43] 第一轮扩增引物包括选自下列中的一对或多对：
[0046] 第二轮扩增引物包括选自下列正向标签引物和反向标签引物组成的一对或多 对：
[0057] 其中，所选择的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引物的数量X反 向标签引物的数量>样本数量^
[0058] 本发明具有如下有益效果：
[0059] 本发明通过优化多重PCR反应的循环数，使第一轮多重PCR反应只进行线性扩增， 最大限度的减少多重引物之间的扩增效率差别，通过第二轮扩增时通用引物的平行扩增， 使多重扩增产物中各个基因的相关产物量尽量接近，提高了测序数据的有效性。
[0060] 在本发明中，第一轮扩增采用的是通用序列+各个基因的特定引物组成的混合 物，这时候多重扩增起作用的是每个基因的特定序列，每个基因的前面都加上了通用序列。 第二轮扩增引物采用的是标签序列+通用序列，这时候扩增起作用的是通用序列，最后的 产物前面又都加上了可识别的标签序列。通过以上合理的引物设计和PCR策略，在PCR产物 的5'末端添加引物标签序列（index序列）。通过对每个样本都引入独特的引物标签序列， 使样本在第二代高通量测序技术检测时，每个样本的测序结果都可以通过其独特的引物标 签序列找回，可以应用于同时检测大量样本的多个不同基因位点，大大降低了测序成本。
【附图说明】
[0061] 图1是本发明的标记和捕获多个样本的特定基因的方法的示意图。
【具体实施方式】
[0062] 现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本 发明的限定。
[0063] 以下实施例中所使用的设备和试剂如下：血液基因组提取试剂盒（天根生化科技 有限公司），高速离心机SIGMA 3-30K，核酸扩增仪ABI 2720, PCR试剂TaKaRa Ex T￥q?: Hot Start Version，核酸外切酶 Takara (Exonuclease I (E.coli))。
[0064] 实施例1
[0065] 嗜铬细胞瘤相关的SDHB、SDHC、SDHD、RET、VHL 5个基因的27个外显子测序，共25 例临床样本：
[0066] 1)引物设计：
[0067] 针对5个基因的27个外显子设计相应的扩增引物，相关参数：Tm值55. 0°C - 60. 0°C，GC值40. 0% - 60. 0%，引物大小20±3bp。正向扩增引物和反向扩增引物的5'端 分别加上一段通用序列，所设计的引物如下，下划线是引入的通用序列：
[0068]
[0070] 按照以下规则设计标签序列：正向标签引物的数量X反向标签引物的数量>样 本数量，在本实施例中，根据25个样本设计5对标签序列，3'端加上通用序列组成第二轮扩 增所用的标签引物，通过5对标签引物的组合扩增，在第二轮扩增时对每个样本的各个目 的片段都加上可以区分的标签序列（index序列），所设计的引物如下，下划线是引入的通 用序列：
[0081] 2)第一轮扩增：
[0082] 每对引物单独调试合格后，将27对引物分别稀释到100 μ M，然后等量混合，PCR体 系：3 μ L 10x Extaq 缓冲液，3 μ L dNTP 混合物（各 2. 5 μ Μ)，2 μ L 混合引物，0· 3 μ L Extaq HS (5U/ μ L)，2 μ L 模板 DNA (20-50ng/ μ L)，ddH20 补充到 30 μ L。PCR 反应按下述条件进行： 模板DNA变性95°C保持5min。PCR反应循环条件：
[0083] 以下进行8个循环：
[0084] 第1步：95°C进行30秒；
[0085] 第2步：55°C进行30秒；
[0086] 第3步：72°C进行30秒；
[0087] 8个循环完成后，保持在4 C。
[0088] 3)消化引物
[0089] 将第一轮扩增产物在85 °C加热5分钟，然后快速冰浴冷却，采用Takara Exonuclease I对第一轮扩增产物进行消化残留引物，酶切体系：10XExonuclease I缓冲 液 2 μ L，Exonuclease I (50U/ μ L) 0· 5 μ L，PCR 产物模板 10 μ L，ddH20 补充到 20 μ L。酶切 反应按下述条件进行：37°C，30min ;80°C，15min。
[0090] 4)第二轮扩增
[0091] 通过5对标签引物上下游分别配对，在第二轮PCR扩增时对25个样本加上可识 别的标签序列，样本两端标签组合见表1，PCR体系：3yL 10x Extaq buffer，3yL dNTP Mixture(2.5yM each)，lyL 正向标签引物，lyL 反向标签引物，0.3yL Extaq HS(5U/ μ L)，2 μ L消化引物后的PCR产物，ddH20补充到 30 μ L。PCR反应按下述条件进行：模板 DNA变性95°C保持5min。PCR反应循环条件：
[0092] 以下进行20个循环：
[0093] 第1步：95°C进行30秒；
[0094] 第2步：55°C进行30秒；
[0095] 第3步：72°C进行30秒；
[0096] 20个循环完成后，保持在4 C。
[0097] 表1样本两端标签组合表
[0099]^5)混合：将带有标签序列的第二轮PCR扩增产物根据浓度均一地混合在一起；
[0100] 6)回收：回收400bp-500bp范围之间的所有DNA条带；
[0101] 7)测序：将回收的DNA混合物，采用Illumina Miseq，PE300(贝瑞和康生物技术 有限公司）进行测序，获得DNA混合物的序列。
[0102] 8)分析：Illumina Miseq产物的测序结果是一系列DNA序列，通过查找测序结果 中25个样本各自独特的标签序列，将获得的测序结果首先与样本一一对应，然后根据27个 外显子的引物序列，再将序列对应到样本的每个基因上。所有的25个样本的27个外显子 都能够在测序结果中找到对应的数据，每个样本对应的reads数（序列条数）如下表2所 示,27个外显子序列对应的序列条数如下表3所示（仅列出部分样本的数据），25个样本之 间序列条数差异最大在3倍左右，27个外显子序列对应的序列条数差异最大在10倍左右， 表明我们的多样本标记方法能够有效的区分每个标签对应的DNA序列。
[0103] 表2每个样本对应的序列条数和GC_数
[0104]
[0105] 表3 27个外显子序列对应的序列条数（以1号样本和2号样本为例）
【主权项】
1. 一种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以 下步骤： 第一轮扩增：使用由通用序列和针对特定基因的扩增引物组成的第一轮扩增引物组合 对各样本的一个或多个特定基因进行扩增，以使每个基因的扩增产物的两端上都加上了通 用序列，其中，所述通用序列中的正向通用序列与反向通用序列彼此不同； 消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体； 第二轮扩增：使用由标签序列和通用序列组成的第二轮扩增引物对第一轮扩增得到的 产物进行扩增，以使扩增产物的两端都加上与其他样本区分的可识别的标签序列； 混合：将各样本的第二轮扩增产物混合在一起； 回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带； 测序：将回收的DNA混合物进行测序； 分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根据每 个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。2. -种基于高通量测序的标记和捕获多个样本的一个或多个特定基因的方法，包括以 下步骤： 1) 引物设计： 第一轮扩增引物：根据待测的特定基因设计对应的扩增引物，根据所用测序仪和测序 方法适用的产物大小范围设计PCR产物长度，在正向扩增引物和反向扩增引物的5'端分别 加上一段特定的正向通用序列和反向通用序列，组成第一轮扩增引物组合，其中，所述正向 通用序列与反向通用序列彼此不同； 第二轮扩增引物：根据样本的数量设计不同的标签序列，在正向标签序列和反向标签 序列的3'端分别加上正向通用序列和反向通用序列构成正向标签引物和反向标签引物， 组成第二轮扩增引物组合，其中，设计的第二轮扩增引物的数量遵循以下规则：正向标签引 物的数量X反向标签引物的数量>样本数量，以及其中，在第二轮扩增引物中添加的正向 通用序列和反向通用序列分别与第一轮扩增引物中添加的正向通用序列和反向通用序列 相同，以及其中，正向标签引物的标签序列与反向标签引物的标签序列可以彼此相同或不 同； 2) 第一轮扩增：将针对各样本的扩增一个或多个特定基因的第一轮扩增引物组合混 合，在适于多重扩增目的核酸的条件下对所有样本分别进行扩增； 3) 消化引物：用单链消化酶消化第一轮扩增产物中剩余的引物和引物二聚体； 4) 第二轮扩增：用上一步中对应样本消化后的产物作为模板，根据不同样本设计的第 二轮扩增引物，进行第二轮扩增，从而分别给每个样本的各个扩增产物都加上了可以与其 他样本区分的标签序列，由此每个样本都得到带有可识别标签序列的多重PCR扩增产物； 5) 混合：将各样本的第二轮PCR扩增产物均一地混合在一起； 6) 回收：回收所设计的目标区域范围之间的所有DNA条带； 7) 测序：将回收的DNA混合物进行测序； 8) 分析：基于每个样本独特的标签序列，将获得的测序结果与样本一一对应，以及根 据每个基因的引物序列，将序列对应到样本的每个基因上。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述标签序列的长度为5-20bp，优选地，所 述标签序列的长度为6-8bp。4. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，第一轮扩增和第二轮扩增所采用的酶均为高 保真DNA聚合酶。5. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，在第一轮扩增中，PCR扩增进行8-10个循 环；和/或，第二轮扩增进行20-25个循环。6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，消化引物时，将第一轮PCR扩增产物在85°C 加热5分钟，然后快速冰浴冷却，使产物中的引物二聚体解链成单链引物，然后用单链消化 酶进行消化；和/或，消化引物所用的单链消化酶为核酸外切酶I。7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，测序利用pair-End技术（例如Illumina Hiseq2000、Illumin