专利名称：一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法
技术领域：
本发明涉及细胞生物学去分化及诱导分化的技术领域，具体涉及利用成体兔的成熟脂肪细胞去分化为多能干细胞继而再分化为心肌样细胞的方法。
背景技术：
脂肪组织来源丰富，取材的方法安全便捷，可以作为一种实用的以及有前景的间充质细胞的来源。脂肪组织内含有非脂肪细胞被称为间质血管化组分(stromal-vascular fraction (SVF))。脂肪组织通过机械分离或酶消化(后再经过荧光激活细胞分选术或细胞分选)的方法分离得到SVF.培养的SVF被命名为脂肪来源的间充质干细胞(ASCS/ADSC)。 体内外的研究表明人的ADSC细胞能够分化成多种细胞系，如脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、神经元细胞、内皮细胞和肝细胞(Schaffler and Buchler，2007，Concise review :Adipose tissue-derived stromal cells-basic and clinical implications for novel cell-based therapies. Stem Cells 25:818-827·)。但是 ADSC 细胞只占脂肪组织中极少量的部分并且培养的原代及最初几代的ADSC细胞为异质性的细胞群，可能混杂有内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞(pericytes)等。因此，仍然需要寻找一种来源明确并具有高纯度的细胞系。成熟的脂肪细胞是脂肪组织中最为丰富的细胞类型。这些成熟的脂肪细胞在体外通过特殊的培养条件可获得一群更原始，并有增殖性的细胞系，称为去分化的脂肪细胞 (DFAT)。DFAT细胞可从白色脂肪组织(成熟的脂肪组织)中获取。目前的研究表明，DFAT 细胞是一群同质性的细胞类型；DFAT细胞具有丢失脂肪特异性的标识分子，并获得多能性的特性，通过一定的诱导培养方法可以分化为多种间质细胞系，具有成骨、成脂、成软骨、成肌的能力。到目前为止，DFAT细胞已从人、大鼠、小鼠中获取。但是培养的具体方法各异。 有研究表明白脂肪细胞与心血管细胞有密切的关系，以及脂肪细胞与内皮细胞有共同的前体细胞。并且，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培养出自发搏动的心肌样细胞(Medet Jumabay,2009, Spontaneously beating cardiomyocytes derived from white mature adipocytes. Cardiovascular Research 85，17-27)0目前尚无文献报道有关兔的DFAT细胞系的建立以及向心肌样细胞的分化诱导。
发明内容
本发明的目的是从成体兔的成熟脂肪细胞培养兔的去分化的脂肪细胞(DFAT)，并诱导分化为心肌样细胞。本发明技术方案的关键在于如何简单的方法获取兔的DFAT细胞并诱导成为心肌样细胞。本发明选用的兔是常用的实验动物，在心脏甚至是心的传导束系统中是目前所研究的动物中最多的一种，也是最为典型的动物之一。并且，相对于小鼠来讲，兔是一种较大的哺乳动物，与人的关系更为接近，用兔作为实验对象，用其脂肪组织培养诱导出心肌样细胞，将会是对人的心脏干细胞或者心脏组织工程治疗方面提供有力的支持。
本发明提供了一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法，如图 1所示，具体步骤如下
1、分离出成体兔的白色脂肪组织；
可取成体兔腹股沟处白色脂肪组织(或其他皮下脂肪组织)。将其用0. IM的PBS 冲洗，剪成糜状；
2、获得上层白色脂肪部分；
采用酶消化法(参照Ken Yagi DK, Yasushi Okazaki, Koichiro Kano A novel preadipocyte cell line established from mouse adult mature adipocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications 2004 ；321 :967-974.)。用胶原酶I，37°C消化40-50min,消化充分；
消化过程也可放在37°C的摇床内。
3、采用天花板法培养后再常规培养；
由于的脂肪细胞富含高的脂质成分，培养时，会漂浮在培养基的顶层，这样会使的成熟的脂肪细胞不能有效的接受营养物质和接受同样的处理环境。1986年Sugihara H提出“天花板培养”的方法，就是利用了成熟脂肪细胞漂浮的性质使细胞附着在充满培养基的培养板的上层(Sugihara H，Yonemitsu N，Miyabara S，Yun K. Primary cultures of unilocular fat cells !characteristics of growth in vitro and changes in differentiation properties.Differentiation 1986 ；31 :42-49.)。Ken Yagi 在试 着使用天花板培养时发现大量的成熟脂肪细胞能够去分化为成纤维样细胞，并命名为 DFAT-Dl (ddY小鼠的脂肪细胞去分化而来)。
用20%完全培养基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA 公司)，1%双抗(抗青霉素-链霉素)]中和胶原酶I并过滤；
也可选用5%的完全培养基[FBS (Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA公司)， 双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]。
收集过滤液 1000-1500rpm 离心 3_5min。
4、并用20%的完全培养基同时诱导。
取上层白色细胞层采用20%的完全培养基倒置培养至少七天后常规培养。七天后，脂肪细胞内的脂滴基本消失。但是有时七天后观察一些细胞仍会存在脂滴，这种情况下，可以延长倒置培养的时间。
本发明还提供了根据上述方法从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化得到的心肌样细胞。
近年来国内外研究从小鼠、大鼠、人上都已建立了 DFAT细胞，但兔的DFAT细胞建立并没有相关的报道。本发明成功培养出的兔的DFAT细胞，相比较于之前在小鼠、大鼠、人的DFAT细胞的培养步骤和方法上更为得简化与实用。首先本发明不需要特殊的培养基质， 本发明只是采用的实验室常用的高糖培养基(DMEM，PAA公司)，普通的胎牛血清，以及常用的抗青-链霉素。其次本发明不需要繁琐的实验步骤，这在具体实施方式
中已有体现。另外，本发明是首次将兔的DFAT细胞诱导为心肌样细胞。尽管2009年，Medet Jumabay等用小鼠的DFAT培养出自发搏动的心肌样细胞。本发明人所在的研究小组一直重复前者的培养方法但并未得到成功。本发明的方法通过相应的改进得到了成功首先，前者有既定的步骤，各步骤的时间设置都是固定的，而本发明各步骤的时间是可以由浮动的。其次，前者的消化的过程中需要特定的摇床，本发明只是普通的消化，更具普遍性。再次，前者需用了两性霉素等相关的培养基质，本发明没有选用。采用本发明的培养诱导方法培养出的心肌样细胞其相关的分子标识确是完全的表达。本发明的培养诱导方法简便并且不需要特殊的材料及设备，可在实验室中得到广泛的应用。本发明用兔作为实验对象，免与人的关系更为接近，用其脂肪组织培养诱导出心肌样细胞，将会是对人的心脏干细胞或者心脏组织工程治疗方面提供有力的支持。
图1是脂肪组织内分离DFAT细胞诱导为心肌样细胞流程模式2是兔的DFAT细胞培养相差显微镜其中A、DFAT细胞培养第三天(X200) ；B、DFAT细胞培养第七天(X100) ；C、DFAT 细胞培养第十天(X100) ；D、DFAT细胞培养传一代(X100)。
具体实施例方式下面结合本发明的实施例和附图对本发明的实施作详细说明，以下实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。实施例1 一、兔去分化脂肪细胞的培养成年荷兰大白兔(第二军医大学实验动物中心，3kg左右)1、相对无菌的状态下，取出成体兔腹股沟处白色脂肪组织；2、用0. IM的磷酸缓冲液(PBQ洗三遍后，将组织剪成糜状；3、用等体积(与糜状的组织块等体积)的胶原酶I (Worthington公司)37°C消化 40min，期间适当的摇晃，以便消化均勻。消化过程也可放在37°C的摇床内。4、用20%完全培养基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA 公司)，1%双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]中和胶原酶的活性并且辅助过滤。为了节约可选用5%的完全培养基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA公司)，1 %双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]。收集滤液，IOOOrpm离心3分钟.5、取上层白色脂肪层培养在12cm2的培养瓶中，用20%的完全培养基充满培养瓶， 倒置培养在37°C，5% CO2的培养箱中。6、七天后，倒掉培养基，加入2-3ML的20%的完全培养基常规培养。(流程如图1 所示)七天后，脂肪细胞内的脂滴基本消失。但是有时七天后观察一些细胞仍会存在脂滴，这种情况下，可以延长倒置培养的时间。
开始培养时脂肪细胞呈圆形漂浮在最上层。在培养第3/4天，有些细胞贴附在培养瓶的上壁上生长。七天后绝大多数的细胞脂滴丢失，成长梭形细胞形态(如图2所示)。二、DFAT细胞的鉴定取传1代的DFAT细胞常规免疫细胞化学染色检测Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表达(以上检测的分子均为心肌细胞的标识分子)。结果表明 Sarcomeric Action、肌钙蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成阳性的，HCN4弱阳性。表明20% 的完全培养基将DFAT细胞诱导为心肌样细胞。实施例2 —、兔去分化脂肪细胞的培养成年荷兰大白兔(第二军医大学实验动物中心，3kg左右)1、相对无菌的状态下，取出成体兔腹股沟处白色脂肪组织；2、用0. IM的磷酸缓冲液(PBQ洗三遍后，将组织剪成糜状；3、用等体积(与糜状的组织块等体积)的胶原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期间适当的摇晃，以便消化均勻。消化过程也可放在37°C的摇床内；4、用20%完全培养基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA 公司)，1%双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]中和胶原酶的活性并且辅助过滤。为了节约，可选用5%的完全培养基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM， PAA公司)，1 %双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]，收集滤液，IOOOrpm离心5分钟；5、取上层白色脂肪层培养在12cm2的培养瓶中，用20%的完全培养基充满培养瓶， 倒置培养在37°C，5% CO2的培养箱中；6、七天后，倒掉培养基，加入2-3ML的20%的完全培养基常规培养。(流程如图1 所示)七天后，脂肪细胞内的脂滴基本消失。但是有时七天后观察一些细胞仍会存在脂滴，这种情况下，可以延长倒置培养的时间。开始培养时脂肪细胞呈圆形漂浮在最上层。在培养第3/4天，有些细胞贴附在培养瓶的上壁上生长。七天后细胞内脂滴丢失，成长梭形生长。(如图2所示)二、DFAT细胞的鉴定取21天的DFAT细胞常规免疫细胞化学染色检测Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表达(以上检测的分子均为心肌细胞的标识分子)。结果表明 Sarcomeric Action、肌钙蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成阳性的，HCN4弱阳性，这与实施例 1结果是一致的。实施例3 —、兔去分化脂肪细胞的培养成年荷兰大白兔(第二军医大学实验动物中心，3kg左右)1、相对无菌的状态下，取出成体兔腹股沟处白色脂肪组织；
2、用0. IM的磷酸缓冲液(PBQ洗三遍后，将组织剪成糜状；
3、用等体积(与糜状的组织块等体积)的胶原酶I (Worthington公司)37°C消化50min，期间适当的摇晃，以便消化均勻。消化过程也可放在37°C的摇床内；
4、用20%完全培养基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA 公司)，1%双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]中和胶原酶的活性并且辅助过滤。
为了节约，可选用5%的完全培养基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA公司)，1 %双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]，收集滤液，1500rpm离心3分钟；
5、取上层白色脂肪层培养在12cm2的培养瓶中，用20%的完全培养基充满培养瓶， 倒置培养在37°C，5% CO2的培养箱中；
6、七天后，倒掉培养基，加入2-3ML的20%的完全培养基常规培养。(流程如图1 所示)
七天后，脂肪细胞内的脂滴基本消失。但是有时七天后观察一些细胞仍会存在脂滴，这种情况下，可以延长倒置培养的时间。
开始培养时脂肪细胞呈圆形漂浮在最上层。在培养第3/4天，有些细胞贴附在培养瓶的上壁上生长。七天后细胞内脂滴丢失，成长梭形生长。(如图2所示)
二、DFAT细胞的鉴定
取21天的DFAT细胞常规免疫细胞化学染色检测Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表达(以上检测的分子均为心肌细胞的标识分子)。结果表明 Sarcomeric Action、肌钙蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成阳性的，HCN4弱阳性，这与实施例 1结果是一致的。
实施例4
一、兔去分化脂肪细胞的培养
成年荷兰大白兔(第二军医大学实验动物中心，3kg左右)
1、相对无菌的状态下，取出成体兔腹股沟处白色脂肪组织；
2、用0. IM的磷酸缓冲液(PBQ洗三遍后，将组织剪成糜状；
3、用等体积(与糜状的组织块等体积)的胶原酶I (Worthington公司)37°C消化 45min，期间适当的摇晃，以便消化均勻。消化过程也可放在37°C的摇床内；
4、用20%完全培养基[20%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA 公司)，1%双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]中和胶原酶的活性并且辅助过滤。
为了节约，可选用5%的完全培养基[5%胎牛血清(FBS，Gibico公司)，高糖培养基(DMEM，PAA公司)，1 %双抗(抗青霉素-链霉素)(上海生工)]，收集滤液，IOOOrpm离心3分钟；
5、离心后取上层部分洗1-2遍(纯化作用)。每次离心1500rpm，1分钟；
6、取上层白色脂肪层培养在12cm2的培养瓶中，用20%的完全培养基充满培养瓶， 倒置培养在37°C，5% CO2的培养箱中；
7、七天后，倒掉培养基，加入2-3ML的20%的完全培养基常规培养。(流程如图1所示)七天后，脂肪细胞内的脂滴基本消失。但是有时七天后观察一些细胞仍会存在脂滴，这种情况下，可以延长倒置培养的时间。开始培养时脂肪细胞呈圆形漂浮在最上层。在培养第3/4天，有些细胞贴附在培养瓶的上壁上生长。七天后细胞内脂滴丢失，成长梭形生长。(如图2所示)二、DFAT细胞的鉴定取21天的DFAT细胞常规免疫细胞化学染色检测Sarcomeric Action (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CX45 (Santa Cruz Biotechnology, Inc) > CD40 ( KiXffiii 公司)、CX43 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)、Troponin I (Abeam)禾口 HCN4 (Santa Cruz Biotechnology, Inc)等的表达(以上检测的分子均为心肌细胞的标识分子)。结果表明 Sarcomeric Action、肌钙蛋白、0ct_4、CX45和CX43是成阳性的，HCN4弱阳性，这与实施例 1结果是一致的。
权利要求
1.一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法，具体步骤如下A、分离出成体兔的白色脂肪组织；B、酶消化法获得上层白色脂肪层部分；C、采用天花板法培养后再常规培养；用20%完全培养基或者5%的完全培养基，中和胶原酶I并过滤，收集过滤液 1000-1500rpm 离心 3_5min ；D、取上层白色细胞层采用20%的完全培养基倒置培养至少七天后常规培养； 所述的完全培养基配方为FBS、高糖培养基和抗青霉素-链霉素。
2.根据权利要求1所述的一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法，其特征在于分离出成体兔的白色脂肪组织后用0. IM的PBS冲洗，剪成糜状。
3.根据权利要求1或2所述的一种从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化为心肌样细胞的方法，其特征在于步骤B中，用胶原酶I，37°C的环境下消化40-50min。
4.一种如权利要求1、2或3的方法制备得到的从成体兔的成熟脂肪细胞诱导分化得到的心肌样细胞。
全文摘要
本发明涉及细胞生物学去分化及诱导分化的技术领域。去分化的脂肪细胞(DFAT)可从白色脂肪组织中获取，DFAT细胞通过一定的诱导培养方法可以分化为多种间质细胞系，具有成骨、成脂、成软骨、成肌的能力。本发明的目的是从成体兔的成熟脂肪细胞培养兔的DFAT，并诱导分化为心肌样细胞。本发明选用成体兔的白色脂肪组织，通过胶原酶I等体积消化，并采用20％完全培养基，天花板培养的方法使成熟的脂肪细胞去分化为DFAT细胞，并有心肌细胞的形态及标识分子的表达。本发明为组织工程提供了种子细胞，为基础研究带来便捷，为临床应用带来前景。
文档编号C12N5/077GK102492653SQ201110404788
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月8日 优先权日2011年12月8日
发明者张传森, 张喜, 李晓童 申请人:中国人民解放军第二军医大学