基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，属于生物病 毒检测技术领域。
【背景技术】
[0002] 宏基因组学诞生于上世纪90年代，是指不经过微生物培养阶段，采用直接提取环 境中总DNA和总RNA的方法，对微生物基因总和进行研究的一口新学科.宏基因组技术的 出现，使得人们对占微生物总体99%W上不可培养微生物的研究成为现实，微生物基因的 可探测空间显著增大.总的来说，目前宏基因组技术的应用主要分为两个方面：一方面是 筛选功能基因，开发具有所需功能的蛋白；另一方面是通过对宏基因组文库进行分析，探 讨在各种环境下微生物间相互作用和微生物与周围环境间相互影响的规律，W便我们能更 加客观、全面地认识微生物世界.在宏基因组技术的应用范围被不断扩展的同时，围绕着 宏基因组文库的构建和筛选、测序和分析等方面的研究已成为宏基因组学发展的主要推动 力，宏基因组技术的进步将不断提升其应用价值。
[0003] 病毒宏基因组学（viralmetagenomics)是宏基因组学的一个分支，它是研究特定 环境中病毒群落的一项技术方法。利用病毒宏基因组学方法进行未知病毒的鉴定及研究已 经得到了普遍认可。
[0004] 2010年，科研人员发现一种导致蛋鸭产蛋大幅下降，后期伴有神经症状的新型病 毒病。由于该病剖检症状主要呈现卵泡变性、变形，卵泡膜充血、出血，因此命名为鸭出血性 卵巢炎（duckhemorrhagicovaritis,D册）。随着关于该病的病原信息被越来越多的研究 所掲示，发现病毒和坦布苏病毒亲缘关系最近。2011年，中国畜牧兽医学会第一届水禽疫病 防控研讨会正式将该病名称统一为"鸭坦布苏病毒病"，并确定为一种新型鸭黄病毒-鸭坦 布苏病毒值uckTembusuvi;rus，DTMUV)。然而，最初该未知病原的发现，受制于常规检测技 术的局限性，基因组序列信息严重缺乏，病原信息并未快速掲晓，因此病因众说纷运，疫情 得不到及时有效的控制，造成了疫情的蔓延和巨大经济损失。及早发现、鉴别未知或新发病 原是疾病防控的关键，同时对疾病的临床治疗也具有重要的指导意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是：通过建立一套基于病毒宏基因组学的鸭坦布苏病 毒的鉴定技术。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：
[0007] 本发明提供的基于宏基因组学的鸭坦布苏病毒非诊断性检测方法，包括下列步 骤：
[000引 （1)样品处理：
[0009] 将细胞培养样品冰浴融化，组织样品研磨后离屯、，12000g离屯、5min，取上清用 0. 22ym滤膜过滤，此过程在超净工作台中完成；然后取滤液加入面aseI、化aseA各 1.5化、10乂面曰36 18扯'6重40化，于37°(：水浴311，^降解样品中宿主游离核酸，然后置 75°C水浴lOmin，灭活歴aseI;
[0010] 似DM和RNA的提取：
[0011] 处理后的样品均分为两份，200yL样品用QIAGenDM提取试剂盒提取DM,另外 200yL按化easyMiniKit提取试剂盒操作步骤提取RNA;
[0012] (3)RNA样品的反转录等溫链位移扩增
[0013] 每份病毒RNA样品溶解于5yL的RNase水，用OvationRNA-SeqSystemV2基因 组扩增试剂盒进行扩增，等溫链位移扩增的反应条件为：
[0014]
[0015] (4)核酸文库的制备
[0016] 上述样本全部扩增完毕后，用PCR纯化试剂盒进行纯化；分别取lOOng纯化产物， 用IonShear?PlusReagentKit进行酶切打断5min，酶切产物加入1.8倍体积AMF^urc'*XPBeads纯化，然后分别加入不同的IonXpressTMBarcode接头，E-Gel胶选择片段构建 文库；用Pktim批1?PCR扩增试剂盒进行文库扩增，IonLibraryqPCRMix鉴定文 库质量；
[0017] (5)IonTorrent测序
[0018] 取20yL终浓度为3(K)ng/L的工作文库上机Ion化efSystem进行油包水PCR 和碱裂解法制备单链模板，最后将带有模板的微粒溶液自动点样至314忍片中，上机Ion torrentPGM进行高通量测序；
[0019] (6)生物信息学分析
[0020] 上机测序后经PGM测序仪自动运行得到的测序结果，解析为sff格式的原始文件 fastq格式的测序序列数据；将化stq格式的测序序列进行过滤，筛除低质量序列、过段序 列及错误序列；选取GenBank中批量下载的黄病毒科全基因序列作为参考序列，将测序数 据通过Blast比对到参考序列中，通过覆盖参考序列的序列数量、比例W及参考序列被覆 盖的长度判断样品中是否有对应的病毒；
[0021] (7)系统进化分析与遗传距离计算
[0022] 将测得序列通过DNAstar、MEGA6.0软件的MegAlign模块，对病毒全基因组与 GenBank中已发表的坦布苏病毒W及其他黄病毒科成员进行同源性比对，并针对病毒NS5 基因基于邻接法（nei曲bor-joiningmethod)构建系统进化树，计算遗传距离。
[002引从GenBank下载参考序列的毒株（见表1)，从GenBank下载的NS5基因参考序列 (见表2)
[0024]表1从GenBank下载的参考序列毒株及其缩写
[00巧]
[0027]表2从GenBank下载的NS5基因参考序列毒株及其缩写
[0028]
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] 刘胜旺、张現、刘晓丽等在《东北农业大学学报》上发表过曾对分离自山东鸭场的 病毒Du/CH/LSD/1101282株进行全基因组测序的研究，确证了病毒的基因信息属坦布苏病 毒与己格扎病毒亲缘关系较近，但遗传距离介于病毒种的水平上。但全基因扩增引物设计 较为繁琐，且需多达10对引物的设计才最终对病毒进行了确证。
[0032] 在本发明中，采用二代高通量测序，将样品核酸进行短片段文库制备，避免了常规 试验中的细菌转化、培养W及单克隆的挑选，短时间即可获得大量数据，可快速注释病原体 的全部遗传信息。
[0033] 本发明针对提取的RNA样本首次采用等溫链位移扩增技术，高效扩增了RNA类病 毒样本的核酸序列，并成功构建高质量的核酸文库。SPIA是一个强健的等溫链位移扩增过 程。它用一个DNA/RNA嵌合SPIA引物，DNA引物和RNA酶抑制剂在一个同质的等溫实验中 可提供效率很高的DNA序列扩增过程。RNA酶抑制剂在DNA/RNA异源双链的第一链5'端习 惯于降解RNA。DNA酶启动3'端的引物复制，置换了既有的上游链。新合成的链5'端RNA 部分可再次被RNA酶抑制剂去除。遗弃的独特引物位点可提供新一轮的cDNA合成。整个 SPIA过程由引物结合，DNA复制，第一链置换和RNA切割地等过程重复，可快速积累SPIA cDNA。
[0034] 鸭坦布苏病毒基因组为单股正链RNA,含有一个开放阅读框，编码顺序为5'UTR-C -PrM-E-NSl-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-UTR3'，国际上，通常W黄病毒NS5 基因 3' 端 长约化b的区域同源性作为黄病毒属的病毒分类依据，且同源性在84%W上的分离株定义 为同一种病毒。在本发明中，将测得的数据与其他黄病毒科成员进行同源性比对，发现全基 因组的核巧酸同源性比对与近=年我国发生在鸭群中的坦布苏病毒在98%W上。选取其中 的NS5基因进行核巧酸同源性比对，发现与坦布苏病毒在87%W上，证实该株病毒符合鸭 坦布苏病毒特征，属黄病毒科、黄病毒属，蚊媒恩塔亚病毒群。
[0035] 本发明建立的基于未知病原SPIA扩增结合高通量测序非诊断性检测方法，3小时 W内即可完成病毒前处理，5小时内即可完成上级测序步骤，24小时W内即可同步获知坦 布苏病毒基因的核酸信息，可针对细胞培养样品、鸭源组织样品、养殖环境样品等，样品覆 盖度广，是一种鸭坦布苏病毒监控的有效新方法。
【附图说明】
[0036] 下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0037] 图1:目标文库及不同稀释度标准样品的扩增曲线。1 :6. 8pM标准品扩增曲线； 2:0. 68pM标准品扩增曲线；3:0. 068pM标准品扩增曲线；TB:目标检测文库扩增曲线。
[0038] 图2:IonTorrent测序仪读取序列数。
[0039] 图3 :序列捜索比对结果。
[0040] 图4 :QD株与其他GenBank已公布序列的核巧酸同源性比较。
[0041] 图5 :NS5基因核巧酸序列比对图。
【具体实施方式】
[0042] 实施例1本发明的方法在病毒感染的细胞培养样品中坦布苏病毒的确认和生物 分型上的应用实例
[0043] 1材料和方法
[0044] 1. 1 病料
[0045] 病毒感染的细胞培养样品为青岛某公司送检，病毒分离未能确定病原，用常规PCR 诊断方法亦未能确定。鸭胚成纤维细胞、BHK细胞由申请人实验室保存；
[0046] 1. 2分子生物学试剂
[0047] DlfeseI、I?nase A购自天根生物技术有限公司；Agcncourt''AMF*urc。XP Reagent为Hiermo公司产品；DneasyKit,I^neasyMiniKit为QIAGen公司产品；Ovation RNA-SeqSystemV2 基因组扩增盒购自Nugen公司；IonShear?PlusReagentKitJonX press?BarcodeX、Platimim?PCRSuperMix、LibraryAmplificationPrimerMix、Ion LibraryTaqMani'qPCRMix试剂盒均为LifeTechnologies公司产品。
[0048] 1. 3主要仪器StepOnePLUS巧光PCR仪购自ABI公司。IonChefSystem核酸前 处理仪，IonTorrent测序仪购自美国化ermo公司。
[0049] 1.4.未知样品的处理
[0050] 1. 4. 1样品处理：将细胞培养样品冰浴融化，组织样品研磨后离屯、，12000g离屯、 5min，取上清用0. 22ym滤膜过滤，此过程在超净工作台中完成。然后取滤液加入面ase I、化aseA各1.5yL、10X面aseIBuffer40yL，于37°C水浴