一种经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA的方法与流程

本发明属于酿酒技术领域，具体涉及白酒生产企业中的一种经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA的方法。

背景技术：

酒醅中微生物基因组DNA提取是研究白酒酿造过程中微生物组成、微生物功能、微生物代谢和微生物与环境关系的必须条件。因此，酒醅基因组DNA的提取速度、提取质量在白酒生产及研究中起着重要作用。

目前，对酒醅中微生物基因组DNA提取的方法可分为手提和试剂盒法。手提法采用液氮研磨破壁或者酶解破壁、苯酚：氯仿：异戊醇(P.C.I)纯化、异丙醇或乙醇沉淀DNA、水溶解DNA。该方法虽然成本低，但耗时较长、劳动强度大、提取的DNA质量不高。试剂盒法采用配置好的试剂，只需按流程操作即可。该方法虽然操作简单，但是由于酒醅中微生物数量较少，50mL规格试剂盒吸附柱损失较大，提取出来的DAN浓度很低，2mL规格试剂盒耗时较长、劳动强度大；且同样存在浓度低的问题，需要将多个重复的样本的DNA合并，导致成本昂贵，不适合企业的常规检测。

因此，本领域需要一种经济快速提取酒醅中基因组DNA的方法。

技术实现要素：

为了解决现有技术中酒醅基因组DNA提取存在的问题，在白酒生产研发中，为了经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA，本发明提供了一种经济快速高质量提取酒醅中微生物基因组DNA的方法。该方法结合手提和试剂盒方法，对现有方法改进优化，综合考虑提取成本、操作简便性、劳动力和提取质量等。通过比较验证，开发一种经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA的方法。该方法操作简便、耗费成本低、劳动强度小、节约时间、提取的酒醅中微生物基因组质量高。

具体通过以下技术方案实现：

一种经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA的方法，包括以下步骤：

1)酒醅中微生物细胞破壁：将研磨剂、酒醅样品和裂解液三者混合，高速震荡，然后离心；

所述的研磨剂为玻璃珠、石英砂、氧化铝；优选地，为石英砂；更优选地，为12-20目的石英砂；更优选地，为16目的石英砂。

2)核酸纯化。

在本发明优选的实施例中，所选择的研磨剂石英砂。石英砂坚硬度高、有棱角，玻璃珠表面平滑，在相同时间内石英砂破碎效果好于玻璃珠；其次，酒醅样品DNA提取所需研磨剂较多，石英砂成本低于玻璃珠。研磨剂的种类和粒径有多种，在本发明公开的多种粒径的玻璃珠和石英砂研磨剂中，采取12-20目的石英砂作为研磨剂，能够提取出高浓度的基因组DNA。

其中，步骤1)中，

研磨剂、酒醅样品和裂解液的三者的比例为15～22g:6～9g:16～24mL；优选地，为18.5g:7.5g:20mL；

裂解液配方如下：1.5-2.5％CTAB(w/v)，90-112mM Tris-HCl(pH 8.0)，18-24mM EDTA(pH8.0)，1.2-1.6M NaCl；优选2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl；

离心转数为10000rpm，离心时间为10min。

步骤2)中，核酸的纯化具体包含以下步骤：

a)除杂：取步骤1)中的离心后的上清液加入P.C.I，混匀，离心；

所述的P.C.I为24-26体积苯酚：23-25体积氯仿：0.5-1.5体积异戊醇；优选25体积苯酚：24体积氯仿：1体积异戊醇；

P.C.I与上清液的体积比为1:0.8～1.2；

离心转数为10000rpm，离心时间为20min。

b)吸附：取步骤是a)中的上清液与硅胶膜结合液混匀，然后过核酸纯化柱，离心弃滤液；所述的硅胶膜结合液为pH为4-6.5的盐酸胍与乙酸钾的混合液。

在本发明优选的实施例中，所述的硅胶膜结合液为pH为5的盐酸胍与乙酸钾的混合液。

在本发明优选的实施例中，选取的核酸纯化柱为15mL的核酸纯化柱；更优选地，所述的核酸纯化柱含有8层或以上的硅胶膜。当硅胶膜的层数达到一定数量时，DNA能够稳定地附着在硅胶膜上，在后面洗柱的步骤中不易脱落下来。所述的核酸纯化柱可以选择市售的核酸纯化柱。

上清液与硅胶膜结合液的体积比为1:1.5～2.5；

硅胶膜结合液为：3-4M盐酸胍：0.5M乙酸钾；优选4M盐酸胍：0.5M乙酸钾。

c)洗柱：加入2.5-3.5mL 70％乙醇过核酸纯化柱，然后高速离心甩干核酸纯化柱，自然条件下干燥；

洗柱的次数为两次；

自然干燥的时间为30～60min；优选地，为40min。

d)洗脱：在核酸提取柱的硅胶膜上加洗脱液溶解DNA，离心洗脱下DNA溶液。

所述的洗脱液选自无菌水或TE溶液；

洗脱液的体积为50～300μL；

离心转数为10000rpm，离心时间为2min。

一种经济快速提取酒醅中微生物基因组DNA的方法，其特征在于更具体的步骤如下：

将12～20目的石英砂灭菌烘干后，称取15～22g装入50mL无菌离心管中；

称取6～9g酒醅样品于离心管，加入16～24mL裂解液，均质仪震荡1min，10000rpm离心10min；

转移上清至50mL无菌离心管中，加0.8～1.2mL的P:C:I，摇匀，11000rpm离心20min；所述的P.C.I为25体积苯酚：24体积氯仿：1体积异戊醇。

转移上清至50mL无菌离心管中，加1.5～2.5mL的硅胶膜结合液，摇匀；用15mL核酸纯化柱过滤，弃滤液；硅胶膜结合液为pH为5的盐酸胍和乙酸钾的混合液。

吸附柱中加2.5～3.5mL 70％乙醇，过滤，弃滤液，重复一次。

10000rpm空管离心2min，弃滤液；

纯化柱自然条件下干燥1h，加入50～300μL无菌去离子水或TE溶液溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

所述的裂解液配方如下：2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0)，20mM EDTA(PH8.0)，1.4M NaCl。

所述的硅胶膜结合液配方如下：4M盐酸胍：0.5M乙酸钾。

所述步骤15mL核酸纯化柱含有8层硅胶膜。

发明人发现，特定的研磨剂的选择可以在很大程度上影响将纯化柱纯化方法应用于酒醅微生物DNA提取的提取效果。在多种研磨剂量中，一定目数的石英砂呈现出突出的适应性优势。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果如下：

1.快速：液氮研磨破壁需30min，而且耗费体力；酶解破壁至少需2h；本方法只需高速震荡1min，即可使细胞破碎，释放核酸。整个DNA提取的时间为2～2.5h，而液氮研磨需4～4.5h，酶解破壁需4.5～5h。

2.成本低：试剂盒法提取一个样品需300元左右成本，而本方法可以将成本控制在50元以内，该方法操作简便、耗费成本低、劳动强度小。

3.DNA质量高：手提法中采用乙醇或异丙醇沉淀核酸方法，核酸所含杂质较多，一般需加入纯化步骤；本方法采用硅胶膜吸附DNA，无需纯化，提取基因组DNA质量高。本方法提取的基因组DNA质量与试剂盒法相当。

4.本发明采用特定目数的石英砂作为破壁的研磨剂，在酒醅微生物的DNA提取中取到非显而易见的效果。现有技术中酒醅DNA提取的破壁为液氮或酶解法，上述两种方法费时费力；或者采用了DNA提取试剂盒中玻璃珠作为研磨剂，然而，玻璃珠作为本发明的研磨剂时，由于表面平滑，在相同时间内破壁效果比石英砂差；其次，本实验所需研磨剂较多，石英砂的成本远低于玻璃珠。

综上，本发明采用手提法和试剂盒结合的方法，在节省时间和成本的前提小，可以保证DNA提取的质量和浓度基本上达到采用试剂盒法，有利于白酒生产企业中大规模地应用此酒醅微生物DNA提取的方法。

附图说明

图1为本发明提取酒醅中微生物基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳成相图。

图2为本发明提取酒醅中微生物基因组DNA的浓度测定。

图3为不同的研磨剂破壁效果比对琼脂糖凝胶电泳成相图。

图4为对比例1提取酒醅中微生物基因组DNA的浓度测定。

图5为对比例2提取酒醅中微生物基因组DNA的浓度测定。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

下列实施例中的操作步骤以在50mL离心管操作为例。如需其他规模提取，按比例缩小或放大试剂与样品量即可。

两种试剂的配置

1.裂解液

裂解液组分(CTAB)

2％CTAB(w/v)，100mM Tris-HCl(pH 8.0),20mM EDTA(pH8.0),1.4M NaCl。

裂解液制备方法

配置Tris-HCl，pH调为8.0，灭菌；配置EDTA，pH调为8.0，

灭菌；四种组分混合后，灭菌。

2.硅胶膜结合液

(1)硅胶膜结合液组分

4M盐酸胍，0.5M乙酸钾(pH 5.0)。

(2)硅胶膜结合液制备方法

两种组分混合后，用浓盐酸将pH调至5.0，灭菌。

实施例1酒醅中微生物基因组DNA提取

1.将16目的石英砂灭菌烘干后，称取18.5g装入50mL无菌离心管中。

2.称取7.5g酒醅样品于离心管，加入20mLCTAB提取液，均质仪震荡1min，10000rpm离心10min。。

3.转移上清至50mL无菌离心管中，加0.8～1.2倍体积P:C:I(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，摇匀，11000rpm离心20min。

4.转移上清至50mL无菌离心管中，加1.5～2.5倍体积硅胶膜结合液，摇匀；用15mL吸附柱过滤，弃滤液，滤完为止。

5.吸附柱中加3mL 70％乙醇，过滤，弃滤液。

6.重复步骤5一次。

7.10000rpm空管离心2min，弃滤液。

8.吸附柱自然条件下干燥1h，加入300μL无菌水溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

实施例2酒醅中微生物基因组DNA提取

1.将12目的石英砂灭菌烘干后，称取15g装入50mL无菌离心管中。

2.称取6g酒醅样品于离心管，加入16mLCTAB提取液，均质仪震荡1min，10000rpm离心10min。。

3.转移上清至50mL无菌离心管中，加等体积P:C:I(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，摇匀，11000rpm离心20min。

4.转移上清至50mL无菌离心管中，加2倍体积硅胶膜结合液，摇匀；用15mL吸附柱过滤，弃滤液，滤完为止。

5.吸附柱中加2.5mL 70％乙醇，过滤，弃滤液。

6.重复步骤5一次。

7.10000rpm空管离心2min，弃滤液。

8.吸附柱自然条件下干燥1h，加入50μL无菌水溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

实施例3酒醅中微生物基因组DNA提取

1.将20目的石英砂灭菌烘干后，称取22g装入50mL无菌离心管中。

2.称取9g酒醅样品于离心管，加入24mLCTAB提取液，均质仪震荡1min，10000rpm离心10min。。

3.转移上清至50mL无菌离心管中，加等体积P:C:I(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，摇匀，11000rpm离心20min。

4.转移上清至50mL无菌离心管中，加2倍体积硅胶膜结合液，摇匀；用15mL吸附柱过滤，弃滤液，滤完为止。

5.吸附柱中加3.5mL 70％乙醇，过滤，弃滤液。

6.重复步骤5一次。

7.10000rpm空管离心2min，弃滤液。

8.吸附柱自然条件下干燥40min，加入300μL无菌水溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

对比例1手提法提取酒醅样品中的DNA

提取方法参考文献(李德林,敖宗华,邓波,等.酒醅微生物总DNA提取方法研究[J].酿酒科技,2014,1:013.),具体如下：取7.5g酒醅于研钵中，加入液氮充分研磨，转入离心管加入15mL CTAB抽提液(2％CTAB、5moL/L NaCl、1moL/L Tris-HCl(pH8)、0.5moL/L EDTA)和300μL巯基乙醇，65℃恒温混匀仪振荡30min，加入75μL蛋白酶k(20mg/mL)，55℃恒温混匀仪振荡30min室温以5000r/min离心10min，收集上清液。加入等体积酚氯仿异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，以12000r/min离心10min，取上清液加入等体积氯仿异戊醇(24∶1)12000r/min离心5min，取上清液，重复2次，加入0.6体积预冷的异丙醇后于-20℃下沉淀1h后以12000r/min离心10min，小心倒掉液体。沉淀用70％voL乙醇洗涤数次，提取得到DNA吹干后加入TE溶解，-20℃保存。

对比例2试剂盒法提取酒醅样品中的DNA

提取方法参 Soil DNA IsoLation kit试剂盒说明书。具体步骤如下：

1、往 Bead Tube中加入15mL PowerBead Solution。此组合命名为 Bead Solution Tubes。

2、加入不多于10g样品到 Bead Solution Tubes中。快速涡旋振荡1min混匀。

3、检测C1溶液。若出现沉淀，60℃水浴至全溶解。加1.2mL C1溶液到Bead Solution Tubes中，快速涡旋30s混匀。

4、把 Bead Tubes固定在涡旋仪适配器上，最大转速涡旋连续振荡10min。

5、室温2500g离心3min。

6、转移上清至一个干净的Collection Tube中。

7、加入5mL C2溶液到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育10min。

8、室温2500g离心4min。

9、避开沉淀小珠，转移上清到一个新的收集管中

10、加入4mL C3溶液到上清中，涡旋混匀5s。4℃孵育10min。

11、室温2500g离心4min

12、避开沉淀小珠，转移上清到一个新的收集管中。

13、C4溶液使用前先摇匀。加入30mL C4溶液到上清中，涡旋混匀5s。

14、把从13步获得的上清加满Spin Filter，室温2500g离心2min。弃去滤液，再次加满上清，室温2500g离心3min。重复直到过滤完所有上清。

15、加入10mL C5到Spin Filter中，室温2500g离心3min。弃去滤液。

16、室温2500g离心5min.

17、小心转移Spin Filter到2mL收集管中，尽量避免C5溶液污染。

18、加入5mL C6溶液到白色滤膜中心。室温2500g离心3min.

19、弃去Spin Filter。此时收集管中的DNA可直接用于下游实验，无需进一步纯化。

实施例1、对比例1、对比例2的提取效果比对见表1。关于提取时间：与手提法相比，本发明的提取时间缩短了近1半，以传统的试剂盒相比，时间也缩短了0.5-1h；关于提取成本：与传统试剂盒比较，本发明的提取成本降低了6倍；关于提取浓度：本发明的浓度约为手提法的两倍左右，与试剂盒法的浓度相当；关于纯度：OD260是核酸吸收的最高峰，OD280是蛋白吸收的最高峰，OD230是有机试剂和多糖的吸收峰，当OD260/280处于1.8-2.0时，核酸的纯度较高，纯净的核酸OD260/230应该大于等于2.0，本发明与试剂盒法均能获得较纯净的DNA，而手提法OD260/280小于1.8，表明易受到蛋白的污染，OD260/230小于2.0，表示该提取方法难以去除碳水化合物、多肽、苯酚等。综上，本发明在保持高浓度和纯度的前提下，显著的降低了酒醅样品DNA提取的成本和时间，十分有利于企业大规模地提取酒醅样品的基因组DNA。

表1实施例1、对比例1、对比例2的提取效果比对

实施例4不同的研磨剂效果比较

1.分别将5、12、16、20和25目的石英砂，以及12目、16目、20目玻璃珠灭菌烘干后，称取18.5g装入50mL无菌离心管中。

2.称取7.5g酒醅样品于离心管，加入20mLCTAB提取液，均质仪震荡1min，10000rpm离心10min。

3.转移上清至50mL无菌离心管中，加等体积P:C:I(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)，摇匀，11000rpm离心20min。

4.转移上清至50mL无菌离心管中，加2倍体积硅胶膜结合液，摇匀；用15mL吸附柱过滤，弃滤液，滤完为止。

5.吸附柱中加3.5mL 70％乙醇，过滤，弃滤液。

6.重复步骤5一次。

7.10000rpm空管离心2min，弃滤液。

8.吸附柱自然条件下干燥40min，加入300μL无菌水溶解DNA，过滤，滤液装于1.5mL无菌离心管中，-20℃保存备用。

提取效果比对见表2。石英砂虽然坚硬度高，有棱有角，而且，已经有人公开了用石英砂提取酒醅样品中的DNA，可以取到很好的破壁效果。然而，并不是所有粒径的石英砂均能与本发明后续的提取步骤相配合，提取到质优量高的基因组DNA。经本发明证实，在较小的粒径(5目)和较大的粒径(25目)，其破壁效果远远低于玻璃珠，只有在特定范围内的粒径(12-16目)时，才能发挥其破壁效果，获得高浓度(见表2)高质量(见表1)的基因组DNA。

表2不同粒径的研磨剂的提取效果比对