鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用的制作方法

专利名称：鲇生长激素与穿肠膜肽tat融合蛋白及制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物工程技术领域，具体涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白的制备方法，还涉及一种表达saGH-TAT重组融合蛋白的基因工程菌，还涉及一种saGH-TAT重组融合蛋白在促进鱼类生长中的应用。
背景技术：
生长激素(Growth Hormone, GH)是一类由中腺垂体细胞分泌的单链肽类素,本质是蛋白质。GH广泛存在于脊椎动物(哺乳纲，鸟纲，爬行纲，鱼纲等)中，在多种重要的内分泌调控活动中起着重要的作用，尤其表现在促进鱼体快速生长上，由于在鱼类养殖业上的广泛前景，因而从其被发现开始一直成为研究的热点。大量生长激素可以通过重组生长激素基因工程菌发酵而获得。鱼类生长激素基因在大肠杆菌中的表达，最早是由Sakine在1985年完成的，诱导表达的生长激素蛋白产物占·细胞总蛋白的15%。随后，虹鳟、鲑、罗非鱼等的生长激素也在大肠杆菌中相继获得表达。有两类方法推动着鱼类生长激素基因体外表达向应用发展其一是表达效率的提高，根据大肠杆菌偏爱密码子和已知的草鱼生长激素氨基酸序列，人工合成草鱼生长激素cDNA,并构建表达载体pET-GH，转化BL21 (DE3)，在T7启动子的驱动下，通过诱导，获得的草鱼生长激素表达量占细胞总蛋白量的40%其二是采用可作为饵料的表达系统Kawata等构建另一类表达载体pQSGl,在藻类(Agmenellum quadruplicatum)中表达重组的鲑鱼生长激素，表达量占细胞蛋白含量的O. 1%。Tsai构建了重组金枪鱼生长激素cDNA的杆状病毒载体ρΗΜ，在多聚角蛋白启动子的调控下，在昆虫细胞内表达，表达量占细胞总蛋白的2%-8%新型表达载体的研制和应用，可以获得更高表达量的外源蛋白。酵母是单细胞低等真核生物，它不仅具备原核细胞增殖快、易培养、便于基因工程操作等特性，同时又具有真核生物的蛋白质翻译后加工的功能和重组蛋白正确折叠的细胞内环境，加之酵母粉本身就是非常好的单细胞蛋白饵料添加剂，富含各种必需的氨基酸、维生素。因此，以酵母作为生长激素的表达宿主菌，在生产中更具有价值！啤酒酵母首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，但在大量表达外源蛋白时，性状不够稳定，质粒易于丢失，不适合高密度培养。甲醇营养性酵母(Pichia pastoris)，又称毕赤酵母，可利用烷烃类化合物来生产单细胞蛋白，成熟的大规模发酵技术已经建立。生长激素直接投喂给鱼苗，可以促进鱼体的生长，表明生长激素多肽可以活性成分的形式进入鱼体。研究发现，鱼类小肠上皮细胞可以通过胞饮作用吸收大分子并转移进入血液循环。给虹鳟投喂重组鲑鱼生长激素，虹鳟的体重和体长明显高于对照。通过荧光标记生长激素进一步确证，虹鳟的后肠是吸收生长激素的部位。在生长激素通过胃和肠道前部时，其中大部分被降解，余下的小部分到达后肠并进入血液循环。当生长激素以抗酸多聚物包被后投喂鱼，鱼体血液中的生长激素水平以及鱼的生长速度都明显提高。鲤科鱼类与鲑科鱼类不同的是没有胃，灌喂不同鱼同样浓度的辣根过氧化物酶，发现鲤鱼血浆中的辣根过氧化物酶是虹鳟血浆的1000倍。所以生长激素在投喂给鲤科鱼类时，可以有更多的生长激素蛋白分子到达后肠而被吸收。近年来发现有一些小分子的多肽可以介导外源物质穿过细胞膜，这种小分子多肽被称之为细胞穿膜肽(cell penetrating peptides, CPP)。许多CPP都是来源于某些直接与宿主细胞相互作用的病毒结构蛋白的蛋白转导结构域(protein transductiondomains，PTD)。现在研究最多、应用范围最广的细胞穿膜肽来源于人免疫缺陷病毒I型(HIV-1)的转录激活因子(Trans-activating transcriptional activator, Tat)。Tat 蛋白中存在3个功能结构域，分别是位于N-端的酸性区，主要起反式激活的功能；位于第22-37位氨基酸之间的DNA结合区，该区域富含半胱氨酸；位于第47-60位氨基酸之间的碱性区，是主要的蛋白转导结构域，参与Tat蛋白的细胞内化作用。Tat蛋白共有86个氨基酸，是HIV复制所必需的调节因子。Schwarze发现位于Tat蛋白中第47_57位之间的11个氨基酸YGRKKRRQRRR不仅能够独立穿过细胞膜，而且其穿 膜效率比全长的Tat蛋白还要高。这段多肽即是TAT穿膜肽。不管是单独的TAT穿膜肽，或者是携带其他大分子物质如蛋白质、寡聚核苷酸或脂质体等，在穿膜时都可以表现出较高的穿膜活性。在携带外源物质穿膜时，TAT介导的穿膜似乎与其要携带的分子大小无关，100KD的蛋白质、40nm大小的纳米颗粒、甚至200nm大小的脂质体都可以经TAT运载入细胞内。而且，以这种方式运输到细胞内的脂质体甚至可以在进入细胞内Ih后仍然可保持结构的完整性。相反的，没有与TAT穿膜肽连接的物质在与细胞共同孵育时均不能够进入细胞内。TAT穿膜肽的序列中由于有6个精氨酸和2个赖氨酸残基，因此是带有高度正电荷的多肽。以不带电荷的丙氨酸替代其中的任何一个碱性氨基酸残基都会使穿膜活性降低，而替代序列中的其他氨基酸残基时穿膜活性则不会发生改变。这说明TAT穿膜肽所带的正电荷是其穿膜功能所必需的，因此推测这些正电荷很可能是能够与真核细胞的细胞膜发生强的静电作用，从而介导了穿膜过程。对TAT穿膜肽的亲和性分析发现，它能够与许多细胞膜表面的阴离子通过静电作用强烈地结合，与之结合的细胞表面分子可以是核仁素、蛋白聚糖等。精氨酸丰富的多肽可以穿过细胞膜，而其他氨基酸如赖氨酸、组氨酸等丰富的多肽却不具有此功能。然而，由精氨酸组成的支链聚合物与直链聚合物具有同样的穿膜效率。此外，研究发现TAT穿膜肽不会因为手性结构的改变而影响其穿膜活性，其手性分子与自然结构具有相同的穿膜活性。这说明这种细胞穿膜肽很可能不依赖于特定的结合位点。然而，多肽的长度是影响穿膜效率的重要因素。穿膜效率与精氨酸的个数有关，含有6个或者更多精氨酸的多肽要比含有少于5个精氨酸多肽的穿膜效率高一些，在多肽小于15个氨基酸时，穿膜效率会随着多肽大小的增加而增强。大于15个氨基酸的多肽虽然也可具有穿膜活性，但其效率却会明显减小。尽管对于TAT穿膜肽的穿膜功能研究的比较多，但是到目前为止，关于TAT穿膜肽进入细胞的分子机制还没有完全研究清楚。早期研究认为是通过直接转运机制穿过细胞膜，且是不依赖于能量的，但最近的研究也有与这一观点不同的结果。尽管其进入细胞的机制还没有完全研究透彻。尽管TAT穿膜肽的应用已经十分广泛，但利用TAT携带鱼的生长素跨肠膜并显著提高鱼的产量国内外还没有报道
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种SaGH-TAT融合蛋白，其氨基酸序列为SEQ IDNO. 2所示。该融合蛋白能够增强盐水的耐受能力，比表达的saGH蛋白在耐渗透压的能力上更强，可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 GH的利用效率，同时也提高了药效。本发明的目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株，大肠杆菌(Escherichiacoli) BL21 (DE3) pET-22b(+)-saGH-TAT, ΓοπιρΤ hsdSB (rB mB0 gal dcm(DE3)，保藏编号CCTCC NO M 2012126，该菌株能表达saGH-TAT的融合蛋白，其能显著促进鱼体生长，效率
高,安全性好。本发明的另一个目的是在于提供了一种融合蛋白saGH-TAT的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。 本发明的再一个目的是在于提供了一种大肠杆菌基因工程菌株在促进硬骨鱼体(鲇鱼、黄颡鱼、罗非鱼、鲤鱼、草鱼)生长中的应用，能够高效利用生长激素添加剂并且快速提高鱼体增重。本发明还有一个目的是在于提供了一种分离重组的鲇生长激素与穿肠膜肽融合蛋白在增强罗非鱼耐高渗透压海水的研究中的应用。为了达到上述的目的，本发明采用以下技术措施本发明的创新之处在于，本发明利用大肠杆菌表达TAT跨膜域和saGH的融合蛋白，意在促进鲇科鱼类的生长。通过基因工程生产的saGH-TAT融合蛋白可以作为鱼类养殖中的促生长剂，能够显著提高对鱼体的生长速率。本发明另一个创新之处在于，将TAT穿膜肽和saGH融合表达，由于TAT穿膜肽可以携带外源蛋白穿过细胞膜，因此将saGH-TAT经口投喂鱼后该融合蛋白可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH (Growth Hormone, GH)可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 GH的利用效率，同时也提高了药效。TAT穿膜肽目前还没有直接应用于养殖业，但其独特的穿膜效率十分具有吸引力。而且本发明公开的基因工程菌株的构建方法可以应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。一种融合蛋白saGH-TAT的制备方法，其步骤是A、鲇生长激素基因的制备首先切取已处死的鲇(人工养殖南方大口鲇)头部洗净备用，用刀从口劈开头部，使上颌部和下颌部分开，在上颌部的腹面有一长管状的骨骼为鲇副蝶骨，将刀横搁在副蝶骨的一端，用锤轻敲刀背两至三下，刀口深度约为2-3mm，副蝶骨的另一端同法敲击，然后将刀口轻轻扭动，就可以将副蝶骨扭下，便可获得完整的脑垂体。根据GeneBank中已经发表的鲇科鱼类GH的序列(GenBank:AY157496. I)设计PCR引物，以上述脑垂体提取的RNA作为模板反转出cDNA, PCR扩增目的基因silurus asotus growthhormone gene (saGH)，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pMD18_T(购自Takara公司)载体中，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含saGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。B.通过重叠延伸PCR的方法将TAT 33bp碱基连入saGH的3’端构成saGH_TAT，将PCR产物组装入pMD18-T载体，得到重组载体pMD18-T-saGH-TAT，然后转化大肠杆菌 JM109 (recAl, endAl, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44,relAl, Δ (lac-proAB)/F’ [traD36, proAB+, lac Iq, IacZ Δ M15],购自novagen公司),挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序。得到的阳性克隆子即为包含saGH-TAT的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏。
C.融合基因的制备及表达载体的构建首先双酶切重组质粒pMD18-T-saGH-TAT和质粒pET_22b ( + )(购自novagen公司，amp1")，胶回收含saGH-TAT基因的片段和开环pET-22a ( + )片段，16°C连接后转化到感受态 E. coli BL21 CF-, ompT, hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，所得到的阳性克隆子是本发明涉及的saGH-TAT融合基因的大肠杆菌，命名为 BL21 (DE3 ) pET-22b (+) -saGH-TAT。D.基因工程菌的制备将质粒pET_22a ( + ) -saGH-TAT转化到感受态BL21(DE3) CF-, ompT，hsdS (rBB-mB —)，gal, dcm (DE3))中，PCR 鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达saGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET-22b (+)-saGH-TAT,申请人已于2012年4月20将该菌送至中国典型培养物保藏中心保藏，地址中国武汉武汉大学，保藏编号=CCTCC NO M 2012126，分类命名大肠杆菌BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,F^ompT hsdSB (rB_mB0 gal dcm(DE3) ,Escherichia coli B L21(DE3) pET_22b (+) -saGH-TAT, F ompT hsdSB (rB mB) gal dcm (DE3)。一种大肠杆菌基因工程菌株BL21 (DE3)pET_22b(+)-saGH-TAT，能够在常规的大肠杆菌培养基中生长，并具有氨苄抗性，代谢正常，经过IPTG诱导后能大量分泌saGH-TAT蛋白。E.基因工程融合蛋白的制备将上述基因工程菌转接到2XYT培养基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵体的形式高效表达。获得了基因工程融合蛋白saGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株后经过破碎纯化后能够简单的与各种饲料混合，直接口服投喂，促进鱼体生长。一种大肠杆菌基因工程菌株在促进硬骨鱼体(鲇鱼、黄颡鱼、罗非鱼、鲤鱼、草鱼)生长中的应用，其应用过程是I.促生长实验选取形体相似的罗非鱼苗(Oreochromis Niloticus),随机分成11组,每组20尾，放入80cmX60cmX20cm的饲养盆中，水温恒定25°C.每天换一次水。在实验处理之前让其在饲养盆中适应I周时间。11组处理如下I)非处理组； 2) O. 7% (w/v)生理盐水腹腔注射组；3) 5 μ g/g 体重 saGH-TAT 腹腔注射组；4) I μ g/g体重GH-TAT腹腔注射组；5)0. I μ g/g 体重 GH-TAT 腹腔注射组；6) 5 μ g/g体重saGH腹腔注射组；7) I μ g/g体重GH腹腔注射组；8)0. I μ g/g体重GH腹腔注射组；
9) I μ g/g 体重 saGH 口服组；10) I μ g/g 体重 saGH-TAT 口服组；11)0. 7%生理盐水口服组。每周测体长、体重,处理六周。另外，设定三组口服实验分别按照体重的10%比例投喂饲料，重组蛋白包封量为
5μ g/g体重。2.耐渗透压实验罗非鱼先在淡水中喂养，转入海水之前3天停止给鱼喂食。大小相似的鱼随机分 组(2 - 3g)，保证所有实验组中鱼体生长状况相似。纯化的saGH和saGH-TAT溶于自来水中。I)正常鱼体对海水海水渗透压耐受力将罗非鱼随机分成10组，每组5条，将鱼放入不同浓度的海水(O, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75，85，100%)中，统计不同大小的罗非鱼开始死亡时间和完全死亡时间。2)鲇生长激素(saGH和saGH-TAT)对海水存活力的影响将罗非鱼随机分成4组，每组20条，分别用浓度为2mg/L的saGH，saGH-TAT, BSA水溶液浸泡罗非鱼苗2小时和24小时后，直接将罗非鱼转到60%的海水中。统计2小时和24小时浸泡罗非鱼苗后在海水中鱼苗的存活率。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果I.本发明制备saGH-TAT融合蛋白能够增强盐水的耐受能力，比表达的saGH蛋白在耐渗透压的能力上更强，可以穿过肠细胞膜而进入血液中，使GH可以不经注射而直接进入血液中，通过血液在鱼体内的循环，使其融合蛋白到达不同的组织，增加了 GH的利用效率，同时也提高了药效。2. 口服添加生长激素(saGH-TAT)饲料，能够显著提升鱼体增长速率，相比于现有的单纯添加生长激素(saGH)，能够减少至少80%的蛋白用量，节约生产成本。3.本发明提供的融合蛋白saGH-TAT的制备方法，该方法可应用于大规模的养殖业中，表达量大，操作简单，成本低。


图I为鲇脑垂体RNA琼脂糖凝胶电泳图提取的RNA为3条带，自上而下分别为28S，18S和5S。图2-1为一种RT-PCR产物电泳结果示意图泳道I :DL2000Marker;泳道2-3: RT-PCR产物；泳道4 :阴性对照。获得了大小570bp左右的条带。图2-2 为一种质粒 pET22b (+) -saGH-TAT 构建图谱将获得的saGH基因片段连入pMD18T载体中后用PCR将TAT序列连入saGH 3’端，然后连入表达载体pET22b(+)中。图3 为一种 pET22b (+) -saGH/saGH-TAT PCR 及酶切鉴定示意图单酶切或双酶切以及PCR鉴定都能看到目的条带。
Ml: DIO, 000 ;泳道 I :pET22b (+)-saGH 质粒泳道;2 :pET22b (+)-saGH 质粒 NdeI 单酶切；泳道3: pET22b (+) -saGH 质粒 Ndel/Xhol 双酶切；泳道 4: pET22b (+) -saGH 质粒Ndel/PstI双酶切；泳道5: saGH PCR扩增产物泳道6: pET22b (+) -saGH-TAT质粒；泳道7:pET22b (+)-saGH-TAT 质粒 NdeI 单酶切；泳道 8 :pET22b (+)-saGH-TAT 质粒 Ndel/Xhol 双酶；泳道 9:pET22b(+)-saGH-TAT 质粒 Ndel/PstI 双酶切泳道 10:saGH_TAT PCR 扩增产物M2 D2000 图 4 为一种 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 在大肠杆菌中的表达 SDS-PAGE 图在22kd处和20KD处分别由目的蛋白saGH-TAT和saGH表达。泳道I:蛋白分子量标准(116. O, 66. 2，45. O, 35. O, 25. O, 18. 4，14. 4)；泳道2:BL21(DE3)/pET22b (+)未诱导；泳道 3: ImM IPTG 诱导 BL21 (DE3)/pET22b (+)4 小时菌体；泳道4: ImM IPTG诱导BL21 (DE3) /pET22b (+) 4小时上清；泳道5: ImM IPTG诱导BL21 (DE3) /pET22b (+) 4 小时沉淀；泳道 6: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 未诱导；泳道 7: ImM·IPTG 诱导 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小时菌体；泳道 8: ImM IPTG 诱导 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小时上清；泳道 9: ImM IPTG 诱导 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH 4 小时沉淀；泳道10:纯化saGH蛋白；泳道11: BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT未诱导；泳道 12: ImM IPTG 诱导 BL21 (DE3) /pET22b (+) -saGH-TAT 4 小时菌体；泳道 13: ImM IPTG诱导 BL21(DE3)/pET22b(+)-saGH-TAT 4 小时上清；泳道 14 lmM IPTG 诱导 BL21(DE3)/pET22b (+) -saGH-TAT 4 小时沉淀；泳道 15:纯化 saGH-TAT 蛋白。图5为一种兔抗saGH IgG纯化SDS-PAGE示意图获得了大小为55kd的蛋白条带。泳道I:蛋白分子量标准泳道2:纯化IgG泳道3:兔抗血清图6为一种蛋白质印迹分析图获得了单一免疫印迹条带。泳道I :saGH泳道2: saGH-TAT泳道3:空菌体图7为一种鲇鳃膜受体与GH结合曲线示意8为一种鲇鳃膜受体与GH-TAT结合曲线示意9为一种鲇肠膜受体与saGH/saGH-ΤΑΤ结合曲线示意10为一种鲇肝膜受体与saGH/saGH-ΤΑΤ结合曲线示意11为一种GH与活性或非活性受体结合实验示意12为一种鱼体重增长柱形图示意13为一种4周后鱼体重增长柱形示意14为8种常见淡水鱼GH亲缘关系图
具体实施例方式本实验所涉及的分子生物学方法为常规方法，为本领域人员所熟悉。本发明中未详细阐述的请参见《分子克隆实验指南》J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔等主编。实施例I :制备鲇生长激素基因，其步骤是I. I鲇脑垂体RNA的提取 按照TIANGEN RNA提取试剂盒操作，稍作改动，具体步骤如下 取样剪开鱼头骨,用镊子取出脑垂体,重约IOOmg ；
将脑垂体放入加有Iml的TRNzol的Eppendorf管中，用勻衆棒捣碎；将匀浆样品在20°C放置5min，使得核酸蛋白复合物完全分离；40C 12000rpm 离心 IOmin,取上清；加入O. 2ml氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15秒，室温(20_25°C，以下相同)放置3分钟；40C 12000rpm离心15min，样品会分成三层黄色的有机相，中间层和上层无色的水相，RNA主要在水相中，把水相(约600 μ I)转移到新的离心管中。在得到的水相溶液中加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20min ；
4°C 12000rpm离心IOmin,去上清。离心前RNA沉淀经常是看不见的，离心后在管侧和管底形成胶状沉淀；加入Iml 75% (V/V)乙醇(DEPC处理过的水配制)洗涤、沉淀。每使用Iml TRNzol至少Iml 75%乙醇对沉淀进行洗涤；40C 5000rpm离心3min，倒出液体，注意不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出；室温放置晾干(2_3min)，加入30μ lRNase-free ddH20,反复吹打、混匀，充分溶解 RNA。L2RNA 检测将提取的RNA与Loading Buffer混匀后在I. 5% (Μ/V)的琼脂糖凝胶，I X TAE电泳缓冲液，5V/cm的条件下电泳30min，紫外灯下观察RNA提取情况。RNA提取结果如图I。saGH克隆结果用鲇垂体提取总RNA作为模板，经反转后，获得了预期为570bp的DNA片段，如图2所示。鲇生长激素(saGH) cDNA合成；根据Toyobo公司RT-PCR试剂盒方法进行RNA热变性
0]igo{dT)2C)(10 pmol/pl)I μ
提取 RNA11 μ!
总体枳12 μ]65°C, 5min,立即置于冰上。反应液配置
权利要求
1.一种分离重组的基因，其特征在于其核苷酸序列为SEQ ID NO. I所示。
2.一种分离重组的融合蛋白，其特征在于其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。
3.—种表达权利要求2所述蛋白的大肠杆菌基因工程菌株，其特征在于大肠杆菌{Escherichia coli)BL21(DE3)pET-22b (+) -saGH-TAT,hsdSB(rBmB)gal dcm (DE3)；CCTCC NO M2012126o
4.权利要求2所述融合蛋白的制备方法，其步骤是 A.鲇生长激素基因的制备获取鲇头部脑垂体，根据GeneBank中已经发表的鲇科鱼类GH的序列设计PCR兼并引物，以上述脑垂体提取的RNA作为模板反转出cDNA，PCR扩增目的基因saGH，PCR产物通过DNA凝胶电泳检测，回收PCR产物并将其克隆到pMD18_T载体中，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含saGH基因的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏； B.通过重叠延伸PCR的方法将TAT33bp碱基连入saGH的3’端构成saGH-ΤΑΤ，将PCR产物组装入PMD18-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落用碱裂解法小量提取质粒进行酶切鉴定，并进行测序，得到的阳性克隆子即为包含saGH-TAT的大肠杆菌，用于基因的扩增和保藏； C.融合基因的制备及表达载体的构建首先双酶切重组质粒pMD18-T-saGH-TAT和质粒pET-22b ( + )，胶回收含saGH-TAT基因的片段和开环pET-22a ( + )片段，16°C连接后转化到感受态E. coli中，所得到的阳性克隆子是包含saGH-TAT融合基因的大肠杆菌； D.基因工程菌的制备将步骤C中制得的质粒pET-22a( + ) -saGH-TAT转化到感受态BL21 (DE3)中，PCR鉴定筛选出阳性转化子，所得阳性克隆即为本发明涉及的能够表达saGH-TAT的大肠杆菌基因工程菌株； E.基因工程融合蛋白的制备将上述基因工程菌转接到2XYT培养基中，融合蛋白saGH-TAT以包涵体的形式高效表达。
5.权利要求2所述融合蛋白在促进硬骨鱼体生长中的应用。
6.权利要求2所述的融合蛋白在增强罗非鱼耐高渗透压海水中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种鲇生长激素与穿肠膜肽TAT融合蛋白及制备方法和应用，特别是对于促进硬骨鱼类的生长和耐渗透压上的应用。融合蛋白的制备方法是从活鲇的脑垂体中提取RNA，然后经过RT-PCR获得包含编码GH基因成熟肽的cDNA片段,将GH与TAT连接后连入表达载体pET22b(+),在大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)中进行表达,获得的纯化融合蛋白通过投喂，注射或是浸泡等方式都能不同程度的提高鱼体生长速率，增强盐水的耐受能力。本发明相比于单纯的使用GH表达蛋白应用于鱼体，效果更佳。
文档编号C12N15/70GK102899342SQ20121018843
公开日2013年1月30日 申请日期2012年6月8日 优先权日2012年6月8日
发明者孟小林, 徐进平, 王健, 于京佑 申请人:武汉凯肽来生物科技有限公司