专利名称：大片段海绵宏基因组dna快速提取方法
技术领域：
本发明涉及一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，可用于宏基因组文库的构建及相关功能基因或基因簇的筛选。属于海洋生物的分子技术领域。
背景技术：
海绵距今已有6-8亿年的历史，是一种相当原始的多细胞动物。目前发现大约15000种海绵，是海洋中除珊瑚外的第二大生物量。海绵基因组庞大，而且以单拷贝为主，内含子较少。此外，海绵还具有丰富的共附生微生物，涵盖了古细菌、细菌、蓝细菌、真菌等多种微生物。海绵也是目前发现的海洋活性物质最多的海洋生物之一，这也从侧面反映了海绵体内所蕴含的极其丰富的基因资源。
宏基因组技术为功能基因组学的研究提供了一个良好的平台，其着眼于环境样品的混合基因组，是一个高容量、高通量的分子技术。基于宏基因组DNA的功能基因筛选、克隆表达途径为利用海绵及其共附生微生物丰富的基因资源提供了可能。然而，这一切都是建立在高质量的大片段宏基因组DNA提取技术之上，例如Fosmid文库构建需要大于40000个碱基的DNA样品，因此对于海绵开展宏基因组研究必须首先建立高效的DNA提取方法。
海绵独特的生理结构、庞大的基因信息量决定了海绵宏基因组大片段DNA提取的困难，目前还没有关于海绵宏基因组大片段DNA提取的简便技术。因此，迫切需要开发一种适合不同海绵的快速、不易引起DNA降解的海绵宏基因组大片段DNA提取方法，来满足海绵功能基因组学研究的需要。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足和实际需求，提供一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，能够方便迅速的对不同的海绵进行宏基因组大片段DNA的提取，满足海绵功能基因组学研究的需要。
为实现这一目的，本发明的技术方案中，为避免机械力对细胞与DNA的损伤，采用温柔的机械和化学处理结合的方法分散海绵细胞及其共附生微生物，再在NaOH碱性环境下辅助以低浓度的表面活性剂十二烷基肌氨酸钠使混合细胞破壁，并使其中的DNA酶失活，之后在二价阳离子Ca2+存在下，利用蛋白酶K消化。经过全方位的破壁消化释放核酸，再利用Tris(三羟甲基氨基甲烷)-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液以及氯仿、异戊醇混合溶液提取，再加入醋酸钠及异丙醇沉淀，RNA酶消化RNA后得到DNA，琼脂糖凝胶电泳检测。
本发明的方法具体步骤如下1、海绵组织分散及混合细胞收集在无菌条件下切取海绵组织，浸泡于无钙、镁的人工海水中撕成1-3mm3的小块，继续室温静置悬浮释放细胞，吸取上层悬浊液得到混合细胞样品。
2、破壁与DNA释放将混合细胞样品离心得到混合细胞，加入碱性破壁缓冲液轻轻颠倒混匀，碱性破壁缓冲液pH 11.5，由50mM Tris、5mM乙二胺四乙酸、1％十二烷基肌氨酸钠构成，再加入蛋白酶K反应缓冲液处理，将pH值调回8.0，蛋白酶K反应缓冲液pH 3.0，由50mM Tris、15mM CaCl2构成，再加入蛋白酶K混匀后45-55℃水浴处理。
3、宏基因组大片段DNA的提取在上述处理后的细胞溶液中加入Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；离心取上清，加入氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；离心得到上清，按照与上清液0.1-0.2倍体积的比例加入醋酸钠并加入与上清液等体积的异丙醇，析出DNA；离心去除异丙醇，DNA沉淀用70-75％的乙醇洗涤，离心去除乙醇，干燥后DNA用TE缓冲液溶解，并用不含DNA酶的RNA酶35-40℃水浴消解去除RNA，最后用琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收大片段DNA。
本发明方法简便，适合对各种不同的海绵进行宏基因组大片段DNA的提取，迅速高效，可在1.5小时以内得到长度大于40000个碱基的海绵宏基因组DNA。本发明方法可用作宏基因组文库的构建、相关功能基因或基因簇的筛选，以满足海绵功能基因组学的研究的需要。
图1为本发明的技术路线流程图。
图2为本发明实施例中四种海绵宏基因组大片段DNA的电泳图。
具体实施例方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步描述。
实现本发明的技术路线如图1表示，首先获得海绵样品，机械、化学分散海绵组织获得混合细胞，之后消化使细胞破壁释放出DNA，进行宏基因组DNA的抽提。
本发明的具体实施方案如下1、海绵组织分散及混合细胞收集(1)用无菌手术刀切取海绵组织少许，装入加有适量无菌的无钙、镁的人工海水(CMFSW)的5ml离心管中，用大口径枪头稍加搅动，并适当吹打；(2)用无菌钝头镊子撕成1-3mm3的小块，于原悬液中悬浮，用大口径枪头吹打数分钟；(3)10000rpm离心1min，去上清；(4)加入适量无菌CMFSW，用大口径枪头吹打重新悬浮，重复步骤3；(5)加入适量无菌CMFSW，用大口径枪头吹打重新悬浮，室温静置几分钟，将上层悬浊液(细胞悬液)转移至另一无菌5ml离心管中，得到混合细胞样品；(6)细胞计数2、细胞破壁与DNA释放(1)按每份3×108个细胞将细胞悬液分装于无菌1.5ml EP管中，10000rpm离心1min，去上清，加入100μl无菌CMFSW，用无菌大口径枪头吹打重悬均匀得到细胞悬液；
(2)向细胞悬液中加入150μl碱性破壁缓冲液(50mM Tris、5mM EDTA、1％十二烷基肌氨酸钠、pH 11.5)，轻轻颠倒混匀几分钟；(3)加入150μl PK反应缓冲液(50mM Tris、15mM CaCl2、pH 3.0)，15μl PK(2.5mg/ml)，轻轻颠倒混匀，55℃水浴消化半小时得到细胞消化液；(4)向细胞消化液中加入20μl 0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0)，轻轻颠倒混匀；3、宏基因组大片段DNA的提取(1)在上述处理后的细胞溶液中加入与细胞溶液等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液，Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1，轻轻颠倒混匀5min，5000rpm，5min，将上清液转移至另一无菌1.5ml EP管中；(2)加入与上清液等体积的氯仿、异戊醇混合溶液，氯仿∶异戊醇为24∶1，轻轻颠倒混匀5min，5000rpm，5min，将上清液转移至另一无菌1.5ml EP管中；(3)加入0.1V 3M的醋酸钠，加入与上清液等体积预冷的异丙醇，轻轻混匀；(4)10000rpm，15min，去上清，沉淀加入500μl 70％的乙醇洗涤；(5)10000rpm，15min，去上清，风干，沉淀加入35μl无菌TE以及5μl不含DNA酶的RNA酶，37℃水浴10min，70℃灭活5min，于4℃冰箱保存备用。
(6)电泳检测0.7％琼脂糖，3V/cm电泳过夜，EB染色观察。上样量为2μlLoading Bμffer+5μl样品，Marker上样量也一样。
采用本发明的方法对我国南海细薄星芒海绵、皱皮软海绵、贪婪倔海绵和澳大利亚厚皮海绵四种海绵进行了宏基因组DNA的提取，获得了高质量的混合基因组DNA样品，结果见图2。图2中A、B、C、D分别代表南海细薄星芒海绵、皱皮软海绵、贪婪倔海绵和澳大利亚厚皮海绵，‘M’指Lambda Mix Marker。由图可见，提取的DNA片段均在50000个碱基左右，可以满足Fosmid基因文库的构建需要。
权利要求
1.一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，其特征在于包括如下步骤(1)海绵组织分散及混合细胞收集在无菌条件下切取海绵组织，浸泡于无钙、镁的人工海水中撕成1-3mm3的小块，继续室温静置悬浮释放细胞，吸取上层悬浊液得到混合细胞样品；(2)破壁与DNA释放将混合细胞样品离心得到混合细胞，加入碱性破壁缓冲液轻轻颠倒混匀，碱性破壁缓冲液pH 11.5，由50mM Tris、5mM乙二胺四乙酸、1％十二烷基肌氨酸钠构成，再加入蛋白酶K反应缓冲液处理，将pH值调回8.0，蛋白酶K反应缓冲液pH 3.0，由50mM Tris、15mM CaCl2构成，再加入蛋白酶K混匀后45-55℃水浴处理；(3)宏基因组大片段DNA的提取在上述处理后的细胞溶液中加入Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，Tris-饱和酚∶氯仿∶异戊醇的体积比为25∶24∶1；离心取上清，加入氯仿、异戊醇混合溶液进行处理，氯仿∶异戊醇的体积比为24∶1；离心得到上清，按照与上清液0.1-0.2倍体积的比例加入醋酸钠并加入与上清液等体积的异丙醇，析出DNA；离心去除异丙醇，DNA沉淀用70-75％的乙醇洗涤，离心去除乙醇，干燥后DNA用TE缓冲液溶解，并用不含DNA酶的RNA酶35-40℃水浴消解去除RNA，最后用琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收大片段 DNA。
全文摘要
一种大片段海绵宏基因组DNA快速提取方法，无菌条件下用无钙镁人工海水浸泡海绵样品并撕成1－3mm
文档编号C12N15/12GK1821402SQ200610024278
公开日2006年8月23日 申请日期2006年3月2日 优先权日2006年3月2日
发明者李志勇, 吴杰 申请人:上海交通大学