所示，四株单倍体疑似菌的电泳结果都只有一条条带，其中H2和H5的MAT PCR产物为404bp，H12和H18的为544bp。工业菌株MAT PCR产物有两条条带，不是单倍体菌株。为排除纯和多倍体或杂倍体的情况，将H2、 H5、H12和H18进行流式细胞分析。(4)将四株菌和标准菌W303-1B分别接种于YETO液体培养基，28°C振荡培养24h。取ImL菌液到I. 5mL离心管中，10，OOOXg离心IOmin收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤3次，然后用PBS溶解。(5)将菌液沸水浴5min杀死细胞。加入IOyL 10mg/mL的RNaseA，50 V水浴45min,然后加入20 ii L 20mg/mL proteinase K, 50°C水浴45min。离心后收集菌体，重悬于PBS后，稀释至I X IO7 IXlO8个细胞/mL菌液，超声20s，间隔2s，重复2次。(6)流式细胞分析上样前,每mL样品加入5 ii L lmg/mL的碘化丙锭(PI),避光反应 5min。(7)样品倍性用BD公司的FACSCalibur流式细胞仪进行分析。每个样品检测4X IO4个细胞，得到FCM图谱。每个样品做三个平行。酵母菌株的倍性用DNA含量(对应PI荧光强度)表示，通过与单倍体标准菌的对比得出。实验结果如图2、图3、表I所示，四株单倍体疑似菌与单倍体标准菌W303-1B具有相似的荧光强度峰值和平均荧光强度，即具有相似的DNA含量，所以H2、H5、H12和H18被确认为单倍体菌株。表I五株菌FCM DNA和交配型分析结果
权利要求
1.一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法，其特征在于首先采用菌落PCR进行初步判定，然后通过流式细胞仪检测DNA含量确定倍性。
2.权利要求I所述的方法，其特征在于所述菌落PCR程序为95°C变性5min;94°C变性l-2min，50°C退火 30_60s，72°C延伸 l_2min，25-40 个循环；72°C总延伸 5min。
3.权利要求I或2所述的方法，其特征在于所述流式细胞仪检测方法前处理步骤如下 菌株与单倍体标准菌W303-1A、W303-1B分别接种于YETO液体培养基，28°C振荡培养12-24h ;取 O. 5-lmL 菌液到 I. 5mL 离心管中，8，000 X g-12, 000 X g 离心 5-lOmin 收集菌体，菌体重悬于PBS缓冲液后离心、洗涤2-3次，然后用PBS溶解；将菌液沸水浴2-8min杀死细胞；加入 10-12 μ L 10mg/mL 的 RNaseA, 50°C水浴 30_50min，然后加入 20-24 μ L 20mg/mLproteinase K, 50°C水浴30_50min ;离心后收集菌体,重悬于PBS后适当稀释,超声10_20s,间隔2-3s，重复2-3次；上机前每mL样品加入5-10 μ L lmg/mL的碘化丙锭(PI)，避光反应5-10mino
全文摘要
本发明公开一种快速鉴定啤酒酵母单倍体的方法，属于微生物鉴定领域。本发明采用菌落PCR和流式细胞技术联用的实验策略，高效、精确、可重复性好。相较于传统的单倍体鉴定方法(长时间培养、染色镜检)而言，该发明能在极短的时间内得出实验结果，大大减少工作量和工作时间，实验结果也更加真实可信。而且，该发明能够同时鉴定出单倍体菌株的交配型(MATa/MATα)，并能将酿酒酵母单倍体标准菌对实验结果的影响降到最小。该发明中，MAT PCR不仅是菌株交配型的判定方法，更是倍性鉴定的初判手段，能快捷、方便的排除部分菌株的干扰。
文档编号C12Q1/68GK102732620SQ201210189030
公开日2012年10月17日 申请日期2012年6月11日 优先权日2012年6月11日
发明者刘春凤, 李崎, 李永仙, 王金晶, 许维娜, 郑飞云 申请人:江南大学