基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及标记和捕获多个样本的特定基因的方法和 试剂盒，特别是，涉及基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方 法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 新一代高通量测序仪的出现大大降低了核酸测序成本，其具有高通量、低成本、测 序错误率低等特点。应用第二代高通量测序技术，可以对混合的核酸分子进行序列测定，同 时分辨和测出每个独立的序列，使得该测序技术在高通量标记开发成为可能。
[0003] 随着高通量测序技术在人类疾病研究、微生物基因组测序等方面的广泛开展，如 何最大限度发挥第二代测序技术的高通量和大数据量等特点，降低单样本测序成本成为下 一步测序技术的发展方向，具有很大的市场前景和价值。
[0004] 然而，常规的PCR-index技术，对于每个PCR产物的index标签都是需要单独进行 扩增标记，然后将所有的产物混合测序，当PCR片段较多时，不仅操作繁琐，而且很难控制 片段混合的均一性，会导致最终测序结果中片段之间数据量差距巨大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是利用高通量测序技术对大量样本中的特定基因相关序列同时进 行测序分析，解决传统方法通量低、测序成本高的问题，扩大第二代测序技术在PCR测序领 域的应用。
[0006] 针对本发明的目的，本发明整合了多重扩增技术和PCR-index技术，提供了一种 新型的PCR扩增技术方案，利用PCR反应在PCR产物两端各引入一个引物标签，通过PCR产 物两端引入的引物标签可以特异地得到PCR产物的样本信息，同时通过引物标签和扩增引 物的组合，能够特异地得到PCR产物对应的样本上的基因信息。
[0007] 根据本发明的一个方面，提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一 个或多个特定基因的方法，包括以下步骤：
[0008] 第一轮扩增：使用由通用序列和针对特定基因的扩增引物组成的第一轮扩增引物 组合对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，以使每个基因的扩增产物的两端上都加上 了通用序列，其中，所述通用序列中的正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
[0009] 消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
[0010] 第二轮扩增：使用由标签（index)序列和通用序列组成的第二轮扩增引物对第一 轮扩增得到的产物进行扩增，以使扩增产物的两端都加上与其他样本区分的可识别的标签 序列；
[0011] 混合：将各样本的第二轮扩增产物混合在一起；
[0012] 回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
[0013] 测序：将回收的DNA混合物进行测序；
[0014] 分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本--对应，以及根 据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
[0015] 优选地，本发明提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个 特定基因的方法，包括以下步骤：
[0016] 1)引物设计：
[0017] 第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和 测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5'端 分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述 正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
[0018] 本发明的通用序列是一段扩增效率比较高的序列，设计通用序列遵循以下原则： (1) 通用序列本身的GC含量在40.0% - 60.0%，（2)减少通用序列添加在PCR引物上后， 对PCR引物造成的严重发卡（haripin)、二聚体（dimer)情况的出现，（3)通用序列不会和 模板进行非特异扩增；
[0019] 第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列（index序列），在正向标 签序列和反向标签序列的3'端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物 和反向标签引物，组成第二轮扩增引物（标签引物）组合，其中，设计的标签引物的数量遵 循以下规则：正向标签引物的数量X反向标签引物的数量>样本数量，以及其中，在第二 轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向 通用序列和反向通用序列相同，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标 签序列可以彼此相同或不同；
[0020] 本发明设计标签序列遵循以下原则：（1)序列本身的GC含量在40. 0% - 60. 0%， (2) 减少标签序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡（haripin)、二聚体 (dimer)情况的出现，（3)标签序列中避免3个或3个以上重复碱基，（4)标签序列之间序 列差异度大于3个碱基；
[0021] 2)第一轮扩增：将针对各样本的扩增一个或多个特定基因的第一轮扩增引物组 合混合，在适于多重扩增目的核酸的条件下对所有样本分别进行扩增；
[0022] 3)消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体；
[0023] 4)第二轮扩增：用上一步中对应样本消化后的产物作为模板，根据不同样本设计 的标签引物，进行第二轮扩增，从而分别给每个样本的各个扩增产物都加上了可以与其他 样本区分的标签序列，由此每个样本都得到带有可识别标签序列的多重PCR扩增产物；
[0024] 5)混合：将各样本的第二轮PCR扩增产物均一地混合在一起；
[0025] 6)回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带；
[0026] 7)测序：将回收的DNA混合物进行测序；
[0027] 8)分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本--对应，以 及根据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。
[0028] 优选地，步骤1中，所述标签序列的长度可以为5_20bp，更优选地，所述标签序列 的长度可以为6_8bp。
[0029] 优选地，步骤2和步骤4中，扩增所采用的酶均为高保真DNA聚合酶，由此减少扩 增带来的DNA突变率。
[0030] 优选地，步骤2中，PCR扩增只进行8-10个循环，由此减少多重扩增引物之间的扩 增效率差别。
[0031] 优选地，步骤3中，将第一轮PCR扩增产物在85°C加热5分钟，然后快速冰浴冷却， 使产物中的引物二聚体解链成单链引物，然后用单链消化酶进行消化，由此减少引物二聚 体的存在对后续扩增的影响。
[0032] 优选地，步骤3所用的单链消化酶为核酸外切酶I (Exonuclease I)，该酶为单链 特异性3' 一 5'核酸外切酶，不分解双链DNA及RNA。
[0033] 优选地，步骤4中第二轮扩增进行20-25个循环。
[0034] 优选地，步骤 7 中利用 pair-End 技术（例如 Illumina Hiseq2000、Illumina Hiseq2500和Illumina Miseq)进行测序，获得DNA混合物的序列。
[0035] 优选地，步骤7中测序采用PCR-FREE文库，由此减少相似序列之间的交叉干扰。
[0036] 另一方面，本发明还提供一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多 个特定基因的试剂盒，其中，所述试剂盒包括以下引物：
[0037] 第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和 测序方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5'端 分别加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述 正向通用序列与反向通用序列彼此不同；
[0038] 本发明的通用序列是一段扩增效率比较高的序列，设计通用序列遵循以下原则： (1) 通用序列本身的GC含量在40.0% - 60.0%，（2)减少通用序列添加在PCR引物上后， 对PCR引物造成的严重发卡（haripin)、二聚体（dimer)情况的出现，（3)通用序列不会和 模板进行非特异扩增；
[0039] 第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列，在正向标签序列和反向 标签序列的3'端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引 物，组成第二轮扩增引物（标签引物）组合，其中，设计的标签引物的数量遵循以下规则：正 向标签引物的数量X反向标签引物的数量>样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添 加的正向通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向 通用序列相同，优选地，所述标签序列的长度可以为5_20bp，更优选地，所述标签序列的长 度为6_8bp，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同 或不同；
[0040] 本发明设计标签序列遵循以下原则：（1)序列本身的GC含量在40. 0% - 60. 0%， (2) 减少标签序列添加在PCR引物上后，对PCR引物造成的严重发卡（haripin)、二聚体 (dimer)情况的出现，（3)标签序列中避免3个或3个以上重复碱基，（4)标签序列之间序 列差异度大于3个碱基。
[0041] 优选地，在本发明中，所述样本的数量可为：样本数量 < 可设计的正向标签引物的 数量X可设计的反向标签引物的数量。
[0042] 更优选地，本发明提供了一种基于高通量测序的标记和捕获多个（25个以下） 样本的嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL 5个基因的一个或多个外显子的 试剂盒，其中，所述外显子为选自 MDHB-EX0N1、SDHB-EX0N2、SDHB-EX0N3、SDHB-EX0N4、 SDHB-EX0N5、SDHB-EX0N6、SDHB-EX0N7、SDHB-EX0N8、SDHC-EX0N1、SDHC-EX0N2、SDHC-EX0N3、 SDHC-EX0N4、SDHC-EXON5、SDHC-EXON6、SDHD-EXON1、SDHD-EXON2、SDHD-EXON3、SDHD-EX0N4、 RET-EXONIO、RET-EXON11、RET-EXON13、RET-EX0N14、RET-EXON15、RET-EXON16、VHL-EXON1、 VHL-EXON2和VHL-EXON3中的一种或多种；所述试剂盒包括以下引物：
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