专利名称：一株产α-酮戊二酸的菌株及用其发酵生产α-酮戊二酸的方法
技术领域：
本发明采用微生物发酵法生产α -酮戊二酸。发明内容涉及一株基因改造后丙酮酸代谢过程可动态调控的α-酮戊二酸高产菌株，以及相关的发酵生产技术。本发明是一种高光学纯度和化学纯度的α -酮戊二酸制造技术，发酵生产过程中只有痕量琥珀酸，乙酸等杂酸的生成。属于微生物发酵工程技术领域。
背景技术：
α -酮戍二酸(a-ketoglutaric acid, a-KG),又名 α -氧代戍二酸，α -胶酮酸，α-羰基戊二酸，α-酮基戊二酸，在细胞代谢中起重要作用，是三羧酸循环的重要中间产物之一，在生物体内参与氨基酸、蛋白质和维生素的合成以及能量代谢。α -酮戊二酸在医药工业、饲料工业、有机合成和功能性食品等领域应用广泛。医药工业方面，α-酮戊二 酸主要作为生化试剂和测肝功能的配套试剂，另外α-酮戊二酸还具有抗氰作用，可以起到抗惊厥作用；饲料工业方面，作为饲料添加剂可以提高动物抗应激能力，增强免疫功能，促进骨骼发育和提高繁殖率；有机合成方面，α -酮戊二酸也是重要的化工合成中间体，用于多种衍生化学品的合成；功能性食品方面，α-酮戊二酸主要作为运动营养饮料的成分，同时可以降低术后患者和长期病人的机体损耗。目前α-酮戊二酸的合成主要采用化学合成法。与化学合成法相比较，微生物发酵法用于α-酮戊二酸的合成在产品制备过程和产品品质方面均优势明显。因此随着优良生产菌种的选育和发酵技术的不断成熟，微生物发酵法必将会取代化学合成法成为α -酮戊二酸的主要合成方式。多种微生物被报道可以用于α-酮戊二酸的发酵生产，包括解脂假丝酵母(Candida lipolytica)、解脂亚洛酵母(Yarrowia Iipolytica)、光滑球拟酵母(Torulopsis glabrata)以及谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)等细菌。而大肠杆菌用于α-酮戊二酸的发酵生产未见报道。大肠杆菌作为遗传背景最为清晰的微生物之一，被广泛的用于包括人类在内的生命体代谢相关机理的研究。随着大肠杆菌代谢网络和分子水平上调控机理的不断被揭示和阐明，单一代谢中间体在大肠杆菌中的积累研究成果丰硕。目前，乙醇，乙酸，丙酮酸，琥珀酸，苹果酸，乳酸等多个代谢中间物的大量合成均可以在大肠杆菌中实现。一分子葡萄糖通过EMP途径形成两分子丙酮酸的过程中会形成两分子NADH，两分子丙酮酸形成乙酰辅酶A的过程则会再产生两分子NADH。乙酰辅酶A进入TCA循环后会形成更多NADH用于产生能 量合理高能化合物ATP等。大肠杆菌中，丙酮酸主要有四个流向。一是磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)作用下回流形成磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)。二是经丙酮酸氧化酶(pox)作用下直接形成乙酸。三是经乳酸脱氢酶(IdhA)作用还原形成乳酸。四是形成乙酰-CoA。丙酮酸形成乙酰-CoA存在两条途径，一条途径是，丙酮酸在甲酸裂解酶(Pf I)的作用下形成甲酸和乙酰-CoA，该途径主要在氧气不足时发挥作用。另一条途径是，氧气存在条件下，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(Pdh)的作用下脱羧氧化形成乙酰-CoA。因此，失活磷酸烯醇式丙酮酸合酶(pps)、丙酮酸氧化酶(pox)、甲酸裂解酶(pfl)和乳酸脱氢酶(IdhA)后，丙酮酸主要在丙酮酸脱氢酶复合体(pdh)作用下流向乙酰-CoA，进而进入TCA循环。在此基础上阻断α-酮戊二酸的分解代谢途径，获得的菌株即为α-酮戊二酸发酵生产菌株。由于α-酮戊二酸的下行代谢途径主要由α-酮戊二酸脱氢酶复合体催化完成。因此可以通过失活脱氢酶复合体实现上述设想。然而α-酮戊二酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体同属于α-酮酸脱氢酶复合体，其催化单元属于同一个催化酶系。因此，α-酮酸脱氢酶复合体主要酶系(如Ε1，Ε2和Ε3)的辅因子同时参与α-酮戊二酸脱氢酶复合体和丙酮酸脱氢酶复合体。有益的是，这些辅因子会优先作用于丙酮酸的脱氢酶复合体形成乙酰-CoA，因此控制细胞中该酶系辅因子的水平可以有效的实现丙酮酸形成乙酰-CoA途径顺畅的同时使得α -酮戊二酸下行分解代谢受阻，进而实现α-酮戊二酸的过量积累。本发明正是基于这一策略成功构建了高效合成α -酮戊二酸的重组大肠杆菌，并建立了对应的简洁发酵工艺。
大肠杆菌利用葡萄糖合成α-酮戊二酸的过程与菌体生长是部分偶联的，采用两阶段发酵工艺可以更好的实现α-酮戊二酸的快速合成。理想的α-酮戊二酸合成模式是，菌体生长阶段α-酮戊二酸不积累，而α-酮戊二酸快速合成阶段菌体不生长或缓慢生长。即菌体生长阶段保留α -酮酸脱氢酶复合体的功能，而在发酵产酸阶段限制其功能的继续发挥，进而实现α-酮戊二酸的过量积累。大肠杆菌除了自身可以合成α-酮酸脱氢酶复合体辅因子外，也可以以外源的添加物为底物，合成相应的辅因子。这一特点为实现大肠杆菌辅因子合成能力的人为调控提供了可能。以此，通过失活辅因子关键编码基因，阻断其原有的合成途径，进而通过添加硫胺素实现对辅因子合成的调控。菌体生长阶段添加丙酮酸脱氢酶系辅因子获得足够的菌体，α -酮戊二酸合成阶段适量补加辅因子，阻断α -酮戊二酸分解代谢的途径。上述过程意味着大肠杆菌代谢流的重新分配和氧化还原平衡的重新构建。本发明通过敲除部分关键酶的编码基因阻断旁路代谢途径，并通过对α -酮酸脱氢酶系辅因子合成过程的调控，实现了对丙酮酸进入TCA循环的途径动态控制，最终完成了氧化还原平衡下的α -酮戊二酸高强度合成。本发明经适当修改后，也可以用于其他生产菌种从葡萄糖或木糖以及淀粉或纤维素水解液或生物柴油来源的粗甘油等原料高效单一生产L-乳酸、丙酮酸、苹果酸、丁二酸、D-丙氨酸等其它有机酸或蛋白质等。
发明内容
本发明的目的是通过基因工程手段构建丙酮酸代谢可动态调控的α -酮戊二酸高产菌。并根据菌种的生长和代谢特性调整相关发酵工艺，实现丙酮酸积累和α-酮戊二酸合成的代谢平衡，建立一种α -酮戊二酸高效制备方法，获得少有或没有副产物，光学纯度高的产品，同时形成一套简洁易控的α-酮戊二酸发酵工艺。本发明的技术方案一株产Ct -酮戍二酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli) B0013-090A,该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012173，动态调控发酵过程，该菌株在添加丙酮酸脱氢酶系辅因子的情况下在好氧培养阶段快速生长，在发酵产酸阶段菌体生长受限快速合成α -酮戊二酸。
用所述的产α-酮戊二酸的菌株发酵生产α-酮戊二酸的方法，出发菌株为本发明构建的α-酮戊二酸高产菌株CCTCC NO Μ 2012173，动态调控发酵过程，丙酮酸脱氢酶系辅因子在发酵开始添加，发酵过程中不再添加，丙酮酸脱氢酶系辅因子的添加量为r200ng/L ;在发酵初期的8 12h内，培养温度控制在2(T30°C，pH维持7. 0，初始糖浓度为3%，充分供氧控制溶氧不低于30%，该阶段菌体利用葡萄糖快速生长，检测糖浓度低于O. 2%时，停止通氧；之后为厌氧发酵阶段，培养温度控制在37 45°C，pH维持7. 2，停止供氧并两次分批补加葡萄糖至终浓度10%，控制第二次补糖前残糖不低于1%，该阶段菌体利用葡萄糖快速合成α -酮戊二酸；发酵36 48h产α -酮戊二酸水平达到9%，α -酮戊二酸的化学纯度达到95%以上，几乎无其它有机酸产生。好氧阶段菌种较完全的利用葡萄糖快速生长，形成菌体，但不形成各种副产有机酸；厌氧阶段菌体保持较高活性，快 速利用葡萄糖合成α -酮戊二酸，并几乎不形成其它有机酸。发酵过程中多个工艺参数被调控，所涉及到的工艺参数包括温度、pH、溶氧、残糖和丙酮酸脱氢酶系辅因子。本发明主要应用于大肠杆菌，但不仅仅局限于大肠杆菌，还应用于芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌、或酵母。本发明主要应用于代谢葡萄糖合成α -酮戊二酸，但不仅限于此，还能代谢木糖、淀粉水解液、纤维素水解液、糖蜜或生物柴油副产甘油之多种碳源，或用于合成L-乳酸、丙酮酸、苹果酸、丁二酸、D-丙氨酸之一种。发酵生产过程全程采用质量浓度25%的Ca(OH)2调节pH，好氧阶段的控制过程不通过测定菌体量而通过检测残留葡萄糖的浓度来确定转厌氧的节点。本发明特征是在pH 7.0，2(T30°C生长温度下，提供足够的通氧，在添加丙酮酸脱氢酶系辅因子或辅因子合成相关底物后，α-酮戊二酸生产菌株较完全的利用葡萄糖快速生长，积累菌体；在pH 7.2，37 451下，停止供氧，菌体利用葡萄糖快速合成α -酮戊二酸，并几乎不形成其它有机酸和乙醇。本发明α-酮戊二酸的生产工艺特征为2(T45°C的条件下，发酵36 48h产α-酮戊二酸水平达到9%，α-酮戊二酸的化学纯度达到95%以上。本发明涉及的重组菌，其基因组中的一个或多个基因被删除或表达。所涉及到的基因产物包括NAD依赖性α -酮戊二酸脱氢酶、FAD依赖性的α -酮戊二酸脱氢酶、FAD依赖性L-乳酸脱氢酶、丙酮酸氧化酶、丙酮酸甲酸裂解酶、丙酮酸脱氢酶、乙酸激酶、乙醇脱氢酶、苹果酸脱氢酶、苹果酸合酶、硫胺素合酶、腺苷酰(基)转移酶、噻唑合酶、酪氨酸裂解酶、半胱氨酸脱硫酶、磷酸硫胺素合酶、硫胺素激酶、磷酸硫胺素激酶、二氢硫辛酸脱氢酶、二氢硫辛酰转乙基酶等。所涉及到的工艺控制参数包括温度、pH、溶氧、残糖浓度、辅因子添加量。本发明使用菌种、培养基和工艺控制方法菌种本发明使用的菌种为经过基因改造大肠杆菌(Escherichia coli)B0013-090A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, Δ IdhA, Δ thiE),该菌株中，甲酸、乙酸、琥珀酸等多种有机酸和乙醇的合成代谢途径以及丙酮酸脱氢酶系辅因子中的多个关键酶编码基因被敲除。培养基本发明使用的培养基为基本培养基(简称MG培养基)添加葡萄糖为碳源。
温度控制策略本发明中涉及的大肠杆菌最适生长温度为2(T30°C，最适产酸温度为37 45°C。发酵过程采用两阶段控制，前期采用2(T30°C利于菌体快速生长获得足够的菌体量；后期采用37 45°C利于α -酮戊二酸的合成。pH控制策略本发明中涉及的大肠杆菌最适生长pH为7. 0，后期产酸阶段维持pH7. 2既有利于减少发酵液中游离α -酮戊二酸的浓度提高产酸速率，又有利于维持细胞的活性。因此发酵过程采用两阶段PH控制策略，菌体生长阶段维持pH 7.0，利于菌体快速生长获得足够的菌体量；后期产酸阶段维持PH 7. 2，提高产酸速率。溶氧控制策略本发明中涉及的大肠杆菌为兼性厌氧菌，有氧条件下菌体快速生长，无氧条件下菌体利用葡萄糖快速合成α-酮戊二酸。发酵过程前期采用充分供氧策略，利于菌体快速生长，少生成或不生成各种有机酸等副产物；后期厌氧阶段，停止供氧，菌体在微好氧条件下维持一定的菌体活性，并快速代谢葡萄糖合成α -酮戊二酸。残糖控制策略本发明中涉及的大肠杆菌可以代谢葡萄糖合成α-酮戊二酸，其 合成甲酸，琥珀酸和乙醇的代谢途径被有效阻断。尽管该菌株多个乙酸代谢相关的关键基因被敲除，在丙酮酸浓度较高的情况下该菌株仍然可以大量积累乙酸。好氧阶段后期通过维持低残糖可以有效避免转厌氧后丙酮酸的过量积累，从而达到了丙酮酸积累和α-酮戊二酸合成的代谢平衡，避免了乙酸的积累，提高了 α-酮戊二酸的合成效率。前期菌体生长阶段添加适当的葡萄糖，待葡萄糖耗尽并获得足够的菌体量后转为厌氧发酵产酸，发酵产酸阶段分批间歇补加葡萄糖，从而实现了 α -酮戊二酸的高效制备。丙酮酸脱氢酶系辅因子添加策略本发明中丙酮酸脱氢酶系辅因子在发酵开始添力口，发酵过程中不再添加。丙酮酸脱氢酶系辅因子的添加量是关键所在。通过多次梯度摸索试验最终确定了丙酮酸脱氢酶系辅因子的添加量为f200ng/L.本发明的突出的实质性特点和显著进步主要体现在I、本发明构建的基因工程重组α-酮戊二酸高产菌，其丙酮酸的代谢过程可以动态调控，实现了菌体生长阶段丙酮酸主要用于菌体细胞的合成，而在发酵产酸阶段丙酮酸主要用于α-酮戊二酸的高效合成。2、本发明的建立的发酵工艺操作简单，易于实现，发酵过程不需要复杂的过程监控，丙酮酸脱氢酶系辅因子的添加在发酵伊始即可完成，后续发酵过程中不需要额外的操作。3、本发明的建立的发酵工艺中，发酵过程中添加的丙酮酸脱氢酶系辅因子，添加量属于痕量级别，不仅不会增加发酵成本和后提取成本，且其添加有效的减少的副产物的生成，对于高品质α-酮戊二酸的后提取作用显著。4、本发明建立的发酵工艺可以制备高化学纯度的α -酮戊二酸，菌株在2(T45°C的条件下发酵36 48h，产α-酮戊二酸水平达到9%，所产α -酮戊二酸的光学纯度达到95%以上；本发酵过程采用无机盐培养基，且基本没有杂酸等副产物的合成，保障了 α -酮戊二酸的高品质。生物材料样品保藏一株产α-酮戊二酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌(Escherichia coli ) B0013-090A，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，简写CCTCC，地址中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC NO M 2012173，保藏日期2012年5月20日。
图I辅因子浓度对(Escherichia coli) B0013-090A菌体生长的抑制作用((Escherichia coli) B0013-070B 为对照)。图2实施案例4中的产α -酮戊二酸情况。
具体实施例方式种子的培养采用LB培养基37°C的条件下，摇床转速200r/min培养至对数生长期中后期，获得一级种子；5%接种量转接至MG培养基，370C的条件下，摇床转速200r/min培养至对数生长期中后期，获得二级种子，用于发酵罐接种。发酵方式本发明建立的具体发酵方式如下采用MG培养基作为发酵培养基，7L发酵罐装液量3L，5%接种量。好氧阶段初始糖浓度3%，培养温度为2(T30°C，控制溶氧不低于30%，Ca(OH)2维持pH为7.0 ;检测糖浓度低于O. 2%时，停止通氧，补加葡萄糖至终浓度10%，Ca (OH) 2维持pH为7. 2，发酵温度维持37 45°C，发酵过程中测定残糖浓度，残糖浓度低于1%时，二次补糖至终浓度10%。发酵过程中定时取样用于高压液相分析。样品的分析发酵样品一部分离心取上清测定糖浓度，另一部分硫酸酸化处理后，离心取上清，经10%三氯乙酸沉淀，再次离心，上清液经O. 45 μ m微孔滤膜过滤后，用于高压液相分析。高压液相采用Shodex SUGAR SHlOlI，柱温50°C，紫外检测，波长为210nm。流动相为 O. 01mol/L H2SO4,流速 O. 7ml/L,柱压 44Bar。实施例I—删除乳酸脱氢酶的编码基因合成的寡核苷酸引物Pl (序列表中SEQ ID No 1)5' -TAAGGATCCT TATGAAACTC GCCGTTTATA GCACA-3'合成的寡核苷酸引物P2 (序列表中SEQ ID No 2)5' -CTTGAATTCG CTGCCGGAAA TCATCATTTT TT-3/以合成的寡核苷酸引物Pl和Ρ2为引物，以大肠杆菌947染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得乳酸脱氢酶基因(ldhA，序列表中SEQ ID No :3)，将此PCR产物克隆入PUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-ldhA。用PstI酶切去除其中的400bp的片段并用T4DNA Polymerase将粘性末端平滑化，再与difEe-GmK连接，获得 重组质粒pUC-ldhA::GmKdif，用EcoRI酶切该重组质粒，获得丙酮酸甲酸裂解酶的基因删除序列，pfl' -dif-GmK-dif-ldhA,即ldhA: :GmEdif0将此基因删除序列转化入大肠杆菌(Escherichia coli ) B0013-070B ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh ) 在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子大肠杆菌(Escherichiacoli ) B0013-080A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, △ IdhA)并用于后续研究。实施例2—删除磷酸硫胺素酶的编码基因合成的寡核苷酸引物P3 (序列表中SEQ ID No 4)5' -AGAGAATTCA TTCATCGCCA ACTCCTGCA-3'
合成的寡核苷酸引物P4 (序列表中SEQ ID No 5)5' -AGAGAATTCG GTGGACAGCG TACAGTGGAT CG-3,以合成的寡核苷酸引物P3和P4为引物，以大肠杆菌947染色体DNA为模板，运用PCR从基因组中扩增获得硫胺素酶基因(thiE，序列表中SEQ IDNo :6)，将此PCR产物克隆入PUC18的EcoRI位点中，获得重组质粒pUC-thiE'。用StuI酶切并与difEe_GmK连接，获得重组质粒pUC-thiE' : :dif-GmK，用EcoRI酶切该重组质粒，获得硫胺素酶的基因删除序列，ThiE' -dif-GmR-dif-ThiE/，即ThiE' : :GmKdif。将此基因删除序列转化入大肠杆菌大肠杆菌(Escherichia coli ) B0013-080A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh,AldhA)。在选择性培养基上选择培养出转化子。再在非选择性培养基上传代，筛选出选择性标记消失的转化子。提取转化子染色体DNA，用PCR验证目的基因突变，获得转化子大肠杆菌(Escherichia coli ) B0013-090A ( Δ pf IB, Δ did, Δ frd, Δ ack-pta, Δ adh, Δ IdhA,Λ thiE)并用于后续研究。实施例3—辅因子添加浓度对菌体生长的影响发酵液中添加不同浓度的辅因子(如VB1，硫辛酰胺等)对本发明中所涉及的菌种大肠杆菌(Escherichia coli)B0013_090A的生长状况的影响。当辅因子浓度低于10ng/L时，已经对菌体生长产生了严重的抑制作用。实施例4——B0013-090A发酵产α -酮戊二酸情况
发酵工艺采用具体实施方式
中建立的控制策略。菌种大肠杆菌(Escherichiacoli)B0013-090A发酵36h后α -酮戊二酸产量已超过6%，发酵48h后α -酮戊二酸产量接近9%。
权利要求
1.一株产a -酮戍二酸的菌株，其分类命名为大肠杆菌{Escherichia coli )B0013-090A，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO M 2012173，动态调控发酵过程，该菌株在添加丙酮酸脱氢酶系辅因子的情况下在好氧培养阶段快速生长，在发酵产酸阶段菌体生长受限快速合成a-酮戊二酸。
2.用权利要求I所述的产a-酮戊二酸的菌株发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于出发菌株为本发明构建的a -酮戊二酸高产菌株CCTCC NO M 2012173，动态调控发酵过程，丙酮酸脱氢酶系辅因子在发酵开始添加，发酵过程中不再添加，丙酮酸脱氢酶系辅因子的添加量为广200 ng/L ;在发酵初期的8 12h内，培养温度控制在2(T30°C，pH维持7. 0，初始糖浓度为3%，充分供氧控制溶氧不低于30%，该阶段菌体利用葡萄糖快速生长，检测糖浓度低于0. 2%时，停止通氧；之后为厌氧发酵阶段，培养温度控制在37 45°C，pH维持7. 2，停止供氧并两次分批补加葡萄糖至终浓度10%，控制第二次补糖前残糖不低于1%，该阶段菌体利用葡萄糖快速合成a -酮戊二酸；发酵36 48h产a -酮戊二酸水平达到9%，a -酮戊二酸的化学纯度达到95%以上，几乎无其它有机酸产生。
3.根据权利要求2所述的发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于好氧阶段菌种较完全的利用葡萄糖快速生长，形成菌体，但不形成各种副产有机酸；厌氧阶段菌体保持较高活性，快速利用葡萄糖合成a -酮戊二酸，并几乎不形成其它有机酸。
4.根据权利要求2所述的发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于发酵过程中多个工艺参数被调控，所涉及到的工艺参数包括温度、pH、溶氧、残糖和丙酮酸脱氢酶系辅因子。
5.根据权利要求2、3、4所述的发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于主要应用于大肠杆菌，但不仅仅局限于大肠杆菌，还应用于芽孢杆菌类细菌、肠杆菌科细菌、或酵母。
6.根据权利要求2、3、4所述的发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于主要应用于代谢葡萄糖合成a -酮戊二酸，但不仅限于此，还能代谢木糖、淀粉水解液、纤维素水解液、糖蜜或生物柴油副产甘油之多种碳源，或用于合成L-乳酸、丙酮酸、苹果酸、丁二酸、D-丙氨酸之一种。
7.根据权利要求2所述的发酵生产a-酮戊二酸的方法，其特征在于发酵生产过程全程采用质量浓度25%的Ca(OH)2调节pH，好氧阶段的控制过程不通过测定菌体量而通过检测残留葡萄糖的浓度来确定转厌氧的节点。
全文摘要
一株产α-酮戊二酸的菌株及用其发酵生产α-酮戊二酸的方法，属于微生物基因工程技术领域。本重组菌命名为大肠杆菌(Escherichiacoli)B0013-090A，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNOM2012173，该菌株由大肠杆菌(Escherichiacoli)B0013-070B(保藏编号CCTCCNOM2012071)经基因工程改造获得。用其动态调控发酵生产α-酮戊二酸，发酵36~48h产α-酮戊二酸水平达到9%，且所产α-酮戊二酸化学纯度达到95%以上。该工艺以葡萄糖或淀粉、糖蜜或生物柴油副产甘油为原料，工业化生产α-酮戊二酸，其使用价值非常巨大。本发明发酵培养基简单清洁，既有利于降低生产成本，也有利于简化后提取步骤获得高品质产品。操作工艺简单易行，有利于在工业化规模生产中推广使用。
文档编号C12R1/19GK102676438SQ20121018901
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者周丽, 沈微, 王正祥, 田康明 申请人:江南大学