利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种利用自体肿瘤与正常配对原代细 胞筛选肿瘤药物的方法。
【背景技术】
[0002] 近几年来，肿瘤的发生率呈逐年增长的趋势，目前常规的治疗方法主要有手术、放 化疗、生物治疗等，而其中化疗所面对的群体又占主要部分，化疗是利用化学药物阻止癌细 胞的增殖、侵润、转移直至最终杀灭癌细胞的一种治疗方法，它是一种全身性的治疗手段。 但是由于化疗药物的选择性不强，在杀灭癌细胞的同时，也会不可避免地损伤人体正常的 细胞，从而出现药物的不良反应;如何使病人接受化疗药物后，达到最佳的抗肿瘤作用，同 时又能最大限度地降低化疗药物对人体的损伤，成为目前肿瘤治疗过程中亟需解决的问 题。
[0003] 越来越多的证据表明，肿瘤的发生发展过程是肿瘤细胞与其生长的环境相互作用 的结果。即使在肿瘤发生的最早期，肿瘤细胞的失控型存活与生长也需要其环境相应的改 变才能维持，由于体内肿瘤组织多具有复杂的结构，包括增殖旺盛的细胞、静止细胞和坏死 组织等，具有明显的异质性，在同一肿瘤组织内部，不同部位细胞对化疗药物的敏感性不 同；在不同病人，同一肿瘤组织对于同种化疗药物的敏感性也不同。所以无论是使用肿瘤细 胞模拟人体内环境进行药物筛选，还是其他的一些药物筛选方法（如原代细胞药物筛选 等），都不能真正解决目前肿瘤治疗中药物的选择问题。
【发明内容】
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一。
[0005] 为此，本发明提出一种利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物的方法， 该方法简单可行，可以筛选出药效好的肿瘤药物。
[0006] 根据本发明实施例的利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物的方法，包 括以下步骤:S1、提供组织源相同的肿瘤细胞和正常配对的正常原代细胞，并分别对其进行 培养;S2、将所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞分别接种，并将所述肿瘤细胞和所述正常原 代细胞分别分为实验组和对照组;S3、提供多个针对该肿瘤的备选药物，并将多个所述备选 药物分别对所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞的实验组进行加药处理;S4、通过ATP生物荧 光药效检测方法检测并分析各备选药物对所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞的抑制率，初 筛得到候选药物;S5、将候选药物组作用的所述肿瘤细胞组和所述正常原代细胞进行流式 凋亡检测，筛选出所述候选药物中对所述肿瘤细胞的抑制率最高且同时对所述正常细胞的 抑制率最低的药物，作为临床推荐药物。
[0007] 根据本发明实施例的利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物的方法，可 以针对不同病人建立不同的药物筛选体系，判定不同肿瘤候选药物的药效，并提供相应浓 度的最佳肿瘤药物，保证在有效杀死肿瘤细胞的同时，最大限度地降低药物对于病人的副 作用。
[0008] 另外，根据本发明上述实施例的利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物 的方法，还可以具有如下附加的技术特征：
[0009] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S1包括:S11、提供组织源相同的肿瘤细胞和 正常配对的正常原代细胞，并将所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞分别吹散成单个细胞； S12、将所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞分别加入培养皿内培养;S13、定期对所述肿瘤细 胞和所述正常原代细胞进行观察并拍照，同时进行细胞传代，培养预定时间后，收集所述肿 瘤细胞和所述正常原代细胞。
[0010] 根据本发明的一个实施例，在所述步骤S12中，所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞 的培养温度为36.5°C_37.5°C，二氧化碳浓度为4%-6%。
[0011] 根据本发明的一个实施例，在所述步骤S13中，所述预定时间为5-7天。
[0012] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S1还包括:S14、将收集的所述肿瘤细胞和所 述正常原代细胞部分冻存。
[0013] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S2包括:S21、对所述肿瘤细胞进行精密度检 测和敏感度测试，筛选出满足药物筛选要求的所述肿瘤细胞，并确定所述肿瘤细胞的正式 接种数;S22、将所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞分别按照正式接种数接种在96孔板上， 并将所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞分别分为实验组和对照组。
[0014] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S21包括:S211、将所述肿瘤细胞分为低数目 组、中数目组和高数目组并分别接种，其中，所述低数目组的肿瘤细胞数为400-600，所述中 数目组的肿瘤细胞数为9000-11000，所述高数目组的肿瘤细胞数大于40000; S212、培养预 定时间后，分别测定所述低数目组、中数目组和高数目组的RLU值，选择RLU平均值>400000 的最低肿瘤细胞数作为正式接种数。
[0015] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S3包括:S31、提供多个备选药物，并将每个所 述备选药物分别调配成多个浓度;S32、将多个浓度的多个所述备选药物分别对所述肿瘤细 胞和所述正常原代细胞的实验组进行加药处理。
[0016] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S4包括：S41、提取每个实验组的ATP，利用生 物荧光原理测定ATP含量，结果传输计算机;S42、通过软件分析不同浓度的不同备选药物对 所述肿瘤细胞和所述正常原代细胞的抑制率，绘制曲线；S43、挑选出对所述肿瘤细胞的抑 制率超过60%，同时对所述正常原代细胞的抑制率低于50%的备选药物，初筛得到候选药 物及候选药物的浓度。
[0017] 根据本发明的一个实施例，所述步骤S5包括:S51、收集候选药物组作用的所述肿 瘤细胞组和所述正常原代细胞，每个样本的细胞数为IX l〇6;S52、将每个所述样本分别用 孵育缓冲液洗涤1次，500-1000r/min离心5min;S53、用100ul的标记溶液重悬细胞，室温下 避光孵育10-1511^11 ;354、500-100(^/1^11离心51^11沉淀细胞，并用孵育缓冲液洗1次;355、将 细胞加入荧光溶液，在4°C下孵育20min，避光并保持振动；S56、流式细胞仪激发光波长用 488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC焚光，另一波长大于560nm的滤器检测PI; S57、筛选出所述候选药物中对所述肿瘤细胞的抑制率最高且同时对所述正常细胞的抑制 率最低的药物，作为推荐药物。
[0018] 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变 得明显，或通过本发明的实践了解到。
【附图说明】
[0019] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得 明显和容易理解，其中：
[0020] 图1是根据本发明实施例的利用自体肿瘤与正常配对原代细胞筛选肿瘤药物的方 法的流程图；
[0021] 图2是备选药物对胃癌细胞的抑制率曲线图；
[0022] 图3是备选药物对正常原代细胞的抑制率曲线图；
[0023] 图4是双变量流式细胞仪的散点图。
【具体实施方式】
[0024] 下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终 相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同