基因转运载体的制备方法

专利名称：基因转运载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种由厌氧性微生物构成的基因转运载体的制备方法，所述基因转运载体可用作实体瘤治疗剂，所述厌氧性微生物能够在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达(A)具有抗肿瘤活性的蛋白质、或(B)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质。此外，本发明还涉及含有根据该方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该基因转运载体的实体瘤治疗剂。
背景技术：
近年来，对使用基因转运载体治疗恶性肿瘤的方法进行了各种研究，例如，对于厌氧菌梭菌(Clostridium),公开了使用了转化菌的针对肿瘤部位的基因转运方法(例如，参照专利文献1、2)。同样的，对于厌氧菌双歧杆菌(Bifidobacterium),期待将该菌的转化子作为益生菌(Probiotics)或感染性疾病口服疫苗的载体的应用(例如，参照专利文献3)，另外，对于长双歧杆菌(Bifidobacterium longum),由于该菌在全身给药后蓄积在缺氧的实体瘤内，因而提示其可以用于治疗实体瘤(例如，参照非专利文献1、2)。另外，本发明人确认通过使用重组质粒pBLES100-S-e⑶进行转化，能够在重组微生物中表达胞嘧啶脱氨酶(EC3. 5. 4. I ;以下称为“⑶”)，所述重组质粒pBLES100-S-e⑶具有与来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白的启动子融合的大肠杆菌codA，所述胞嘧啶脱氨酶是将具有抗肿瘤活性的5-氟尿嘧啶(以下称为“5-FU”)的前药(前体)5_氟胞嘧啶(以下称为“5-FC”)转化为5-氟尿嘧啶的酶，并报道了可以期待该重组微生物，例如重组长双歧杆菌，在酶-前药疗法中的应用(例如，参照专利文献4和非专利文献3、4)。并且，为了将该⑶表达基因重组微生物应用到酶-前药疗法中，要求所述重组微生物对由⑶从5-FC转化的、至少是抗肿瘤活性有效浓度的5-FU有耐受性，因此，开发了表达⑶的5-FU耐受菌的制备方法，并进行报道(例如，参照专利文献5)。另一方面，对于这种CD，非专利文献5报道了在大肠杆菌中，编码CD的DNA内，引入将该CD的第314位(对应本发明的序列号28中的第315位)氨基酸从天冬氨酸替换为丙氨酸的突变之后，与突变前的野生型CD相比，突变的⑶将5-FC转化为5-FU的⑶活性增强至约2. 2倍(50/23)(参照非专利文献5Tablel.的中间部分)。针对在治疗恶性肿瘤中使用的重组菌的转化方法进行了各种报道，在上述文献中也报道了各种各样的转化菌的制备方法。例如，在专利文献3中报道了一种转化方法，其特征在于，包括下列步骤利用来源于双歧杆菌的质粒和来源于大肠杆菌的质粒制备在双歧杆菌和大肠杆菌中被相互复制的穿梭质粒的步骤、以及将编码目标蛋白质的目标基因连接到所述穿梭质粒进而制备重组载体的步骤；并且将制备所述穿梭质粒时使用的双歧杆菌用作被所述制备出的重组载体转化的宿主细胞。此外，例如，对于在构建所述重组质粒pBLES100-S-e⑶时使用的穿梭质粒PBLES100的制备方法，报道了由长双歧杆菌BK51的pTB6和大肠杆菌的pBR322构建的制备方法(例如，参照非专利文献6)。并且，公开了能够以与该穿梭质粒pBLESlOO相比超过100倍的高效率来转化长双歧杆菌的质粒PAVOOl和pBRASTAlOl的制备方法(例如，参照非专利文献7)。 像这样，虽然对可用于治疗恶性肿瘤的基因转运载体的制备方法进行了各种报道，但是所有报道都是限定了在转化中使用的微生物和质粒等的方法，而转化方法本身则使用普通的转化技术，另外，这些方法也是以制备能够在目标患部表达目标基因的转化微生物本身为目的的方法，例如制备能够在目标患部表达基因的转化微生物的方法，所述基因为具有抗肿瘤活性的蛋白质或具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的基因，至今还没有报道以提高由目标基因表达的蛋白质本身的活性或表达效率为目的的制备方法。专利文献I :美国专利第6416754号公报专利文献2 :美国专利第6652849号公报专利文献3 :日本专利特表2004-519236号公报专利文献4 :日本专利特开2002-97144号公报专利文献5 :国际公布2006/109619号公报非专利文献I :Yazawa et al. Cancer Gene Ther.，7，269-274 (2000)非专利文献2 :Yazawa et al. Breast Cancer Res. Treat. , 66, 165-170 (2001)非专利文献3 Nakamura et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，66，2362-2366 (2002)非专利文献4:Fujimori et al. , Curr. Opin. Drug Di scov.Devel.，5，200-203(2002)非专利文献5 :Sheri et al. , Protein Engineering, Design andSelection, 17(8):625-633(2004)非专利文献6:Matsumura et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，61，1211-1212 (1997)非专利文献 7 T a n a k a et al. , Biosci. Biotechnol.Biochem.，69(2):422-425 (2005)

发明内容
迄今为止报道的可用于治疗恶性肿瘤的基因转运载体的制备方法，均是以制备能够在目标患部表达目标基因的重组菌本身为目的的方法，例如制备能够在目标患部表达基因的重组菌的方法，所述基因为具有抗肿瘤活性的蛋白质或具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的基因，至今还没有报道以提高由目标基因表达的蛋白质本身的活性或表达效率为目的的制备方法。然而，在使用基因转运载体的治疗方法中，由导入到转化微生物中的基因所表达的蛋白质的活性和表达效率都是重要的问题，当然需要由该转化微生物的基因所表达的蛋白质具有与由原来的野生型微生物具有的基因所表达的蛋白质相同的活性，并且，与原来的微生物具有的基因相比，能够同等地或更好地进行表达。本发明的课题在于提供一种有效地制备基因转运载体的方法，该方法中，经由转化而导入的基因所表达的蛋白质活性和表达效率均良好。另外，本发明的课题在于提供含有该制备方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该耐受菌的实体瘤治疗剂。本发明人报道了制备转化微生物的下列方法首先，选择表达CD的基因作为目标基因，所述CD在具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质中；作为整合该目标基因的质粒，将具有表达该CD的基因的大肠杆菌的质粒与来源于长双歧杆菌的质粒融合，制备质粒pBLESlOO-S-e⑶；发现可期待将使用该质粒重组长双歧杆菌105A形成的长双歧杆菌105A/pBLES100-S-e⑶用作治疗恶性肿瘤的基因转运载体；作为该制备方法，在 通过整合目标基因来制备该基因表达载体的工序中，使用与基因的表达有关的启动子，所述基因为编码来源于长双歧杆菌的组蛋白样DNA结合蛋白质(以下也称为“HU蛋白质”)的基因，通过将目标基因整合在该启动子下游，进而能表达目标基因(专利文献4)。本发明人对上述方法进行了认真研究，发现作为整合目标基因的融合质粒，将含有复制该质粒时的必要部分、并且不包含在宿主范围扩大方面不理想的部分的片段进行融合来制备质粒，通过使用该质粒可提高转化率，所述质粒来源于大肠杆菌和长双歧杆菌的各种质粒。另外，本发明人还发现，在与基因的表达有关的启动子下游整合目标基因时，所述基因为编码该宿主微生物的组蛋白样DNA结合蛋白的基因，该目标基因必须在该基因的5/末端侧具有编码所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端区域的DNA片段，并且，该DNA片段必须含有编码至少4个氨基酸的DNA片段。具体来说，本发明人发现，在与编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的表达有关的启动子下游整合目标基因时，通过在该目标基因DNA的5'末端侧整合含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列，可以制备出与作为该目标基因标本来源的微生物相比，能够同等地或更好地表达具有活性的蛋白质的微生物，所述活性与作为该目标基因标本来源的微生物中的该基因产物(蛋白质)活性相同。并且，本发明人发现，在表达载体的制备工序中，通过使被整合的目标基因的DNA发生部分突变，可以产生具有更高活性的蛋白质，另外进一步发现，尤其是当该目标基因为表达具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质中的CD的基因时，通过使用5-氟尿嘧啶耐药菌作为宿主厌氧性微生物，所述5-氟尿嘧啶耐药菌至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶耐药性能，可以制备质粒保持率高的基因重组微生物，从而完成了本发明。也就是说，本发明涉及[I]基因转运载体的制备方法，所述基因转运载体由厌氧性微生物构成，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达(A)具有抗肿瘤活性的蛋白质、或(B)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质，其特征在于，该方法包括
制备融合质粒的工序(1)，所述融合质粒具有双歧杆菌属的质粒片段和大肠杆菌的质粒片段，在所述融合质粒上整合含有启动子和终止子的DNA片段的工序(2)，所述启动子和终止子为来源于双歧杆菌属细菌的、编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子，在上述启动子和终止子之间整合DNA制备表达载体的工序(3)，所述DNA为Ca)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，以及使用所述表达载体转化厌氧性微生物的工序(4 )，
在所述工序(3)的表达载体制备工序中被整合的、(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA是，在该DNA的5'末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽；[2]根据上述[I]记载的基因转运载体的制备方法，其中，组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽是，由序列号29的第I位到第4 18位中任意一位的氨基酸序列构成的肽；[3]根据上述[I]或[2]记载的基因转运载体的制备方法，其中，在工序(4)之前，还有使(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA发生突变的工序(5)；[4]根据上述[3]记载的基因转运载体的制备方法，其中，使(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA发生突变的工序(5)是使对工序(3)中制备的表达载体上整合的(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA发生突变的工序(5’)；[5]根据上述[1] [4]中任意一项记载的基因转运载体的制备方法，所述基因转运载体是由厌氧性微生物构成的基因转运载体，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质；[6]根据上述[1] [5]中任意一项记载的基因转运载体的制备方法，其中，具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质是胞嘧啶脱氨酶；[7]根据上述[6]记载的基因转运载体的制备方法，其中，由厌氧性微生物构成的基因转运载体是至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶耐药性能的表达胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶耐药菌；[8]根据上述[7]记载的基因转运载体的制备方法，其特征在于，至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶耐药性能的表达胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶耐药菌是，将至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶耐药性能的5-氟尿嘧啶耐药菌用作宿主从而制备的；[9]根据上述[1] [8]中任意一项记载的基因转运载体的制备方法，其中，含有编码由组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽的碱基序列的DNA片段是，含有序列号14或15的从第1482位到至少第1493位的碱基序列的DNA片段；[10]根据上述[9]记载的基因转运载体的制备方法，其中，含有序列号14或15的从第1482位到至少第1493位的碱基序列的DNA片段是，含有序列号15的从第1482位到第14931535中任意一位的碱基序列的DNA片段；[11]根据上述[1] [10]中任意一项记载的基因转运载体的制备方法，其中，厌氧性微生物是细菌；[12]根据上述[11]记载的基因转运载体的制备方法，其中，细菌是肠道细菌；[13]根据上述[12]记载的基因转运载体的制备方法，其中，肠道细菌是双歧杆菌 属细菌；[14]根据上述[13]记载的基因转运载体的制备方法，其中，双歧杆菌属细菌选自下列双歧杆菌属细菌中的任意一种青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animal is)> 婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、嗜热双歧杆菌(Bifidobacterium thermophilum)、假长双歧杆菌(Bifidobacterium pseudolongum)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、以及长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；[15]根据上述[13]或[14]记载的基因转运载体的制备方法，其特征在于双歧杆菌属细菌是长双歧杆菌；[16]根据上述[I] [15]中任意一项记载的基因转运载体的制备方法，其中，在工序(4)的转化中使用的表达载体是质粒pAVOOl-HU-eCD的单碱基突变导入质粒；[17]根据上述[16]记载的基因转运载体的制备方法，其中，质粒pAVOOl-HU-e⑶的单碱基突变导入质粒中编码CD的碱基序列是，编码氨基酸序列的碱基序列，所述氨基酸序列是序列号28中记录的大肠杆菌CD的氨基酸序列中与第315位相对应的氨基酸天冬氨酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列；[18]根据上述[17]记载的基因转运载体的制备方法，其中，其他氨基酸是丙氨酸；[19]根据上述[18]记载的基因转运载体的制备方法，其中，质粒pAVOOl-HU-e⑶的单碱基突变导入质粒是质粒pAV001-HU-eCD-M968。另外，本发明涉及[20]由表达载体转化的厌氧性微生物构成的基因转运载体，其中，所述表达载体具有双歧杆菌属细菌的质粒的片段、大肠杆菌的质粒的片段、以及来源于双歧杆菌属细菌且含有编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子的DNA片段，在所述启动子和终止子之间具有(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，并且在(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA的5'末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽；[21]通过上述[1] [19]中任意一项的制备方法制备的厌氧性微生物的基因转运载体，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且具有(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA;[22]根据上述[20]或[21]记载的基因转运载体，其中，厌氧性微生物是双歧杆菌属细菌；[23]根据上述[22]记载的基因转运载体，其中，双歧杆菌属细菌选自下列双歧杆菌属细菌中的任意一种青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、以及长双歧杆菌；
[24]根据上述[22]或[23]记载的基因转运载体，其中，双歧杆菌属细菌是长双歧杆菌；[25]根据上述[20] [24]中任意一项记载的基因转运载体，该基因转运载体可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且可以表达具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质；[26]根据上述[25]记载的基因转运载体，其中，具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质是胞嘧啶脱氨酶；[27]根据上述[26]记载的基因转运载体，该基因转运载体是至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-氟尿嘧啶耐药性能的表达胞嘧啶脱氨酶/5-氟尿嘧啶耐药菌；[28]根据上述[26]或[27]记载的基因转运载体，该基因转运载体是长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-eCD的质粒单碱基突变体；[29]根据上述[28]记载的基因转运载体，其中，长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-eCD的质粒单碱基突变体是长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-eCD_M968。并且，本发明涉及[30]药物组合物，其含有根据上述[20] [29]中任意一项记载的基因转运载体；[31]药物组合物，其组合有根据上述[25] [29]中任意一项记载的基因转运载体、以及被该基因转运载体能够表达的上述蛋白质转化为抗肿瘤物质的抗肿瘤物质前体；[32]根据上述[31]记载的药物组合物，其中，所述基因转运载体是根据上述[25] [29]中任意一项记载的基因转运载体，抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。并且进一步地，本发明涉及[33]实体瘤治疗剂，其含有用于表达具有有效治疗量的抗肿瘤活性的蛋白质的、足够量的基因转运载体，所述基因转运载体是上述[20] [24]中任意一项记载的基因转运载体。[34]实体瘤治疗剂，其组合有用于表达能够从抗肿瘤物质前体转化为有效治疗量的抗肿瘤物质的量的所述蛋白质的、足够量的基因转运载体，和被该基因转运载体能够表达的所述蛋白质转化、且能够转化为有效治疗量的抗肿瘤物质的量的抗肿瘤物质前体，所述基因转运载体是上述[25] [29]中任意一项记载的基因转运载体；[35]根据上述[34]记载的实体瘤治疗剂，其中，所述基因转运载体是根据上述 [29]中任意一项记载的基因转运载体，抗肿瘤物质前体是5-氟胞嘧啶。并且，在本申请说明书中，(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，在以下有时也称为“编码目标蛋白质的DNA”。
根据本发明，可以高效地制备蛋白质活性和表达效率均良好的基因转运载体，所述蛋白质是经由转化而导入的基因所表达的，该基因转运载体可用作实体瘤治疗剂，由厌氧性微生物构成，所述厌氧性微生物能够在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达具有抗肿瘤活性的蛋白质、或具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质。对恶性肿瘤等的患者给予本发明的基因转运载体时，作为本发明的基因转运载体的厌氧性微生物在肿瘤内增殖，从而表达目标蛋白质。当目标蛋白质为具有抗肿瘤活性的蛋白质时直接发挥抗肿瘤效果，另一方面，当目标蛋白质为具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质时，如果使基因转运载体和抗肿瘤物质前体在肿瘤部位共存，那么被该基因转运载体表达的目标蛋白质就将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质，从而发挥抗肿瘤效果。
当具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质为CD时，作为抗肿瘤物质前体优选使用5-FC。由CD将5-FC转化为5-FU，5-FU进而发挥优异的抗肿瘤效果。通过全身给药的途径全身性地给予能得到充分抗肿瘤效果的量的5-FU时，会产生全身性副作用，但是如果使用本发明的基因转运载体，可以将几乎不产生副作用的5-FC肿瘤部位特异性地转化为5-FU，因此与直接给药5-FU的情况相比，可以在肿瘤内实现非常高的5-FU浓度，其结果为可以得到极其优异的抗肿瘤效果。但是，并不是只要利用表达⑶的基因转运载体在肿瘤部位将5-FC转化为5-FU，就能立刻得到可实用化水平的肿瘤治疗剂。这样的肿瘤治疗剂的抗肿瘤效果和实用性很大程度地受3个要素的影响。即，作为基因转运载体的厌氧性微生物的菌体量、该厌氧性微生物发挥的CD活性的程度、肿瘤部位5-FC的浓度。虽然5-FC和厌氧性微生物的给药量越多，就应该得到越强的抗肿瘤效果，但是从尽量降低副作用的观点出发，最好在得到必要的抗肿瘤效果的范围内尽量减少5-FC的给药量，至少需要少于临床确认的用量。另外，对于厌氧性微生物，从将对人体的影响降低到最小限度的观点出发，无论使用毒性多么低的厌氧性微生物，最好在能够得到必要的抗肿瘤效果的范围内尽量减少用量。根据这些情况，现有技术的抗肿瘤剂采用利用表达CD的基因转运载体在肿瘤部位将5-FC转化为5-FU的方法，因此临床水平上的实用性全都不够。例如，在专利文献4的实施例4中，小鼠的治疗实验使用的5-FC的浓度为500mg/kg，在该浓度下能得到有效且足够的抗肿瘤效果。但是，从共和药品工业株式会社的深部真菌病治疗剂7 > 3千…ANC0TIL (含有日本药典氟胞嘧啶(Flucytosine) 500mg)的用法和用量的记载“在真菌血症、真菌性脑膜炎、真菌性呼吸系统感染症、黑色真菌病中，通常作为氟胞卩密唳(Fluorocytosine), I日10(T200mg/kg分4次口服给药。在尿路真菌病、消化道真菌病中，通常作为氟胞嘧啶，I日5(Tl00mg/kg分4次口服给药。”中也得知，临床试验中能实际确认的5-FC的最大用量为200mg/kg。因此，为了利用专利文献4实施例中使用的实验系统以5-FC的临床用量(200mg/kg)来得到足够的抗肿瘤效果，酶活性至少需要增强至
2.5 倍(=500/200 X另一方面，非专利文献5虽然报道了大肠杆菌中，在编码⑶的DNA内，引入将该⑶的第314位(对应于本发明的序列号28中的第315位)氨基酸从天冬氨酸替换为丙氨酸的突变之后，与突变前的野生型⑶相比，突变的⑶将5-FC转化为5-FU的⑶活性(kcat/Km值)增强至约2. 2倍(50/23)，但是这种增强效果用于解决上述课题仍然是不够的。但是，本发明的基因转运载体中，使编码目标蛋白质CD的DNA的5'末端侧进一步具有含有喊基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由上述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽，并且，使该CD的上述序列号28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替换后，完全出乎意料，该CD活性增强至约12倍。如果以上述实验结果为标准来计算该CD活性12倍的增强，那么5-FC给药量就为约42mg/kg，也就是说在最小临床用量(50mg/kg)以下即可，因此可以期待极高的实用性。因此，在本发明的基因转运载体中，使编码目标蛋白质⑶的DNA的5，末端侧进一步具有含有喊基序列的DNA片段，所述喊基序列编码由上述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽，并且，该CD的上述序列号28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替换的基因转运载体(例如长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-eCD-M968)，期待其具有特别优异的实用性。
实际上，在人乳腺癌细胞株(KPL-I)移植裸鼠的治疗系统中使用专利文献4中使用的具有未发生突变的⑶的基因转运载体(重组双歧杆菌)时，能够确认为了在肿瘤内从5-FC转化为有效浓度的5-FU，必要的菌浓度为107CFU/g以上，但本发明的基因转运载体中，进一步通过本发明人的实验可以确认，把该CD的上述序列号28中第315位的天冬氨酸被丙氨酸替换的基因转运载体用于相同的实验系统中时，以上述菌浓度的百分之一的浓度105CFU/g，就可以得到相同的肿瘤内5-FU浓度。


图I是表示长双歧杆菌105A/pAV001-HU_e⑶的制备过程的示意图。图2是表示长双歧杆菌105A/pAV001-HU_e⑶中⑶活性(从5-FC转化的5-FU的浓度)的示意图。图3是表示HU蛋白N末端添加2氨基酸的质粒的构建过程的示意图。图4是表示2种作为5-FU耐受菌的长双歧杆菌105A/pAV001-HU_e⑶-M968的质粒保持率的结果示意图。
具体实施例方式本发明的基因转运载体的制备方法是指由厌氧性微生物构成的基因转运载体的制备方法，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达(A)具有抗肿瘤活性的蛋白质、或(B)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质，其特征在于，该方法包括制备融合质粒的工序(1)，所述融合质粒具有双歧杆菌属细菌的质粒片段和大肠杆菌的质粒片段，在所述融合质粒上整合含有启动子和终止子的DNA片段的工序(2)，所述启动子和终止子为来源于双歧杆菌属细菌的、编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子，在上述启动子和终止子之间整合DNA制备表达载体的工序(3)，所述DNA为Ca)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，以及使用所述表达载体转化厌氧性微生物的工序(4 )，在所述工序(3)的表达载体制备工序中被整合的、(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA是，在该DNA的5'末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽。本发明的基因转运载体的制备方法只要是下述方法，就没有特别限制该方法包括制备融合质粒的工序(1)，所述融合质粒具有双歧杆菌属细菌的质粒片段和大肠杆菌的质粒片段；在所述融合质粒上整合含有启动子和终止子的DNA片段的工序(2)，所述启动子和终止子为来源于双歧杆菌属细菌的、编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子；在上述启动子和终止子之间整合DNA制备表达载体的工序(3)，所述DNA为(a)编码具 有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA;以及使用所述表达载体转化厌氧性微生物的工序(4);并且，该方法在所述工序(3)的表达载体制备工序中被整合的、Ca)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b )编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA是，在该DNA的5/末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽。本发明的基因转运载体的制备方法如果包括上述工序(I) 工序(4)就没有特别限制，只要不损害本发明的效果，也可以具有其他的任意工序。另外，在本发明基因转运载体的制备方法中，工序(2)和工序(3)的先后顺序不受限制，可以按照(1)、(2)、(3)、(4)的顺序具有这些工序，也可以按照(1)、(3)、(2)、(4)的顺序具有这些工序。为方便起见，本发明的基因转运载体的制备方法中包含这两种方式。特别是，在工序(3)的表达载体制备工序中，当整合编码目标蛋白质的DNA时，作为使编码该目标蛋白质的DNA的5'末端侧具有编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段的方式可为任意方式，例如，可以是下列方式在编码该目标蛋白质的DNA的5'末端侧添加整合编码所述HU蛋白质N末端区域的DNA片段，也可以是下列方式在编码所述HU蛋白质的DNA的中间位置整合编码该目标蛋白质的DNA，再在编码HU蛋白质N末端区域的DNA和编码HU蛋白质C末端区域的DNA之间插入编码目标蛋白质的DNA。并且，在工序(3)的表达载体制备工序中，使编码目标蛋白质的DNA5'末端侧具有编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段时的顺序，只要能得到在编码目标蛋白质的DNA的5'末端侧具有编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段的表达载体，就没有特别限制，例如，可以在使编码目标蛋白质的DNA的5，末端侧具有编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段之后，再将该DNA整合到融合质粒上，也可以在融合质粒上整合编码目标蛋白质的DNA之后，再将编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段整合到编码目标蛋白质的DNA的5'末端侧，还可以在融合质粒上整合编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段之后，再将编码目标蛋白质的DNA整合到编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段的3'末端侧。另外，只要能得到本发明的效果，编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段的3'末端侧和编码目标蛋白质的DNA的5'末端侧可以不直接结合在本发明的表达载体上，但优选直接结合的方式。
编码目标蛋白质的DNA的5'末端侧具有的、编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段如果太长，那么表达的目标蛋白质的性质就有发生变化的可能性，因此从这个观点出发，优选尽量短的编码HU蛋白质N末端区域的DNA片段，但是如果太短又会降低蛋白质的表达率，因此从这两方面的观点出发优选采用平衡较好的适当长度。具体来说，如果是含有喊基序列的DNA片段，所述喊基序列编码所述HU蛋白质N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽，就没有特别限制，但优选为含有编码所述HU蛋白质N末端的第I位到第4 18位中任意一位的氨基酸序列所构成的肽的碱基序列的DNA片段。在序列号29中记载了 HU蛋白质N末端的第I位到第18位的氨基酸序列。序列号29的氨基酸序列为序列号15的第1482位到1535位的碱基序列编码的氨基酸序列。作为具有含有喊基序列的DNA片段的质粒，所述喊基序列编码HU蛋白质N末端的第I位到第4位氨基酸序列构成的肽，例如可以列举pAV001-HU4aa-eCD (序列号14)，作为 具有含有碱基序列的DNA片段的质粒，所述碱基序列编码HU蛋白质N末端的第I位到第9 位氨基酸序列构成的肽，可以列举pAVOO 1-HU-e⑶(pAVOO l-HU9aa_e⑶)，作为具有含有碱基序列的DNA片段的质粒，所述碱基序列编码HU蛋白质N末端的第I位到第18位氨基酸序列构成的妝，可以列举pAV001-HU18aa_e⑶(序列号15)。对使HU蛋白质N末端区域的长度变化的方法没有特别限制，如后述的实施例中所采用的方法所示，根据HU蛋白质N末端区域的序列设计适当的引物，通过使用这些引物进行PCR等方式，可以容易地得到所需氨基酸数量的N末端区域的序列。另外，本发明的制备方法具有下列特征在工序(I)中，使用具有双歧杆菌属细菌的质粒的片段和大肠杆菌的质粒的片段的融合质粒，作为本发明中使用的双歧杆菌属细菌的质粒的片段，优选来源于长双歧杆菌的质粒的片段，例如，可以列举下列来源于PTB6的区域部分其含有PTB6的复制起点(oriV)(序列号14的碱基号3419 3778)_r印B部分(序列号14的碱基号3983 4676)，且不含有MembB、MobA、Orif I和oriT区域。另外，作为本发明使用的大肠杆菌质粒的片段，可以列举下列质粒片段其含有大肠杆菌的复制起点(ori)区域(序列号14的碱基号6356 6999),且不含有氨节西林抗性基因(ampR)、或缺失编码作为氨苄西林抗性基因表达产物的￠-内酰胺酶区域的DNA。本发明的制备方法的工序(2)中使用的、来源于双歧杆菌属细菌的、编码HU蛋白质的基因的启动子和终止子，可以使用公知的方法得到。更具体地，可以根据双歧杆菌属细菌的公知HU蛋白质的序列，通过克隆编码该双歧杆菌属细菌的HU蛋白质的基因，可以得到该基因的启动子和终止子。例如，作为含有来源于长双歧杆菌的、编码HU蛋白质的基因的启动子和终止子的序列，优选地，可以分别列举以序列号14或15的碱基号234 1481表示的DNA、以序列号14的碱基号2979 3098 (序列号15的碱基号3021 3140)表示的DNA。制备作为本发明的基因转运载体的厌氧性微生物时，作为用本发明中的表达载体进行转化的厌氧性微生物，只要能用于本发明就没有特别限制，优选为厌氧性细菌、更优选为肠道细菌、进一步优选为双歧杆菌属细菌。作为双歧杆菌属细菌，例如可以列举青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌和长双歧杆菌，最优选长双歧杆菌。
这些菌均为市售产品、或可以容易地从保藏机构得到。例如，长双歧杆菌ATCC-15707、两歧双歧杆菌ATCC-11863、婴儿双歧杆菌ATCC-15697等，可以容易地从ATCC(The American Type Culture Collection)得至丨J0另外，对于各种菌株没有特别限制，例如对于长双歧杆菌的菌株可以列举长双歧杆菌105-A株、长双歧杆菌aE-194b株、长双歧杆菌bs-601株、长双歧杆菌M101-2株，其中优选长双歧杆菌105-A株。 对于短双歧杆菌的菌株，例如可以列举短双歧杆菌标准株(JCM1192)、短双歧杆菌aS-1株和短双歧杆菌I-53-8W株，其中优选短双歧杆菌标准株、短双歧杆菌aS-1株和短双歧杆菌I-53-8W株。对于婴儿双歧杆菌的菌株，例如可以列举婴儿双歧杆菌标准株(JCM1222)、婴儿双歧杆菌1-10-5株，其中优选婴儿双歧杆菌标准株和婴儿双歧杆菌1-10-5株。另外，对于乳双歧杆菌的菌株，例如可以列举乳双歧杆菌标准株(JCM1220)。作为本发明中的具有抗肿瘤活性的蛋白质，例如可以列举细胞因子，作为具体的细胞因子，例如可以列举干扰素(IFN)-a、P、Y、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)-I a、I 0、2、3、4、6、7、10、12、13、15、18、肿瘤坏死因子(TNF) - a、淋巴毒素(LT) - P、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、巨噬细胞移动抑制因子(MIF)、白血病抑制因子(LIF)、T细胞活化共刺激因子B7(CD80)和B7-2 (CD86)、Kit-配体(Kit-ligand)、制瘤素M等。另外，还可以列举内皮抑制素、血管抑素(Angiostatin)、半胱氨酸卷曲区_1、2、3、4、5等血管生成抑制物质。从各种各样的生物中知道了这些蛋白质的序列，根据其序列信息通过利用PCR法等公知方法，可以得到本发明中使用的、编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA。另外，本发明中作为具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质，可以列举将5-FC转化为抗肿瘤活性物质5-FU的酶CD。作为本发明的基因转运载体的工序(3)中被整合的DNA，可以是(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、和(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA中的任意DNA，优选为(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，其中，特别优选编码将抗肿瘤物质前体5-FC转化为抗肿瘤物质5-FU的酶CD 的 DNA。这种编码CD的DNA，例如，可以使用从下列质粒中分离的DNA :含有编码来源于大肠杆菌的⑶的DNA的质粒pAdex ICS⑶(理化学研究所Gene Bank RDB No. 1591)、或含有编码同样来源于大肠杆菌的⑶的DNA的质粒pMK116 (D. A. Mead et al. , ProteinEngineering 1:67-74 (1986))。作为编码来源于大肠杆菌的CD的DNA，例如对应于序列号14的第1494位到第2774位的碱基序列(序列号15的第1536 2816位的碱基序列)，另外，作为该氨基酸序列，对应于从序列号28的氨基酸序列中除去起始蛋氨酸的氨基酸序列。本发明中的CD的来源没有特别限制，可以使用编码下列氨基酸序列的DNA :与序列号28的氨基酸序列具有例如90%以上的同源性，更优选为具有95%以上的同源性，并且具有CD活性的氨基酸序列。本发明中的基因转运载体的制备方法虽然可以没有使(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA发生突变的工序(5)，但是从得到更优异的抗肿瘤活性或将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的观点出发，优选在工序(4)之前进一步包含上述工序(5)。也就是说，例如，可以在使编码目标基因的DNA发生突变后，在工序(3)中将该突变DNA整合到表达载体上，也可以在工序(3)中制备表达载体后，再使该编码目标基因的DNA部分发生突变。在工序(3)中制备表达载体后，使该编码目标基因的DNA部分发生突变的工序更具体来说，是使整合在工序(3)中制备的表达载体上的、Ca)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA发生突变的工序(5')。对突变的方法没有特别限制，可以使用利用PCR的部位特异性突变法等公知的方法。
发生突变时优选的部位，由于目标蛋白质的差别故不能一概而论，但是当目标蛋白质是大肠杆菌的CD时，优选将序列号14中第2433 2435位的碱基序列(序列号15中的 第2475 2477位的碱基序列)编码的天冬氨酸替换成其他氨基酸，更优选将序列号14中的第2433 2435位的碱基序列(序列号15中第2475 2477位的碱基序列)编码的天冬氨酸替换成丙氨酸。序列号14中的第2433 2435位的碱基序列(序列号15中第2475 2477位的碱基序列)编码的天冬氨酸对应于序列号28的氨基酸序列的第315位的天冬氨酸。与没有替换的情况相比，通过所述替换能够发挥非常优异的CD活性。作为本发明中的表达载体，例如，可以列举整合有编码⑶的DNA的双歧杆菌属细菌用的CD表达载体，具体来说，例如可以列举具有插入长双歧杆菌hup启动子的下游的大肠杆菌codA的重组质粒pBLES100-S-e⑶(参照专利文献4和非专利文献3)、或改良该PBLES100-S-e⑶得到的、能转化长双歧杆菌或短双歧杆菌的pAVOO I_HU_e⑶(pAV001-HU9aa_e⑶)或这些质粒的突变体。这里，质粒的突变体是指使整合到质粒中的DNA，例如编码⑶的DNA发生突变的载体，与没有发生突变的原载体相比能够同样或更加适合于使用。例如，pBLESlOO-S-e⑶的突变体是指来源于pBLES100-S-eCD的质粒DNA的突变体，并在本发明中与pBLES100-S_eCD相比能够同样或更加适合使用的质粒。另外，pAVOO 1-HU-eCD的突变体是指来源于pAV001-HU-e⑶的质粒DNA的突变体，并在本发明中与pAV001-HU_e⑶相比能够同样或更加适合使用的质粒。因此，作为质粒的突变体，可以适当列举在质粒pAV001-HU-e⑶的⑶编码区域中引入单碱基突变的质粒，即质粒pAV001-HU-e⑶-M968 (序列号27)。质粒pAV001-HU-era-M968中序列号14中的第2433 2435位碱基序列编码的天冬氨酸被替换成丙氨酸，其结果为，CD活性显著提高。本发明的基因转运载体如果是下列基因转运载体就没有特别限制其是由表达载体转化的厌氧性微生物构成的基因转运载体，其中，所述表达载体具有双歧杆菌属细菌的质粒的片段、大肠杆菌的质粒的片段、以及含有来源于双歧杆菌属细菌且编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子的DNA片段，在所述启动子和终止子之间具有(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，并且在(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA的5'末端侧进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由所述组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第I位到至少第4位氨基酸序列构成的肽。 本发明的基因转运载体可以通过例如本发明的基因转运载体的制备方法制备。并且，本发明的基因转运载体，当编码目标蛋白质的DNA没有发生突变时，编码该蛋白质的DNA在其5'末端侧具有的、编码由HU蛋白质N末端的氨基酸序列构成的肽的DNA，可以除去编码由HU蛋白质N末端的第I位到第9位的氨基酸序列构成的肽的DNA。另外，本发明的基因转运载体中的(a)编码具有抗肿瘤活性的蛋白质的DNA、或(b)编码具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质的DNA，也可以是没有发生突变的DNA，但是优选与突变前的DNA编码的蛋白质的活性相比，发生了突变的DNA编码的蛋白质的抗肿瘤活性或将抗肿瘤前体转化为抗肿瘤物质的活性提高的突变DNA。
作为使用具有发生了突变的编码目标蛋白质的DNA的表达载体得到的本发明的基因转运载体，可以列举长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-e⑶的质粒单碱基突变体，其中特别地,可以适当列举长双歧杆菌105-A/pAV001-HU-e⑶-M968。本发明的基因转运载体的制备方法包括使用整合有编码目标蛋白质的DNA的表达载体来转化厌氧性微生物的工序。转化微生物的制备方法可按照市售的实验书籍记载的方法进行，例如基因手册(讲谈社)、高木康敬编基因操作实验法(讲谈社)、Molecular CloningCCold Spring HarborLaboratory) (1982)、Molecular Cloning,2nd ed. (Cold Spring Harbor Laboratory)(1989)、Methods in Enzymol. , 194 (1991)等。本发明的基因转运载体中(b)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质为CD时，把该CD表达基因重组微生物应用于酶-前药疗法时，需要对被CD从5-FC转化的5-FU，至少是对抗肿瘤活性有效浓度的5-FU具有耐受性。然而，使用表达CD的基因重组微生物，根据专利文献5的实施例I记载的驯化培养方法制备5-FU耐受菌时，质粒保持率有下降的趋势。但是，在本发明的基因转运载体制备方法中，根据专利文献5的实施例2记载的驯化培养方法，首先对于作为宿主的厌氧性微生物，制备至少具有抗肿瘤活性有效浓度的5-FU耐受菌，并将其用作宿主，通过这样可以制备质粒保持率高的基因重组微生物。本发明的药物组合物如果含有本发明的基因转运载体就没有特别限制。另外，本发明的实体瘤治疗药物如果含有本发明的基因转运载体就没有特别限制。本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂也可以含有I种或2种以上的本发明的基因转运载体。另外，本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂的基因转运载体的给药量，只要是对于表达能够在肿瘤部位生长、且具有抗肿瘤活性的蛋白质具有足够给药量，或对于表达能将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的量的蛋白质具有足够给药量，就没有特别限制，但从经济上的观点和尽可能避免副作用的观点出发，优选在可以得到必要的抗肿瘤活性的范围内采用尽量少的给药量。另外，还可根据疾病的程度、患者的体重、年龄、性别来适当选择本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂的基因转运载体的给药量，并根据改善的程度适当增减给药量。
并且，本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂只要不影响本发明的效果，也可以含有除本发明的基因转运载体之外的任意成分。作为这样的任意成分，例如可以列举药理学允许的载体、赋形剂、稀释剂等。当本发明的基因运送载体或实体瘤治疗剂为整合了基因的厌氧性细菌，所述基因能够表达具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质时，含有作为活性成分的该基因转运载体的本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂可以与抗肿瘤物质前体组合使用，所述抗肿瘤物质前体的量是能通过被该基因转运载体表达的蛋白质转化为有效量的抗肿瘤物质的量。含有作为活性成分的本发明的基因运送载体的药物组合物或实体瘤治疗剂中虽然也可以含有该抗肿瘤物质前体 ，但是作为含有该抗肿瘤物质前体的药物组合物，优选与含有作为活性成分的本发明的基因运送载体的药物组合物或实体瘤治疗剂组合使用。抗肿瘤物质前体的给药量可以根据组合使用的基因转运载体在肿瘤组织内的生长率和从抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的转化率进行适当选择。另外，与基因转运载体的给药量同样，也可以根据疾病的程度、患者的体重、年龄、性别来适当选择抗肿瘤物质前体的给药量，并根据改善的程度适当增减给药量。因此，当本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂与抗肿瘤物质前体组合使用时，本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂的给药方法与含有抗肿瘤物质前体的药物组合物的给药方法可以相同也可以不同，另外，可以同时给药也可以间隔给药，但是优选在本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂给药后、在经过本发明的基因转运载体能在肿瘤细胞内充分生长的时间后，给予含有抗肿瘤物质前体的药物组合物。本发明中“使X和Y组合”可以包含以不同的形态组合X和Y的情况，也可以包含以相同的形态组合X和Y (例如含有X和Y的形态)的情况。另外，以不同的形态组合X和Y的情况还可以包含X、Y的任意一方进一步含有其他成分的情况。本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂的剂型没有特别限制，例如可以列举含有本发明的基因转运载体的液体制剂或固体制剂。液体制剂可以采用下列方法制备精制本发明的基因转运载体厌氧性菌的培养液，根据需要在该培养液中加入适当的生理盐水、补液或药物添加物并填充到安瓿或管瓶(Vial)中。另外，固体制剂可以采用下列方法制备在液体制剂中添加适当的保护剂并填充到安瓿或管瓶中，之后进行冷冻干燥或L干燥，或者在液体制剂中添加适当的保护剂，经冷冻干燥或L干燥之后填充到安瓿或管瓶中。作为本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂的给药方法，优选为非口服给药，例如可以进行皮下注射、静脉注射、局部注射、脑室内给药等,最优选为静脉注射。本发明的药物组合物或实体瘤治疗剂可以适用于厌氧性环境下的肿瘤，优选适用于各种实体瘤。作为实体瘤，例如可以列举大肠癌、脑瘤、头颈部癌、乳腺癌、肺癌、食道癌、胃癌、肝癌、胆囊癌、胆管癌、胰腺癌、胰岛细胞癌、绒毛膜癌、结肠癌、肾细胞癌、肾上腺皮质癌、膀胱癌、睾丸癌、前列腺癌、睾丸瘤、卵巢癌、子宫癌、绒毛膜癌、甲状腺癌、恶性类癌瘤(Malignant carcinoid tumor)、皮肤癌、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤、成神经细胞瘤、维姆氏瘤(Wilms’ s tumor)、成视网膜细胞瘤、黑色素瘤、鳞状上皮癌等。以下，通过实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明的技术范围并非仅限于这些示例。[参考例I]长双歧杆菌105_A/pAV001-HU-eCD的制备
(I)穿梭质粒pAVOO I的构建(质粒的构建)从长双歧杆菌和大肠杆菌的穿梭质粒pBLESlOO (参照专利文献4和非专利文献7)通过PCR扩增含有来自粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的大观霉素腺苷酸转移酶(AAD盒)的序列，并亚克隆到PCR-Bluntll-TOPO载体(Invitrogen株式会社制)中，制备PCRTOPO-Scal-AAD-Eaml 1051。并且，分别向正向引物中添加ScaI、向反向引物中添加Eaml 1051限制性酶切位点。如图I 所示，从 Invitrogen 公司购入的克隆载体 pGFPuv (DEFINITION:Cloningvector pGFPuv. ACCESSION:U62636 VERSION:U62636. I GI: 1490582)由 GFPuv 基因及其两端的多克隆位点(MCSs)、氨苄西林抗性基因、大肠杆菌质粒复制起点构成。将该pGFPuv的氨苄西林抗性基因部位用限制性酶Eaml 1051和ScaI切害I]，制备切除的长片段。同样地使用限制性酶Eamll05I和Seal，制备含有切割了PCRTOPO-Scal-AAD-Eaml 1051的AAD盒的片段(约llOObp)。制备使用T4DNA连接酶连接了上述2个片段的pGFPuv-SpR。并且，在大肠杆菌中分别确认制备的质粒pGFPuv-SpR赋予了大观霉素耐受性性质、并且同时缺失了氨苄西林抗性性质。将pGFPuv-SpR用限制性酶SalK存在于GFPuv基因上游的多克隆位点内)和SpeI(存在于GFPuv基因下游的多克隆位点内)进行消化，制备去除了 GFPuv基因的质粒pAVN。然后，根据来自长双歧杆菌的质粒pTB6的完整碱基序列信息，将含有R印B、SD0、DDO> AT-rich repeats、DnaA-binding motifs的约1900bp的序列作为长双歧杆菌的质粒复制单位进行鉴定。从pTB6通过PCR扩增含有长双歧杆菌的质粒复制单位的约1900bp,制 备亚克隆到PCR-Bluntll-TOPO载体的PCRT0P0-ApaI-1900-ScaI。并且，分别向正向引物中添加ApaI位点、向反向引物中添加ScaI限制性酶切位点。使用T4DNA连接酶连接用限制性酶ApaI和ScaI消化pAVN后得到的长片段(约2400bp)和同样地用限制性酶ApaI和ScaI消化PCRT0P0-ApaI-1900_ScaI后得到的短片段(约1900bp)，制备长双歧杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pAVOO I (约4300bp)。(2) CD 基因表达载体 pAVOO 1-HU-eCD(表达载体的构建)接着，用限制性酶HindIII和SpeI切割pBLES100-S_eCD，提出含有HU基因启动子、来自大肠杆菌的⑶基因和HU基因终止子的约2900bp片段。同样地，在多克隆位点内的限制性酶切割位点用HindIII和SpeI切割穿梭质粒pAVOOl得到的长片段上，使用T4DNA连接酶连接上述约2900bp片段制备pAVOO 1-HU-eCD (约7IOObp)。(3)将⑶基因表达载体pAV001-HU-e⑶导入双歧杆菌属从在MRS培养基中于37°C厌氧条件下培养野生型长双歧杆菌得到的培养液中通过离心分离分离菌体，制备悬浮在适当缓冲液中的菌体悬浊液。然后，使用非专利文献2和3中记载的电穿孔法，将⑶基因表达载体pAVOOl-HU-e⑶导入上述菌体悬浊液中。以导入的重组长双歧杆菌(长双歧杆菌/pAVOO 1-HU-e⑶)在含有抗生素大观霉素的琼脂培养基上的菌落形成为基础进行筛选。(4)长双歧杆菌/pAVOO 1-HU-eCD中胞嘧啶脱氨酶酶活性；5_FC — 5-FU的转化活性的测定)
将长双歧杆菌/pAVOO 1-HU-eCD接种到含有抗生素大观霉素的MRS培养基中，在3 7 °C厌氧条件下传代培养2天以上，从得到的培养液中通过离心分离分离菌体(2X IO9CFU),在4. 5mL的MRS培养基中再次悬浮。然后，添加0. 5mL的5-FC (20mg/mL)使其最终浓度为2mg/mL，并在37°C厌氧条件下进行培养。在第0、4、8、18、24小时的每个时间点从培养液分别回收通过离心分离将菌体去除的上清部分，通过气相色谱分析(5_FUGC-MS法，BML)测定转化了的5-FU的浓度。测定结果如图2所示。分析结果表明长双歧杆菌/pAVOO 1-HU-eCD中，在第4小时后检测出12. 5 u g/mL的5_FU、在第24小时后检测出165. 4 u g/mL 的 5-FU。实施例I[HU-eCD质粒的制备]构建将融合在一⑶N末端区域的HU蛋白质N末端区域的长度改变为2个氨基酸、3个氨基酸、4个氨基酸的质粒(图3)。
以同样的方法构建除去HU蛋白质N末端的质粒。此时，制备两种翻译起始密码子来源于大肠杆菌JMlOl株的⑶的翻译起始密码子ATG、来源于大肠杆菌K12株的⑶的翻译起始密码子GTG。另外，也构建将融合在eCD N末端区域的HU蛋白质N末端区域的长度改变为18个氨基酸的质粒。表I中显示了质粒的构建部分的序列。[表I]质粒构建表

__Zt粒"名称…CD S末端的Sf 序......................... .......................... I
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................................._ -----■■ , —yunnni Miiiiiiiiiimnnmnnnnnnnnnnnnnm 丨丨丨 .......................................................................-■ imm ............................................................................................................................................................___粗体字部分为添加到CD的N末端的添加序列。(I)构建HU蛋白质N末端添加2个氨基酸的质粒以pAV001-HU-eCD 50pg 为模板，用 PrimeSTAR HS DNA 聚合酶(夕力 9 才株式会社制)进行PCR扩增，得到PCR片段A (约I. 3kbp )和PCR片段B (约I. 3kbp )。在PCR片段A的扩增中使用以序列号I表示的外引物和以序列号2表示的内引物，所述内引物在5'末端具有与PCR片断B末端重复的序列并含有与pAVOOl-HU-e⑶互补的序列。PCR片段A在DNA末端含有来源于模板的Hind III位点。在PCR片段B的扩增中使用以序列号3表示的外引物和以序列号4表示的内引物，所述外引物在5'末端具有KspAI识别位点并含有与pAVOOl-HU-e⑶互补的序列，所述内引物在5'末端具有与PCR片断A末端重复的序列且含有与pAVOOl-HU-e⑶互补的序列。来源于HU蛋白质的氨基酸序列的改变是通过内引物进行的。温度条件是以98°C下10秒、55°C下5秒、72°C下I分20秒为I个循环，进行30个循环后，在72 °C下保温30秒。用QIAquick PCR Purification Kit (株式会社々7 ^ >制)纯化PCR片段A和B后，等摩尔混合纯化的PCR片段A和B。以纯化PCR片段A和B的混合物Ing为模板，在lxPrimeSTAR buffer、200 u MdNTPs mix,2. 5u PrimeSTAR HS DNA聚合酶混合液中，在不加入引物的状态下，以98°C下 10秒、72°C下I分30秒为I个循环，进行5个循环反应以连接PCR片段A和B。然后，添加外引物(序列号I和3)使最终浓度分别达到0. 5 ii M，以98°C下10秒、55°C下5秒、72°C下2分40秒为I个循环，进行25个循环反应后，在72°C下保温30秒得到连接PCR产物(约
2.6kbp)。用l%SeaPlaque (R)GTG (R)琼脂糖凝胶(IxTAE buffer、0. 5 ii g/ml 溴化乙锭)分离连接PCR产物，切割2. 6kbp的DNA片段。用QIAquick (R) Gel Extraction Kit从凝胶中提取连接 PCR 产物，用 Hind III (FermentasUAB 公司制)和 KspA I (Fermentas UAB 公司制)进行消化。用 l%SeaPlaque (R)GTG (R)琼脂糖凝胶(IxTAE buffer、0. 5 ii g/ml 溴化乙锭)分离，切割2. 6kbp的DNA带。用QIAquick (R)Gel Extraction Kit从凝胶中提取连接PCR产物。用Hind III (Fermentas UAB 公司制)和 KspA I (Fermentas UAB 公司制)消化pAVOO 1-HU-eCD 载体后，用 l%SeaPlaque (R)GTG (R)琼脂糖凝胶(IxTAE buffer,0. 5 U g/ml溴化乙锭)分离,切割4. 6kbp的DNA片段。然后，用QIAquick (R)Gel Extraction Kit从凝胶中提取载体DNA。混合之前的连接PCR产物，使载体和连接PCR产物的摩尔比为1: 3，用Rapid DNALigation KitCFermentas UAB公司制)进行连接。使用连接产物进行大肠杆菌JM109的转化，并涂布到含有30 u g/ml大观霉素的LB琼脂培养基上，在37°C下培养一晚，得到转化子。将转化子在含有30 u g/ml大观霉素的2 X LB液体培养基中在37°C下培养一晚，用QIApr印(R) SpinMiniprep Kit 提取质粒 DNA (pAV001-HU2aa_eCD)。(2)构建HU蛋白质N末端添加3个氨基酸的质粒除分别使用序列号5和4表示的引物作为PCR片段A和PCR片段B扩增用内引物以外，使用与构建HU蛋白质N末端添加2个氨基酸的质粒相同的方法，构建HU蛋白质N末端添加3个氨基酸的质粒(pAV001-HU3aa-eQ))。(3)构建HU蛋白质N末端添加4个氨基酸的质粒除分别使用序列号6和7表示的引物作为PCR片段A和PCR片段B扩增用内引物以外，使用与构建HU蛋白质N末端添加2个氨基酸的质粒相同的方法，构建HU蛋白质N末端添加4个氨基酸的质粒(pAV001-HU4aa-eQ))。pAVOOl-HU4aa_eO)的序列如序列号14所/Jn o(4)构建不含有HU蛋白质N末端、且以ATG作为翻译起始密码子的质粒除分别使用序列号8和9表示的引物作为PCR片段A和PCR片段B扩增用内引物以外，使用与构建HU蛋白质N末端添加2个氨基酸的质粒相同的方法，构建不含有HU蛋白质N末端、且以ATG作为翻译起始密码子的质粒(pAV001-HU0aaATG-eCD)。(5)构建不含有HU蛋白质N末端、且以GTG作为翻译起始密码子的质粒除分别使用序列号10和11表示的引物作为PCR片段A和PCR片段B扩增用内引物以外，使用与构建HU蛋白质N末端添加2个氨基酸质粒相同的方法，构建不含有HU蛋白质N末端、且以GTG作为翻译起始密码子的质粒(pAV001-HU0aaGTG-eCD)。
(6)构建HU蛋白质N末端18氨基酸的质粒等摩尔混合具有互补序列、且5'末端被磷酸化的2种合成低聚DNA (序列号12、13)，在0. IM NaCl存在下，通过65°C下5分钟、45°C下5分钟、37°C下10分钟、25°C下10分钟的梯度降温使其退火以制作适配子。适配子的末端为Bspll9I位点。用Bspll9I(Fermentas UAB 公司制)消化pAVOOl-HU-eCD 载体，用 CIAP(FermentasUAB公司制)进行DNA末端的去憐酸化处理后,用RapidDNA Ligation KitCFermentas UAB公司制)与适配子进行连接。使用连接产物进行大肠杆菌JM109的转化，并涂布到含有30 u g/ml大观霉素的LB琼脂培养基上，在37°C下培养一晚，得到转化子。将转化子在含有30 y g/ml大观霉素的2XLB液体培养基中在37°C培养一晚，用QIApr印(R)Spin Miniprep Kit提取质粒 DNA (pAV001-HU18aa-eCD)。pAV001-HU18aa_eCD 的序列如序列号 15 所示。(长双歧杆菌105A的转化)将80 ill长双歧杆菌105A感受态细胞和质粒DNA 5u I (500_1000ng)混合，用基因脉冲仪 II 电穿孔系统(Gene Pulser II electroporation system)(日本才 9 '7K 9 5卜U — X株式会社制)进行转化。涂布到含有15%D-棉籽糖、30 u g/ml大观霉素的IWATA琼脂培养基上后，在37°C厌氧条件下培养2晚，得到转化子。(从长双歧杆菌105A转化子中提取蛋白质)在5ml MRS液体培养基(含有30 ii g/ml大观霉素、半胱氨酸-维生素C混合液)上接种转化子，在37°C厌氧条件下培养一晚。将1%的培养液继续接种到相同培养基上，在37°C厌氧条件下培养一晚，重复2次操作。将1%的该培养液添加到相同培养基中，使用培养约18小时后的培养物进行蛋白质提取。在l 4ml培养液中添加4ml Tris缓冲液(0. 5MTris-HCl,0. 5%TritonX100，pH8. 4)并混合后，在13000Xg、室温条件下进行15分钟离心分离，除去上清液。在菌体中添加5ml相同的Tris缓冲液混悬后在13000Xg、室温条件下进行15分钟离心分离，并除去上清液，重复进行该操作2次，以进行菌体的洗涤。将洗净菌体混悬在含有50iil蛋白酶抑制剂('> ” 了 ^ K 'J ^-)的Tris缓冲液Iml中，在冰冷却条件下进行5分钟超声破碎。在13000Xg、4°C条件下进行20分钟离心分离，将上清液作为总蛋白质提取液用于CD活性的测定。(⑶活性的测定)用Lowry法改良法测定总蛋白量，在相当于总蛋白量50 ii g的总蛋白质提取液中添加缓冲液至250 iil，与250 ill 40mM 5-FC混合后在60°C条件下反应20分钟。添加250 u I 0. 5M三氯乙酸使反应停止，放置在冰中。在20000 X g、4°C条件下进行离心分离20分钟，在450iil上清液中加入150 u 10. 3M NaOH以中和溶液。用HPLC的流动相将中和后的样品稀释10倍，用HPLC测定5-FU和5-FC的含量。以5-FC的消耗％作为⑶活性。活性测定结果如表2所示。[表2]来源于HU蛋白质N末端的氨基酸添加到CD中的效果
权利要求
1.DNA片段，该DNA片段具有含有来源于选自青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌以及长双歧杆菌的任意一种的双歧杆菌属细菌且编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子的DNA片段，在所述启动子和终止子之间具有编码胞嘧啶脱氨酶的DNA，所述编码胞嘧啶脱氨酶的DNA是，Ca)除去序列号28的氨基酸序列的起始蛋氨酸的氨基酸序列，并且编码序列号28中记录的大肠杆菌CD的氨基酸序列中与第315位相对应的氨基酸天冬氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列的喊基序列；(b)在编码胞卩密唳脱氣酶的DNA的5'末端侧，具有编码序列号29的第I位到第4 18位中任意一位的氨基酸序列的碱基序列。
2.权利要求I所述的DNA片段，该DNA片段具有含有来源于选自青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、嗜热双歧杆菌、假长双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌以及长双歧杆菌的任意一种的双歧杆菌属细菌且编码组蛋白样DNA结合蛋白的基因的启动子和终止子的DNA片段，在所述启动子和终止子之间具有编码胞嘧啶脱氨酶的DNA，所述编码胞嘧 啶脱氨酶的DNA是，Ca)除去序列号28的氨基酸序列的起始蛋氨酸的氨基酸序列，并且编 码序列号28中记录的大肠杆菌CD的氨基酸序列中与第315位相对应的氨基酸天冬氨酸被丙氨酸取代的氨基酸序列的碱基序列；(b)在编码胞嘧啶脱氨酶的DNA的5'末端侧，具有编码序列号29的第I 9位的氨基酸序列的碱基序列。
全文摘要
本发明的目的在于提供一种有效地制备基因转运载体的方法，该方法中，经由转化而导入的基因所表达的蛋白质活性和表达效率均良好。此外，本发明的另一个目的是提供含有该制备方法制备的基因转运载体的药物组合物，以及含有该耐受菌的实体瘤治疗剂。本发明通过以下方案来解决本发明的课题在由厌氧性微生物形成的基因转运载体中，使编码前述目标蛋白质的DNA 5′末端侧，进一步具有含有碱基序列的DNA片段，所述碱基序列编码由组蛋白样DNA结合蛋白N末端的第1位到至少第4位氨基酸序列构成的肽，所述厌氧性微生物可以在处于厌氧环境下的肿瘤组织内生长，并且能够表达(A)具有抗肿瘤活性的蛋白质、或(B)具有将抗肿瘤物质前体转化为抗肿瘤物质的活性的蛋白质。
文档编号C12N15/11GK102747074SQ20121018719
公开日2012年10月24日 申请日期2007年5月24日 优先权日2006年5月24日
发明者天野纯, 嶋谷裕子, 松桥瞳, 浜地芳典, 藤森実, 谷口俊一郎 申请人:阿内罗药物科学株式会社