鸭坦布苏病毒e蛋白和ltb的融合蛋白及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，即筛选获得鸭坦布苏病毒E蛋白具有优势抗原表位的DomainIII结构域，并通过Lingker与肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-Es，并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。本发明中鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:1；其中一种核苷酸序列为SEQIDNO:2。本发明利用原核表达载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌。将重组表达的蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，可使免疫后鸭群获得免疫保护。
【专利说明】鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白 及其应用。
【背景技术】
[0002] 我国是世界养鸭大国，鸭肉年生产总量约占世界总量的70%，自2000年的186. 6万 吨增长到2008年的258. 1万吨，年均增长率约3. 8%，大大高于世界平均水平。鸭坦布苏病 毒是2010年在中国率先发现的一种新发病毒，主要引起鸭群采食量和产蛋大幅下降、卵巢 出血、神经症状等，因此初期该病又称为鸭出血性卵巢炎、产蛋下降综合征等。通过病毒分 离、基因解析，目前鸭坦布苏病毒定位于黄病毒科、黄病毒属、蚊媒病毒的恩塔亚病毒群。据 不完全统计，在蛋鸭和肉鸭主产区，约有1. 2亿只蛋鸭和1500多万只肉鸭发生该病，累计经 济损失超过50亿元。同时作为新发病毒，目前尚无商业化的鸭坦布苏病毒疫苗面世。
[0003] 鸭坦布苏病毒为单股正链RNA病毒，基因组10990bp，95-10278bp为0RF区域，编 码3个结构蛋白（衣壳蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E)和7个非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、 NS3、NS4a、NS4b、NS5)，其中包膜蛋白E具有较高免疫原性，含有多个重要的细胞受体结合 位点，并能引起强烈和持久的免疫反应，是黄病毒属病毒的主要基因工程疫苗开发候选蛋 白。黄病毒包膜E蛋白按其空间结构可分为DomainI、DomainII和DomainIII三个结构 域，其中DomainIII结构域可被病毒的中和抗体识别，且基因大小适中，更适于用于基因工 程亚单位疫苗开发。Chu等构建了表达西尼罗病毒E蛋白结构域III的重组质粒，并用寡脱 氧核苷酸（CpG-DNA)作为佐剂，腹腔注射途径免疫BALB/C小鼠，结果获得高滴度的西尼罗 病毒中和抗体，表明辅以佐剂西尼罗病毒E蛋白DomainIII可使小鼠产生免疫应答，具有 疫苗开发的潜力。
[0004] 产肠毒素大肠埃希菌（ETEC)产生不耐热肠毒素（heat-labileenterotoxin,LT) 具有良好的免疫原性和免疫佐剂作用，其又分为A亚（LTA)和B亚基（LTB)。LTB是LT的免 疫原性部位，是受体结合部位，具有良好的免疫佐剂作用，已有多篇文献报道其用于疫苗的 免疫佐剂。李润成等（2009年）将肠毒素LTB蛋白基因与口蹄疫VP1蛋白基因进行融合表 达，发现LTB可有效促进口蹄疫VP1蛋白的免疫效果，增效明显。余兴龙等将LTB与猪圆环 病毒0RF2基因融合表达制备的融合蛋白制成基因工程亚单位，免疫后也取得理想的免疫 效果。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白和LTB的融合蛋白，即通过筛选获 得优势抗原表位的鸭坦布苏病毒E蛋白DomainIII部分，并通过Lingker(GGGSGGGS)与 肠毒素LTB组成新型融合蛋白LTB-Es，并以该融合蛋白作为抗原来制备鸭坦布苏病毒基因 工程亚单位疫苗。
[0006] 本发明首先提供一种鸭坦布苏病毒E蛋白DomainIII和LTB的融合蛋白LTB-Es， 其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO: 1 ; 上述蛋白的一种核苷酸序列为SEQIDNO:2 ; 本发明还提供一种鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，其中的抗原为上述的新型融合 蛋白LTB-Es，其浓度为0? 1-0. 5mg/ml之间； 本发明的鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗，其制备步骤如下： 1) 将新型融合蛋白LTB-Es基因插入表达载体中，构建成表达重组质粒； 2) 将构建的表达重组质粒转化宿主菌，构建了能表达新型融合蛋白LTB-Es的重组基 因工程菌；用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-Es; 3) 对重组表达的LTB-Es蛋白进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
[0007] 本发明利用pET30a( + )表达性载体构建了能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es的大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了 26kD重组目的蛋白。 将重组蛋白纯化后制备成基因工程亚单位疫苗，免疫14日龄鸭群，免疫后可以使鸭群获得 免疫保护。
【具体实施方式】
[0008] 申请人:在获得一个具有免疫特性的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，并进一步 通过大肠杆菌稀有密码子优化获得其基因，然后通过pET30a( + )原核表达载体构建出能表 达蛋白LTB-Es的大肠杆菌BL21 (DE3)重组基因工程菌，通过对工程菌的诱导、超声破碎、蛋 白纯化、定量、与佐剂配比等制备和生产方法制备出了鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗。
[0009] 下面结合【具体实施方式】来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是， 在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或 替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。
[0010] 实施例1鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es的获得 1、利用生物软件对鸭坦布苏代表毒株ZJ-6(GenBank登录号JF459991. 1)的包膜蛋白E进行抗原表位分析，选定E蛋白抗原性较强DomainIII位置（303-410aa)与LTB序列进行 拼接，中间设计Lingker(GGGSGGGS)进行连接，获得一种新型鸭坦布苏病毒E蛋白Domain III和LTB的融合蛋白LTB-Es，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO: 1，并利用在线生物 软件DNAWorks进行大肠杆菌稀有密码子优化，获得融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列SEQID N0:2。
[0011]将新获得的融合蛋白LTB-Es的核苷酸序列进行全基因合成，同时两端分别加上BamHI和HindIII酶切位点。
[0012] 实施例2基因工程蛋白表达载体的构建与工程菌的获得 1、上述全基因合成的融合蛋白LTB-Es基因用BamHI和HindIII双酶切后连入pET30a载体相应的酶切位点，构建pET30a/Es表达载体。
[0013] 2、用CaCl2法将pET30a/Es表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于含50iig/ ml卡那霉素的琼脂平板，37°C过夜培养。选取10个单菌落提取质粒，BamHI和HindIII 双酶切验证阳性的菌落进一步测序鉴定。将测序验证后的阳性克隆在LB培养基中发酵培 养至0. 6?0. 8时加入0. 3mMIPTG诱导4?5小时，离心收集菌体跑SDS-PAGE电泳，同时 设立未诱导菌体作为对照。结果诱导后阳性克隆比对照菌在26kD处多出一条蛋白条带，与 重组蛋白理论分子量一致，表达量约为30%以上。经鸭坦布苏病毒抗体免疫印迹检定，显示 阳性反应。证明获得的阳性克隆为高效表达基因工程蛋白的工程菌，命名为LE株。
[0014] 实施例3发酵、纯化与鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗的制备规程 1菌毒种 1.1制造用菌种为鸭坦布苏病毒基因工程亚单位疫苗生产菌LE株；检测用的强毒株 为鹅源坦布苏SD株。
[0015] 1.2生产用菌种标准 1. 2. 1形态和生化特性 含有卡那霉素的LB琼脂平板上过夜培养，在培养板上呈现圆形、边缘整齐、突起、乳白 色有光泽的光滑菌落，革兰氏染色后，镜下显示为革兰氏阴性短杆菌；生化试验结果均为葡 萄糖发酵+，吲哚试验+，甲基红试验+，VP_，枸橼酸利用试验_。
[0016] 1.2. 2培养特性可在含有卡那霉素的培养基中生长。
[0017] 1.2.3鉴别检验 1. 2. 3. 1PCR检测将本菌的LB液体培养物3ill做模板，用以下PCR引物进行PCR扩增，应能扩增出418bp左右的片段。
【权利要求】
1. 一种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es基因，其特征在于，所述的基因的编码蛋白 的氨基酸序列为SEQ ID N0:1。
2. 如权利要求1所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID N0:2。
3. -种鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为 SEQ ID N0:1。
4. 权利要求1所述的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es基因在制备疫苗中的应用。
5. -种鸭坦布苏病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求3所述 的鸭坦布苏病毒新型融合蛋白LTB-Es。
6. 如权利要求5所述的疫苗，其特征在于，所述的疫苗中鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es 的浓度为 0? 1-0. 5mg/ml。
7. 权利要求5所述的疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括有如下的步 骤： 1) 将LTB-Es基因连入原核表达载体中，构建成重组表达质粒； 2) 将构建的重组表达质粒转化宿主菌，构建能表达鸭坦布苏病毒新型融合蛋白 LTB-Es的重组基因工程菌，用该重组基因工程菌表达出新型融合蛋白LTB-Es ; 3) 对重组表达的新型融合蛋白LTB-Es进行纯化后，加入白油佐剂制成疫苗。
【文档编号】A61P31/14GK104328135SQ201410569393
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年10月23日 优先权日:2014年10月23日
【发明者】侯竹美 申请人:青岛农业大学