一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法
【技术领域】
[00011本发明属于CRISPR/Cas9系统的sgRNA领域，特别涉及一种同时表达多个sgRNA的 载体的构建方法。
【背景技术】
[0002] CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，成族 调控的间隔短串联重复序列)起源于细菌和古细菌的免疫系统，是目前使用最为广泛的基 因编辑工具，已经成功运用于大肠杆菌，酵母，小鼠，人等物种的基因组编辑。
[0003] 根据CRISPR在降解靶基因过程中指导RNA和CRISPR结合核酸酶的不同，CRISPR系 统被分为三类。其中，以Cas9(CRISRP-associated)为核酸酶的二型应用最多（Patrick D.Hsu,Eric S.Lander,and Feng Zhang.Development and Applications of CRISPR-Cas9for Genome Engineering-Cell 157，1263_1278(2014))〇
[0004] 对CRISPR行使功能的重要元件的鉴定与优化，为CRISPR系统的应用奠定了基础。 Jinek等人在体外实验中证实CRISPR功能的实现依赖于4个重要的功能元件：tracrRNA, crRNA，Cas9以及PAM[Martin Jinek,Krzysztof Chylinski , Ines Fonfara ,Michael Hauer,and Jennifer A.Doudna,Emmanuelle Charpentier.A Programmable Dual-RNA-Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337,816-821 (2013)]。经过Cong L等人的进一步探索，一个能够自身形成二级结构结合Cas9并实现位点 特异性切割的sgRNA(single guide RNA)和人源密码子优化的Cas9表达载体pX330-U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9(42230，addgene)成功构建[Cong L，Ran FA，Cox D，Lin S， Barretto R,Habib N,Hsu PD,ffu X,Jiang ff,Marraffini LA,Zhang F.Multiplex Genome Engineering using CRISPR/Cas Systems.Science 339,819-823(2013)·]。自此，使用 CRISPR系统编辑基因组变得更加灵活方便。
[0005] CRI SPR的出现简化了之前的基因编辑工具(ZFN，TALEN)复杂的制备过程。正因为 如此便捷的操作过程节约的大量的时间和成本，使用CRISPR进行高通量的基因编辑逐渐成 为研究热点。最初Wang等人同时使用5种sgRNA转染小鼠胚胎干细胞，基因分型结果显示，该 方法可以实现多个基因的同时编辑[Haoyi Wang,Hui Yang,Chikdu S.Shivalila，Meelad M.Dawlaty,Albert ff.Cheng,Feng Zhang,and Rudolf Jaenisch.One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering .Cell .153,910-918(2013)]。为了提高转染sgRNA在细胞中分布的均一性，即 在同一细胞中同时实现多种基因的编辑，陆续有研究着眼于构建同时插入多个sgRNA的表 达框的载体。Kabadi等人通过改造已有的sgRNA表达载体，获得4种含有sgRNA插入位点的亚 克隆，这些亚克隆的sgRNA表达框的两端分别带有BsmBI酶切位点。由于BsmBI酶识别与切 害J位点的特殊性，通过对识别位点与切割位点之间粘性末端的设计，可实现4种sgRNA以次 序的连接，即Golden Gate克隆方法，他们成功实现4个sgRNA的串联表达[Ami M.Kabadi， David G.Ousterout, Isaac B.Hilton and Charles A.Gersbach.Multiplex CRISPR/ Cas9_based genome engineering from a single lentiviral vector.Nucleic Acids Research. 42(19)el47(2014)]。与他们构建思路相同，Sakuma等人改造现有的42230质粒， 构建了7种带有sgRNA插入位点的亚克隆载体:第1个亚克隆载体在sgRNA表达框的后面插入 两个Bsal酶切位点，其他6个载体则是在sgRNA表达框两端分别引入不同Basl酶切位点，同 样采用Golden Gate克隆方法，7个亚克隆经过Basl切割后产生的粘性末端首尾相接，由此 实现7中sgRNA的串联[Tetsushi Sakuma，Ayami Nishikawa，Satoshi Kume，Kazuaki Chayama and Takashi Yamamoto.Multiplex genome engineering in human cells using all-in-one CRISPR/Cas9vector system.Scientific Reports4:5400(2014).]〇比 较现存基于Golden Gate的sgRNA串联表达方法可以发现，这些方法所能实现sgRNA串联表 达的数目受限于sgRNA插入质粒亚克隆的数目。因此，不依赖于Golden Gate以更灵活的方 法实现sgRNA表达的方案仍有待进一步探索。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法， 本发明提供了一种能够在哺乳动物细胞中同时表达多个sgRNA的载体构建方案。在实际应 用中，可根据研究需要，灵活串联所需sgRNA。在对基因家族功能的研究中，该方案可以同时 实现基因家族成员的同时敲除;在miRNA功能研究中，两个sgRNA同时作用于其编码区域两 端，以实现整个miRNA的敲除。总之，本发明为基因功能研究提供便利。
[0007] 本发明的一种同时表达多个sgRNA的载体的构建方法，包括：
[0008] (1)将待串联的η个SgRNA分别插入相应的42230载体，得到η个SgRNA表达载体 42230-sgRNA n;其中n=l、2、3、4···的正整数；
[0009] (2)以Multi-sgRNA Fl、Multi-sgRNA R为引物，通过PCR扩增，从第二个SgRNA表达 载体42230-sgRNA2上扩增出sgRNA 2的表达框，然后通过无缝克隆在第一个881?嫩1表达载体 42230-sgRNAi上的EcoR I位点实现第二个sgRNA2表达框的插入，得到重组载体42230-sgRNAi+2 ；
[0010] (3)以Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R为引物，然后通过PCR扩增，从第三个sgRNA 表达载体42230-sgRNA3上扩增出sgRNA3的表达框，然后通过无缝克隆在42230-sgRNA 1+2上的 EcoR I位点实现第三个sgRNA3表达框的插入，得到重组载体42230-sgRNA1+2+3,然后将 sgRNA4的表达框通过无缝克隆在EcoR I位点实现第四个sgRNA4表达框的插入，依次操作， 即得同时表达多个sgRNA的载体42230-sgRNA1+2+3_ +n;其中42230-sgRNAn，其中n>2的表达 框的扩增所有引物均为Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R为引物。
[0011] 所述步骤(2)、（3)中无缝克隆通过无缝克隆试剂盒进行。
[0012] 所述步骤（1)中n = 4，4个 SgRNA 表达载体分别为：42230-sgRNAi: 42230-miR-505， 42230-sgRNA2:42230-miR-29a，42230-sgRNA 3:42230-miR-29c，42230-sgRNA4:42230-SF2。 所述步骤(2)中
[0013] Multi-sgRNA F1:AGGCAAAAAAGAAAAAGTAATTACGGTTCCTGGCCTTTTG;如SEQ ID NO.1 所示；
[0014] Multi-sgRNA R: CGAGCTCTAGGAATTCTTTGTCTGCAGAATTGGCGC，如SEQ ID Ν0· 2所示。 [0015] 所述步骤⑶中
[0016] Multi-sgRNA F2:GCGCCAATTCTGCAGACAAATTACGGTTCCTGGCCTTTTG;如SEQ ID N0.3 所示；
[0017] Multi-sgRNA R: CGAGCTCTAGGAATTCTTTGTCTGCAGAATTGGCGC，如SEQ ID NO.4所示。
[0018] Multi-sgRNA F2、Multi-sgRNA R能扩增所有42230-sgRNAn，n>2的表达框。
[0019] 步骤(2)、（ 3)中的重组载体均进行菌落PCR验证，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落 进程测序验证。
[0020] 重组载体进行菌落PCR验证，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落进程测序验证具体 为:将重组载体转化进DH5a，过夜培养后从平板上挑取单克隆以Seq-F和Seq-R为引物进行 菌落PCR验证sgRNAn的插入，然后选取菌落PCR呈阳性的菌落，以Seq-R为引物进行测序验 证，重组质粒中测序检测到插入sgRNAn的序列为正确的菌落的质粒。
[0021] 所述引物Seq_F:GATCGACCTGTCTCAGCTGG如SEQ ID N0.5所示；Seq-R: GCAACTAGAAGGCACAGTCGjnSEQIDN0.6K*。
[0022] 抽提测序验证结果正确的菌落的质粒，转染293A细胞48小时后，使用T7E1酶鉴定 方法验证sgRNA的表达活性。
[0023]步骤(1)中将待串联的η个sgRNA分别插入相应的42230载体，得到η个sgRNA表达载 体42230-sgRNAn;其中η=1、2、3、4·"的正整数，具体为：
[0024] 按照张锋等人提供的方法设计(参考文献Cong L，Ran FA，Cox D，Lin S，Barretto R, Habib N, Hsu PD ,ffu X, Jiang ff,Marraff ini LA, Zhang F.Multiplex Genome Engineering using CRISPR/Cas Systems.Science 339,819-823(2013)·)针对n个基因 编辑位点的sgRNA:正