专利名称：固相合成胸腺肽α1的11肽阶段的缺失肽、非肽杂质及检测方法
技术领域：
本发明涉及固相合成胸腺肽α I中的缺失肽、非肽杂质及检测方法，尤其涉及固相合成胸腺肽α I的11肽阶段的缺失肽、非肽杂质及检测方法，属于固相合成胸腺肽α I领域。
背景技术：
胸腺肽α I是从胸腺素组分5 (TF-5)中分离出的一种活性多肽，由28个氨基酸残基组成，分子量为3108.37。在TF-5中，胸腺肽α I的含量为0.6%，是人体胸腺激素的重要活性组分。例如胸腺肽α I可调节T淋巴细胞发育、分化和成熟。此外，胸腺肽α I能修复受损的T淋巴细胞。虽然从TF-5中分离的胸腺肽α I无明显毒副反应，但由人工固相合成的市售胸腺肽αI可因不纯而造成不良反应。目前，人工固相合成胸腺肽αI的操作规程千篇一律，几乎没有优化空间。市售的保护氨基酸和相关试剂的纯度也足以支持人工固相合成高纯度胸腺肽α 。在操作规程不出差错的前提下，人工固相合成的胸腺肽α I是否纯，取决于它含的缺失肽的状况。与小分子药物不同，多肽的生物活性非常强。在人工固相合成的胸腺肽α I中，SP使存在微量的缺失肽也可造成严重的毒副作用。控制人工固相合成的胸腺肽α I的质量的关键是控制缺失肽。目前国内外既没有披露人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽状况，也没有公开测定人工固相合成的胸腺肽α I中的缺失肽的方法。这种状态不适应胸腺肽α I的临床地位。为了改善这种状况，保障胸腺肽α I的临床用药安全性，形成了本发明。
发明内容
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本发明的目的之一是提供一种能够准确、灵敏的检测固相合成胸腺肽α I的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质的方法；本发明的另一个目的是提供固相合成胸腺肽α I的11肽阶段的缺失肽谱；本发明的目的之三是将固相合成胸腺肽α I的11肽阶段的缺失肽谱应用于胸腺肽α I固相合成中的质量控制。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种检测固相合成胸腺肽α I的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质的方法，包括以下步骤:将固相合成胸腺肽α I的11肽阶段样品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在4.44min时出现峰面积为9.46%的峰或在14.86min时出现峰面积分别为8.19%的峰、则说明固相合成胸腺肽α I的11肽阶段中含有缺失肽；如果所获取的离子流谱在22.64min min时出现峰面积为0.91 %的峰，则说明固相合成胸腺肽α I的11肽阶段中含有非肽杂质。本发明所述的胸腺肽α I的11肽的氨基酸序列为SEQ ID N0.1所示。所述的梯度洗脱优选为用0.1%甲酸/乙腈梯度洗脱，流速为0.4ml/min，梯度为:0-5min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=97/3 ；5-30min, 0.1% 甲酸 / 乙臆=75/25。本发明方法中LC/MS联用仪中的LC采用Agilent 1200自动进样，Waters XterraRP18分析柱的规格为5 μ m，3.0 X 150mm ；LC/MS联用仪中的MS采用Bruker SolatixFT-1CR-MS，离子流检测器。本发明进一步提供了固相合成胸腺肽α I的11肽阶段的缺失肽谱，其氨基酸序列为 SEQ ID N0.2 或 SEQ ID N0.3 所示；本发明所提供的缺失肽谱或非肽杂质作为胸腺肽α I固相合成中的质量控制物，应用于提高固相合成胸腺肽α I的质量或纯度。本发明方法可以准确、灵敏的鉴别出固相合成胸腺肽α I的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质，可以有效地保障和控制胸腺肽α I的质量，在制备高纯度固相合成胸腺肽α I中有重要应用价值。
图1 胸腺妝 α I 十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的
离子流。图2 胸腺妝 α I 十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的质谱。图3 胸腺妝 α I 十一妝片段缺失妝 Glu-Lys-Lys-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。图4 胸腺 肽 α I 的^^一肽片段缺失肽 Glu-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn的质谱。图5与胸腺肽α I的十一肽片段共存的非肽杂质的质谱。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1固相合成胸腺肽α I1.制备 Fmoc-Asn (Trt)-Wang Resin称取IOg (3.lmmol) Wang Resin置于固相反应合成柱中。加入60ml DCM溶胀树脂lOmin，抽走DCM。用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。于磨口三角瓶中称取 5.5g(9.3mmol)Fmoc-Asn(Trt)和 1.38g(10.23mmol)HOBt，加入 50ml DMF 溶解。在冰水浴中冷却下加2.15ml (13.95mmol)DIC活化5min。将活化后的氨基酸加入用DMF洗好的树脂中，然后加入0.23g(1.86mm0l)DMAP，用氮气吹气进行搅拌，室温反应2-4h。反应结束后用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽干溶剂。取少量树脂，用甲醇收缩三次,真空干燥至恒重，测替代值，如替代值达到预期，将树脂用乙酸酐封闭未反应的羟基，封闭反应2-4h后，用DMF洗树脂三次，每次50ml，吹气两分钟，抽走溶剂。用甲醇收缩树脂三次，每次50ml,吹气5min,抽走溶剂,真空干燥至恒重,测替代值。如替代值达到预期。
2.Fmoc-Asn (Trt) -Wang Resin 的溶胀和脱 Fmoc上面得到的Fmoc-Asn(Trt)-Wang Resin并置于固相反应合成柱中，加60mlDCM溶胀lOmin，然后抽走DCM。用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。用浓度为20 %的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，一次脱3min，另一次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50mlDMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤Asn (Trt)-Wang Resin，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对節三酮显黄色。3.制备 Glu (OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin称取2.12g(4.98mmol) Fmoc-Glu (OtBu)和 0.74g(5.5mmol)H0Bt 于干燥磨 口三角瓶中，用50ml DMF溶解，溶液置冰浴冷却。加1.15ml (7.47mmol)DIC活化5min。然后将活化后的氨基酸加到上面得到的Asn(Trt)-Wang Resin中反应2h。抽走反应液。用DMF洗搽树脂，每次用50ml DMF，每次洗2min，共洗三次。树脂对茚三酮不显色。用浓度为20%的piperidine的DMF溶液脱Fmoc，共脱两次，每次50ml，第一次脱3min，第二次脱8min。然后用DMF洗涤树脂，每次用50ml DMF洗2min，共洗四次。最后用DCM洗涤树脂，每次洗2min，共洗两次。抽走溶剂。树脂对茚三酮显黄色。4.制备Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp (OtBu) -Thr (tBu) -SertBu) -Ser (tBu) -GIu- (OtBu) -1le-Thr (tBu) -Thr (tBu) -Lys (Boc) -Asp (OtBu) -Leu-Lys (Boc) -Glu (OtBu) -Lys (Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin按照制备Glu (OtBu) -Asn (Trt) -Wang Resin 的方法依次将 1.55g (4.98mmol)Fmoc-Ala，2.12g(4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，2.12g (4.98mmol)Fmoc-GIu (OtBu)，
2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,3.17g (7.47mmoI)Fmoc-Glu (OtBu)，3.50g (7.47mmoI)Fmoc-Lys (Boc)，4.67g (9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
4.23g (9.96mmol) Fmoc-Glu (OtBu)，4.67g (9.96mmol) Fmoc-Lys (Boc)，3.52g (9.96mmol)Fmoc-Leu, 4.09g(9.96mmoI) Fmoc-Asp (OtBu)，4.67g(9.96mmol)Fmoc-Lys (Boc)，
3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.96g (9.96mmol) Fmoc-Thr (tBu)，3.52g (9.96mmol)Fmoc_Ile，3.17g(7.47mmol)Fmoc-Glu(OtBu)，2.86g (7.47mmol)Fmoc-SertBu)，
2.86g(7.47mmol)Fmoc-SertBu)，2.97g(7.47mmol)Fmoc-Thr(tBu)，3.07g (7.47mmol)Fmoc-Asp (OtBu)，2.53g (7.47mmoI)Fmoc-Val,2.32g (7.47mmoI)Fmoc-Ala,
3.1Og (9.96mmol)Fmoc-Ala，4.09g(9.96mmol)Fmoc-Asp (OtBu)和 3.81 g (9.96mmol)Fmoc-Ser (tBu)偶联到 Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Wang Resin 上并脱 Fmoc。5.制备Ac-Ser (tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp (OtBu)-Thr (tBu)-Ser (tBu)-Ser (tBu) -Glu-(OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys (Boc)-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Val-Val-Glu (OtBu)-Glu (OtBu)-Ala-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-WangResin0°C下将1.18ml(12.45mmol)乙酸酐于干燥磨口三角瓶中与50ml DMF混合，然后加 0.44ml (2.49mmol) DIPEA 活化 5min。将活化后的乙酸酐与 Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys-(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-GIu- (OtBu) -Glu (OtBu) -Ala-Glu (OtBu) -Asn (Trt) -ffang Resin 反应 2h。抽走反应液。树脂用DMF洗涤4次，每次50ml DMF,每次洗2min。树脂用DCM洗涤2次，每次用50ml DCM,每次洗3min。抽走溶剂。树脂对茚三酮不显色。树脂用MeOH收缩3次，每次用50ml MeOH,每次收缩5min，抽干。得18.5g干燥肽树脂。低温保存。6.从Ac-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Ala-Ala-Val-Asp(OtBu)-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu) -Glu-(OtBu) -1le-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asp (OtBu)-Leu-Lys (Boc)-Glu (OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu)-Asn(Trt)-WangResin 切割胸腺肽 α I0°C下将18.5g干燥的肽树脂与180ml裂解液(TFA/TIS/H20)反应0.5h，室温反应2.5h。反应结束后，用砂芯漏斗过滤分离树脂。树脂用少量TFA洗涤三次。合并的滤液用(TC的1800ml的乙醚沉淀出胸腺肽α I粗品。离心分离出胸腺肽α I粗品。胸腺肽α I粗品用0°C的乙醚洗涤粗肽三次，用N2吹走残余乙醚，置于真空干燥器干燥至恒重，得6.27g胸腺肽α I粗品，收率为81%，含量为68%。试验例Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu (OtBu) -Asn (Tr t) -ffang Resin 的缺失肽谱的鉴定取少量Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Glu(OtBu)-Val-Val-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Ala-Glu-(OtBu)-Asn (Trt)-Wang Resin不经纯化,按照标准方法切割并脱保护。得到的胸腺妝 α I 的十一妝片段Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn在 LC (Agilent1200 自动进样，Waters Xterra RP18 分析柱，5 μ m, 3.0 X 150mm)/MS (Bruker SolatixFT-1CR-MS，离子流检测器)联用仪上进行分析。用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脱，洗脱梯度见表I。离子流谱见图1。图1由4个峰构成,它们分别出现在4.44min, 5.85min, 14.86min和22.64min，它们的峰面积分别为9.46%,81.43%,8.19%和0.91%。出现在5.85min的峰的对应的质谱图见图2，该离子的质量为1303.69768，是胸腺肽 α I 的^^一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 的理论质量数1302.63033 加 H。出现在4.44min的峰的对应的质谱图见图3，该离子的质量为587.81044X2，是胸腺肽 α I i^一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 缺失 Glu 理论质量数 1173.58774 加 2H。出现在14.86min的峰的对应的质谱图见图4，该离子的质量为1175.58020，是胸腺妝 α I 的十一妝片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 缺失 Lys 的理论质量数1174.53537加H。出现在22.64min的峰的对应的质谱图见图5，该离子的质量为1088.54119，没有与胸腺肽 α I 的十一肽片段 Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn 对应的缺失肽，为非肽杂质。
权利要求
1.一种检测固相合成胸腺肽α I的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质的方法，包括以下步骤:将固相合成胸腺肽α I的11肽阶段样品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在4.44min时出现峰面积为9.46%的离子流峰或在14.86min时出现峰面积分别为8.19%的离子流峰、则说明固相合成胸腺肽α I的11肽阶段中含有缺失肽；如果所获取的离子流谱在22.64min时出现峰面积为0.91%的离子流峰，则说明固相合成胸腺肽α I的11肽阶段中含有非肽杂质。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的胸腺肽αI的11肽的氨基酸序列为 SEQ ID N0.1 所示。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述的梯度洗脱为用0.1 %甲酸/乙腈梯度洗脱，流速为0.4ml/min,梯度为:0-5min,0.1%甲酸/乙腈=97/3 ；5-30min,0.1%甲酸/ 乙腈=75/25。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述LC/MS联用仪中的LC采用Agilent1200自动进样，Waters Xterra RP18分析柱的规格为5 μ m，3.0X 150mm ;LC/MS联用仪中的MS 米用 Bruker Solatix FT-1CR-MS,离子流检测器。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征在于:所述缺失肽的氨基酸序列为SEQID N0.2或 SEQ ID N0.3 所示。
6.固相合成胸腺肽αI的11肽阶段中的缺失肽谱，其特征在于:其氨基酸序列为SEQID N0.2 或 SEQ ID N0.3 所示。
7.权利要求6所述的缺失肽谱作为质量控制物提高固相合成胸腺肽αI的质量或纯度中的应用。
全文摘要
本发明公开了固相合成胸腺肽α1的11肽阶段的缺失肽、非肽杂质及检测方法。所述检测方法包括将固相合成胸腺肽α1的11肽阶段样品采用LC/MS联用仪进行梯度洗脱获取离子流谱；如果所获取的离子流谱在4.44min时出现峰面积为9.46％的峰或在14.86min时出现峰面积分别为8.19％的峰、则说明固相合成胸腺肽α1的11肽阶段中含有缺失肽；如果所获取的离子流谱在22.64minmin时出现峰面积为0.91％的峰，则说明固相合成胸腺肽α1的11肽阶段中含有非肽杂质。本发明可准确、灵敏的鉴别出固相合成胸腺肽α1的11肽阶段是否含有缺失肽或非肽杂质，可有效保障和控制胸腺肽α1的质量或纯度。
文档编号C07K7/06GK103163234SQ20121023951
公开日2013年6月19日 申请日期2012年7月12日 优先权日2012年7月12日
发明者朱正兵, 彭涛, 王玲, 张金花 申请人:海南合瑞制药股份有限公司