基于杂交瘤技术和高通量测序的抗体发现方法
【专利摘要】本发明公开了一种产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，以及由其产生的重组抗体。本发明的产生抗体的方法将优化的高通量抗体测序方法和杂交瘤抗体筛选技术相结合，与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相比，扩大了候选抗体基因的选择范围，提高了抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体的可能性。
【专利说明】
基于杂交瘤技术和高通量测序的抗体发现方法
技术领域
[0001 ]本发明涉及生物医药技术领域，具体地，涉及一种基于杂交瘤技术和高通量测序 产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，以及由该方法所获得的重组抗体。
【背景技术】
[0002] 杂交瘤技术是最常用的抗体挖掘技术，但是其步骤繁琐，并且得到单克隆细胞所 需要的亚克隆过程耗时长、成本高。
[0003] 近年来，高通量测序技术越来越多地应用于免疫抗体可变区基因谱的表征分析， 以及抗原特异性抗体的发现。该方法通过对免疫前、后免疫球蛋白基因的高通量测序，获得 免疫动物的抗体可变区基因谱。在免疫后显著富集的抗体基因被认为可能与特异性抗原相 关，选取抗体可变区基因谱中的高丰度的重链和轻链基因在体外配对重组表达抗体。相比 较抗体基因随机配对表达，采用高丰度基因配对可以提高产生功能抗体的效率，减少配对 的盲目性。此外，还可产生大量的候选序列用于抗体配对表达和功能验证，扩展功能抗体筛 选池的规模。相对于传统的杂交瘤以及噬菌体展示技术，该技术规避这两种技术的局限性， 包括仅适用于鼠和兔等有限的物种，原核表达系统中的密码子选择，后续需要进行人源化 等技术难点。同时，抗体组测序方法可以加速获取杂交瘤抗体基因的进程。无需得到最终的 单克隆，在寡克隆阶段即可收集并测序;非单克隆序列由二代测序结果进行校正。相比于传 统的一代测序检测单/寡克隆抗体信息，可以通过PCR添加细胞index序列后，混合用二代测 序进行杂交瘤抗体基因测序，提高通量，降低成本。
[0004] 然而，此技术的缺陷在于：1)无法获取天然抗体配对信息；2)单纯依靠基因丰度配 对导致基因配对方法单一，配对成功率低，后续基因合成和配对筛选工作量大。
[0005] 近年来，通过蛋白质组技术分析抗体可变区多肽的丰度，结合高通量测序获取抗 体基因的序列的方法，已经应用于抗体生产。采用特异性标记分离抗体生产细胞，通过高通 量单细胞抗体测序技术可以获得天然重链和轻链配对信息。但是单细胞抗体测序和蛋白质 组分析对于生物信息分析方法与实验条件都有很高的要求，这无疑增加了抗体发掘的难 度。此外，抗体可变区基因谱的获取也存在一些技术难度。抗体序列特异性引物的覆盖度和 引物扩增效率不一，导致抗体可变区基因谱缺失抗体基因信息或者信息存在偏向性，获得 的高丰度序列不具备抗原特异性;RACE方法建库可以克服偏向性，但是扩增片段较长难以 测通，有可能缺失部分抗体序列信息。
【发明内容】
[0006] 针对现有杂交瘤技术耗时长，抗体细胞系筛选范围小，难以获取高亲和力单克隆 抗体的缺陷，以及抗体测序技术存在的建库偏向性以及配对盲目性等缺陷，本发明将优化 的高通量抗体测序方法和杂交瘤抗体筛选技术相结合，与传统的杂交瘤单克隆抗体技术相 比，扩大了候选抗体基因的选择范围，提高了抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体 的可能性。
[0007] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0008] 第一方面，本发明提供了产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，其包括：
[0009] (1)用所述至少一种靶抗原免疫宿主受试者；
[0010] (2)使用经免疫的宿主受试者的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞系，并获取特异性结合 所述至少一种祀抗原的杂交瘤抗体基因信息；
[0011] (3)使用免疫后的宿主受试者的淋巴细胞，进行免疫球蛋白基因可变区的高通量 测序，获取针对所述至少一种靶抗原的抗体可变区基因谱；
[0012] (4)选取杂交瘤抗体重链基因作为第一候选配对基因，并与从抗体可变区基因谱 中选择的轻链基因作为第二候选配对基因进行配对，以产生候选重组抗体。
[0013] 在具体实施方案中，步骤(2)中，所制备的杂交瘤细胞系能够产生与所述靶抗原具 有高亲和力的单克隆抗体，优选为与靶抗原的结合常数不高于10- 9Μ的单克隆抗体。
[0014] 在优选的实施方案中，所述杂交瘤抗体基因信息包含抗体的重链和轻链可变区基 因 ?目息。
[0015] 在优选的实施方案中，通过以下获取杂交瘤抗体基因信息：
[0016] 以杂交瘤细胞总mRNA为模板，Oligo dT为引物，经反转录合成CDNA第一链，再以 cDNA第一链为模板，以混合的特异性引物扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，测序分 析得到杂交瘤基因序列，将杂交瘤基因序列进行IgBlast分析，排除来源于构成杂交瘤的融 合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因。
[0017] 在优选的实施方案中，步骤(3)中，所述抗体可变区基因谱包含抗体的重链和轻链 可变区基因信息；
[0018] 优选地，所述基因信息是通过高通量DNA测序确定的；
[00?9]进一步优选地，所述高通量DNA测序包括在测序反应的同时进行合成、连接或者杂 交；以及单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合；
[0020] 进一步优选地，所述高通量测序通过以下实施：
[0021] 以细胞总mRNA为模板，使用SMARTer RACE技术合成第一链cDNA;设计上游引物，并 根据抗体恒定区序列保守区设计下游引物，以扩增抗体序列可变区。
[0022] 在优选的实施方案中，步骤(4)中，从抗体可变区基因谱中选取包含高丰度CDR3或 者包含与所述高丰度CDR3高度相似的CDR3的轻链基因作为第二候选配对基因。发明人发 现，具有高相似度CDR3的轻链基因可以与同一条重链基因配对产生功能抗体。
[0023] 在优选的实施方案中，在从抗体可变区基因谱中选定第二候选配对基因的CDR3 的情况下，通过以下方法获得第二候选配对基因的抗体可变区：
[0024] 从包含所选定CDR3的抗体基因片段的测序结果中，依次选取最高丰度的CDR2和 CDR1片段信息，然后挑选最高丰度的包含选定CDR2和CDR1片段信息的可变区全长序列，作 为第二候选配对基因的抗体可变区序列。
[0025] 在优选的实施方案中，所述方法还包括用所述至少一种靶抗原对所得抗体进行鉴 定的步骤，由此产生结合所述至少一种靶抗原的重组抗体。
[0026] 在具体实施方案中，所述鉴定步骤包括体外表达所得抗体的scFv或Fab片段或 IgG，将所得scFv、Fab片段或IgG与祀抗原进行结合力测试；
[0027] 优选地，所述体外表达方法包含但是不限于:通过原核细胞、噬菌体展示方法或酵 母系统表达scFv或者Fab片段，或者通过哺乳细胞外源基因表达Fab或者IgG;
[0028] 优选地，所述测试方法包括但不限于ELISA和/或SPR。
[0029]在本发明的上下文中，术语"高亲和力"是指抗体亲和力常数不高于10-9Μ。
[0030] 在本发明的上下文中，术语"高丰度"是指在抗体可变区基因谱中的丰度高于1%。
[0031] 在本发明的上下文中，术语"高度相似"是指在氨基酸水平上与待比较的对象具有 高于80 %的序列同一性。
[0032] 第二方面，本发明提供了一种根据上述第一方面所述的方法制得的重组抗体。
[0033] 在本发明的一个具体实施方案中，发明人获得了特异性靶向ΗΑ的功能性重组抗 体，所述重组抗体的重链可变区包括如SEQ ID Ν0:40，42和50所示的⑶R3，并且所述重组抗 体的轻链可变区包括如SEQ ID N0:20,53,68和103所示的CDR3。
[0034] 在本发明的另一个具体实施方案中，发明人获得了特异性靶向PD-L1的功能性重 组抗体，所述重组抗体的重链可变区包括如SEQ ID N0:84所示的⑶R3，并且所述重组抗体 的轻链可变区包括如SEQ ID N0:23,89和105所示的CDR3。
[0035] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0036] 本发明结合杂交瘤技术与抗体测序技术，通过特定的选择方式，将从杂交瘤中获 取的抗体重链基因和抗体可变区基因谱中获取的轻链基因配对表达，获取功能性抗体。所 采用的优化的抗体文库制备流程，可以完整地获取免疫受试者的抗体可变区基因谱，实验 结果具有很高的重复性;所采用的优化的生物信息学分析方法可以快速地获取CDR3的丰度 信息和准确的抗体基因可变区全长信息。相比较杂交瘤技术和单纯依靠抗体基因丰度选择 配对候选序列的方法，本发明的抗体发现方法可以提高候选配对基因的选择范围，克服配 对盲目性的问题，提高成功配对获得功能性抗体的效率。
【附图说明】
[0037]图1显示本发明的产生重组抗体的方法的流程图。
[0038]图2显示实施例2中扩增的重链可变区和轻链可变区的琼脂糖凝胶电泳图；其中， VH表示重链可变区，VL表示轻链可变区，Μ表示D2000marker(Takara)。
[0039]图3显示实施例2所制备重链和轻链可变区测序文库的Bioanalyzer鉴定结果。 [0040]图4显示样品GW02-5的骨髓和脾脏组织之间⑶RH3丰度的相关性。
[00411图5显示样品GW02-5的骨髓和脾脏组织之间⑶RL3丰度的相关性。
[0042]图6显示样品GW02-3的各个脾脏组织重复之间⑶RH3丰度的相关性。
[0043]图7显示样品GW02-3的各个脾脏组织重复之间⑶RL3丰度的相关性。
[0044]图8显示样品GW02-5的各个脾脏组织重复之间⑶RH3丰度的相关性。
[0045]图9显示样品GW02-5的各个脾脏组织重复之间⑶RL3丰度的相关性。
[0046]图10显示GW01抗原多肽与配对抗体之间的亲和力分析；图内数值表示0D490nm波 长吸收值;图内锥形基部实线表示杂交瘤抗体天然配对。
[0047]图11显示GW02抗原多肽与配对抗体之间的亲和力分析；图内数值表示0D490nm波 长吸收值;图内锥形基部实线表示杂交瘤抗体天然配对。
[0048] 图12为显示GW01抗原和GW02抗原的抗体配对效率的结果示意图。
【具体实施方式】
[0049] 为便于理解本发明，以下通过列举具体实施方案及具体实施例的方式进一步说明 本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所列举的具体实施方案和实施例仅仅是帮 助理解本发明，不应被视为对本发明的具体限制。
[0050] 例如，在一个具体的实施方案中，本发明采用如下程序：
[0051] 1)采用标准免疫程序在第0天和第21天两次免疫小鼠，取免疫前小鼠血清作为阴 性对照;初次免疫后第35天取血检测血清滴度，对血清滴度达到融合要求的小鼠加强免疫， 初次免疫后第38天进行细胞融合制备杂交瘤。融合后10-14天左右，取杂交瘤上清进行克 隆检测，分离亚克隆，筛选亲和力最高的亚克隆。
[0052] 2)以杂交瘤细胞的mRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成cDNA第一链，再以 cDNA第一链为模板，使用重链和轻链简并引物PCR扩增VH和VL基因 （Ti 1 ler等人，2009)，所 用引物序列见以下表1。采用标准PCR程序扩增杂交瘤抗体序列可变区，PCR产物克隆测序， 将抗体基因进行IgBlast分析，剔除假基因以及提前中止的基因。
[0053]表 1
[0054]
[0055] 3)采用Trizol裂解脾脏和骨髓细胞并提取RNA，使用SMARTer RACE(Clontech)技 术合成第一链cDNA;设计上游引物并根据抗体恒定区序列保守区设计下游引物，扩增抗体 序列可变区。以cDNA链5'末端共有一段序列设计正向通用引物，并在正向通用引物5'末端 连接Illunina MiSeq正向测序接头。根据小鼠恒定区保守序列反向引物，并在引物3端附加 Illumina MiSeq反向测序接头。引物序列信息见表2。
[0056] 表2
[0057]
[0058]
[0059] 扩增重链和轻链序列可变区，采用Illumina Miseq 2X250测序，整理数据后进行 IgBlas分析，获取互补决定区3(complementary determining region 3，CDR3)的氨基酸序 列，根据序列的丰度排名，挑选包含高丰度CDR3或者包含与所述高丰度CDR3高度相似的 CDR3的抗体轻链基因作为轻链候选配对基因（即，本文中所述"第二候选配对基因"）；选取 杂交瘤重链基因作为重链候选配对基因（即，本文中所述"第一候选配对基因"）；将所选择 的重链候选配对基因与轻链候选配对基因在哺乳动物细胞中配对表达，测试配对抗体与特 异抗原的亲合力。
[0060] 实施例1杂交瘤抗体序列的分离和鉴定 [0061 ]采用如下程序：
[0062] (1)扩大培养骨髓瘤细胞，使其在融合时处于对数生长期。融合当天，收集细胞，计 数，备用。
[0063] (2)取血清滴度达到标准的血凝集素 HA抗原多肽(下文以代号GW01表示)和免疫检 查点ro-Ll抗原多肽(下文以代号GW-02表示)各2只免疫小鼠制备杂交瘤，分别命名为6101_ 1，GW01 -3和GW0 2-3，GW0 2-5。摘除小鼠眼球采血，并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血 清。拉颈处死小鼠，无菌取小鼠脾脏，分离脾细胞并裂解红细胞，得到纯净的B淋巴细胞。细 胞融合将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞以适当的比例混合，在融合剂作用下使两种细胞融合。融 合后的细胞用HAT培养基重悬后，分装含有巨噬细胞的96孔细胞培养板。置37°(：，5^^0 2培 养箱内培养。融合后的细胞用HAT培养基培养2周后用换HT培养基继续培养2周，然后换 R1640完全培养基。
[0064] (3)融合后10-14天左右，取杂交瘤上清进行第一次克隆检测，孔中换新鲜培养基。 继续培养3天，取杂交瘤上清进行第二次克隆检测，孔中换新鲜培养基。将阳性克隆扩大培 养至48孔板。同时将阳性克隆进行克隆化，即将阳性克隆进行稀释，按每孔1个细胞接种一 块96孔板，200ul/孔。继续培养3天，取杂交瘤上清进行第三次克隆检测，同时扩大培养阳性 克隆。冻存阳性克隆细胞株，同时收集上清进行亚型鉴定。
[0065] (4)将鉴定过的具有高亲和力的23个GW01和18个GW02单克隆杂交瘤细胞系复苏 后，经扩大培养至1 X 107个细胞，用1'1^2〇1(1]1￥；[1：1'(^611公司）提取总1?嫩，按厂家说明书进 行。使用反转录试剂盒SuperScriptIII(Life Technologies)将2yg总RNA反转录成cDNA第1 链，按厂家说明书进行。使用通用型引物克隆抗体重、轻链可变区基因，通用型引物见上文 表1;以轻链可变区基因克隆为例，等量混合轻链引物，取2μ1混合引物，2μ1 cDNA为模板， pfu酶(GENEWIZ)制备反应体系，反应程序是预变性98°CC 30s后，进行98°CC 8秒，58°CC 15 秒，72°CC 30秒共30个循环的扩增程序，然后72°CC保温2分钟。采用BciVI去除无功能的轻 链基因，酶切体系如下:BciVI，ΙμL，PCR产物lyg，10倍缓冲液5μ1然后补水至50μ1，37°CC酶 切过夜，电泳回收并纯化400bp左右的片段，并将其克隆至T载体，测序鉴定轻链序列。采用 相似步骤，采用重链引物PCR扩增重链可变区基因。琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，回收纯化 400bp-500bpPCR产物，并将其克隆至测序载体以进行测序，将测得的序列输入MGT数据库 进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到重链和 轻链基因的可变区。
[0066] 实施例2抗体测序文库的制备及抗体序列的分析
[0067] 分别采用实施例1制备杂交瘤余下的脾脏组织以及来自同一只免疫小鼠的骨髓细 胞，进行抗体测序文库的制备。
[0068] 具体地，将所述脾脏组织在液氮中研磨，提取总RNA，具体提取程序按提取试剂的 厂家说明书进行;从同一只经免疫的小鼠中采集胫骨和股骨除去肌肉和脂肪组织，用注射 器将Trizol注入骨内清洗出骨髓并收集在离心管当中，提取总RNA，具体提取程序按提取试 剂的厂家说明书进行。
[0069] 采用抗体可变区上游引物和重链和轻链可变区下游引物，以样品5 ' RACE产物为模 板，分别扩增重链和轻链可变区，制备重链和轻链可变区的测序文库。
[0070] PCR扩增体系和扩增程序分别见以下表3和表4。
[0071] 表3
[0072]
[0076] 在扩增产物末端通过PCR的方法添加 Barcode，用于区分不同样品的测序结果。PCR 扩增体系和扩增程序分别见以下表5和表6。
[0077] 表 5
[0078]
[0079] 表 6
[0080]
[0081 ] 扩增产物的纯化：在PCR产物中加入0.8倍体积的AMPure Beads，混匀室温静置 5min;瞬时离心后置于磁力架上5分钟；弃上清液，加70 %无水乙醇洗两遍后小心弃去残余 乙醇，室温放置10分钟待乙醇挥发完全。加入30μ1 10mM Tris(pH8.0)混匀beads，室温静 置5分钟，洗脱DNA并转移至新管中。
[0082]由上述PCR扩增所得重链可变区和轻链可变区的琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示。 [0083] 此外，使用Agilent 2100Bioanalyzer分析系统检测文库插入片段大小及含量，所 得重链和轻链可变区文库的Bioanalyzer鉴定结果如图3所示。
[0084] 使用Illumina MiSeq 2X250(GENEWIZ)进行高通量测序。对重链和轻链可变区文 库的每一个设定适量的测序数，数据产生后，去除掉不完全序列，将完整的包含CDR3的R2序 列进行IgBlast比对，产生⑶R3区氨基酸序列信息库。由于⑶R3序列是不同抗体基因接近唯 一的标示符，可以依据获得的CDR3序列的数量评估其在抗体可变区基因谱中的丰度。以样 品GW02-5为例，比较来自于脾脏和骨髓的抗体可变区基因谱(见图4-5,表7-8)，结果表明两 种组织中⑶RH3或⑶RL3丰度的相关性相近，R 2值分别为0.69和0.71;其中排名位于抗体可 变区基因谱前十位的高丰度CDR3的相关性较低，这意味着在强化免疫条件下，高通量测序 结果可以反映骨髓与脾脏组织中抗体细胞种类和数量的差异。
[0085] 表 7
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091] 此外，还比较了各个重复间的CDRH3和CDRL3氨基酸序列丰度的相关性（见图6-图 9)，结果显示各个重复间的CDRH3和CDRL3序列丰度具有很高的相关性，说明实验体系是稳 定的。
[0092] 实施例3杂交瘤和抗体可变区基因谱序列的比较以及候选配对序列的选择
[0093] 总计分析了 18个GW02和23个GW01单克隆杂交瘤细胞系，提交杂交瘤抗体基因可变 区进行IgBlast，确定⑶R3H和⑶R3L片段信息。将⑶R3H和⑶R3L与对应的抗体可变区基因谱 比较，大部分杂交瘤⑶R3H和⑶R3L都包含在抗体可变区基因谱当中，而且部分⑶R3对应的 测序条数超过测序总条数的1%，属于高丰度CDR3。高丰度CDR3的数目以及杂交瘤CDR3在抗 体可变区基因谱中的比例见以下表9。
[0094] 表 9
[0095]
[0096] 表9中，CDR3>1% :超过抗体测序条数1%的杂交瘤⑶R3的数量;CDR3数量:选取的 杂交瘤CDR3数量；％总测序条数:杂交瘤CDR3在抗体测序条数中的比例。
[0097] 进一步的分析表明，杂交瘤天然配对⑶R3H和⑶R3L在抗体库中的丰度并不均一。 部分0)1?3!1和0)1?31^的丰度相近，例如样品6101-3-11/6101-3-30)1?3!1了1^0￥的丰度为 9.58%，配对CDR3L WQGTHFPWT的丰度为5.57% ;部分配对的丰度差别较大，以样品GW02-5 为例，GW02-5-191 和GW02-5-231 的CDR3H ARAYGDYGFIY和ASLLDF，它们的丰度分别为6 · 78 % 和3.02 % ;但是配对CDR3L FQGSLAPST和LQYDEIPYT的丰度分别为0.22 %和0.23 % ;此外， GW02-5-5/5-24/5-43和GW02-5-10的CDR3L WQGTHFPWT和QQYNSYPLT的丰度分别8·64%和 7.21 %，配对CDR3H的丰度为0.58 %和接近为0。而且WQGTHFPWT和QQYNSYPLT在两个抗原GW-01和GW-02中都以高丰度存在。由此我们推测抗体基因可能具有多种配对形式，包含高丰度 CDR3的抗体基因，或者包含高丰度和低丰度CDR3抗体基因间都可能配对形成功能性抗体。 以下表10-表13为各个杂交瘤序列在抗体库中的丰度分析结果。
[0098]表1〇
[0100]
[0101]表11
[0109]
[0110] 上述表格中，VH:重链可变区;VL:轻链可变区。
[0111] 针对两个抗原选取6条杂交瘤抗体重链基因，与抗体可变区基因谱中包含高丰度 CDR3的轻链基因以及天然配对的杂交瘤抗体轻链基因在体外配对表达。选择的杂交瘤重链 基因 CDR3都同时存在于抗体可变区基因谱当中，而且其中三条CDR3，TRGDY， ARS⑶AYYFAWFAY和ARGGGA在抗体可变区基因谱当中的排名分别为第1，2和10位;其余三条 CDR3属于低丰度CDR3。其对应的抗体天然配对轻链中的2条包含高丰度CDR3其余4条包含低 丰度。选取的包含高丰度CDR3的轻链候选配对基因在至少一个免疫受体抗体可变区基因谱 中排名位于前十位。
[0112] GW01和GW02候选⑶R3H和⑶R3L配对基因信息分别见以下表14和表15。表14
[0116]
[0117] 候选配对基因全长信息来源于杂交瘤基因测序，或者通过抗体可变区全长序列挑 选方法获取，例如轻链基因可变区K10和K11，首先在基因可变区测序结果中确定候选CDR3 序列，继尔依次挑选最高丰度⑶R2和⑶R1序列，以此确定⑶R1，CDR2和⑶R3的序列信息，然 后从测序结果中获取包含确定CDR1，CDR2和CDR3的最高丰度片段，获取抗体可变区全长氨 基酸序列和核苷酸序列信息。在体外从头合成抗体基因并配对表达。
[0118] 比较了候选配对轻链基因的CDR3区序列，在部分基因具有较高的相似性，例如K5， K8，K9，K10之间的相似性达到78%-89%，它们有可能是在抗体形成过程中形成的超变异 体，在抗体可变区基因谱中的富集可能意味着他们与特异性抗原相关。
[0119] 实施例4GW01和GW02配对抗体的体外表达
[0120] 将候选重链和轻链的可变区通过搭桥PCR的方法构建表达框，表达框包括启动子， 可变区和人抗体恒定区。将包含重链和轻链表达框的质粒配对转染293FT细胞，进行体外表 达和抗体功能分析。收集293FT细胞并调整细胞密度接种48孔板至1.2Χ10 5/孔;37°C，5% C02孵箱培养过夜，待细胞密度长至60-80%时进行转染。将0.25以8重链和0.75以 8轻链质粒 在室温孵育5分钟，然后与转染试剂混匀后在室温孵育20min形成转染复合物。将转染复合 物加入细胞孔，轻轻混匀。37°C，5%C0 2孵箱培养72小时。收集上清用ELISA检测活性。首先 将抗人18〇$(：)与检测抗原分别用?!19.6碳酸包被液稀释成1(^8/1111，96孔酶标板每孔包 被100μ1，4Γ，过夜;或者37°C，2小时;然后用4%脱脂奶粉-PBS封闭，300μ1/孔，37°C处理1 ~2小时。丢弃酶标孔内液体，用TOST洗三遍后加入转染48小时培养上清100μΙ/孔，37 °C处 理1小时，设定培养基和对照。丢弃酶标孔内液体，用PBST洗三遍，分别加入HRP羊抗人 186$(3)，1 :2000;与冊?羊抗人186，1:5000;10(^1/孔，37°(：处理11^。弃酶标孔内液体，用 PBST洗五遍，加入(PD显色液，100μΙ/孔，避光显色;酶标仪读取0D490波长吸收值。
[0121] 抗原GW01和GW02的配对抗体亲和力分析结果分别如图10和11所示，抗原GW01和 GW02的抗体配对效率分析结果分别如图12所示。
[0122] 结果显示，源于两个免疫宿主受试者的44个重链/轻链配对当中，获得7个具有亲 和力的抗体，其中有3个是杂交瘤抗体基因天然配对;其余4个是杂交瘤重链基因与包含高 丰度⑶R3轻链的重组配对，重链基因 GW02-5-H2与3条轻链Κ5，Κ9和ΚΙ 1配对都形成具有亲和 力的抗体，其中QQYNSYPLT(K5)在两种靶抗原免疫宿主受试者的可变区基因谱当中都属于 高丰度CDR3L，它与QQYNSYPFT(K9)CDR3的相似度为89%，基因可变区的相似度为84%，意味 着具有高相似度CDR3的轻链基因可能与同一个重链配对，形成功能抗体。也意味着可以采 用配对抗体CDR3区相似度高的序列形成一个小型文库，直接为抗体的亲和力成熟提供优化 的选择。
[0123] 6个杂交瘤天然配对中的3个如预期产生了有亲和力的抗体，说明杂交瘤抗体序列 的鉴定是准确的，体外配对表达和Elisa实验方法也是有效的。
[0124] 以上这些结果说明，结合杂交瘤抗体技术与高通量抗体测序技术，选取杂交瘤重 链基因与从抗体可变区基因谱中高丰度CDR3轻链基因配对表达，可以扩大配对候选基因的 选择范围，提高抗体结构优化的效率，增加了获取功能性抗体的可能性。杂交瘤重链GW02-5H2可以与多个高丰度轻链配对产生亲和力抗体，说明某些重链基因也具有较好的配对特 性，可能与多个具有高相似度CDR3的轻链基因配对产生功能性抗体。
[0125]
【申请人】声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的产品、详细制备工艺及其用 途，但本发明并不局限于上述详细制备工艺和用途，即不意味着本发明必须依赖上述详细 制备工艺和用途才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本 发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护 范围和公开范围之内。
【主权项】
1. 一种产生结合至少一种靶抗原的重组抗体的方法，其包括： (1) 用所述至少一种靶抗原免疫宿主受试者； (2) 使用经免疫的宿主受试者的脾脏细胞，制备杂交瘤细胞系，并获取特异性结合所述 至少一种靶抗原的杂交瘤抗体基因信息； (3) 使用免疫后的宿主受试者的淋巴细胞，进行免疫球蛋白基因可变区的高通量测序， 获取针对所述至少一种靶抗原的抗体可变区基因谱； (4) 选取杂交瘤抗体重链基因作为第一候选配对基因，并与从抗体可变区基因谱中选 择的轻链基因作为第二候选配对基因进行配对，以产生候选重组抗体。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(2)中，所制备的杂交瘤细胞系产生与所述靶 抗原具有高亲和力的单克隆抗体； 优选地，所述杂交瘤抗体基因信息包含抗体的重链和轻链可变区基因信息； 优选地，通过以下获取杂交瘤抗体基因信息： 以杂交瘤细胞总mRNA为模板，01 igo dT为引物，经反转录合成cDNA第一链，再以cDNA第 一链为模板，以混合的特异性引物扩增抗体重链可变区和轻链可变区基因，测序分析得到 杂交瘤基因序列，将杂交瘤基因序列进行IgBlast分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣 瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其中，步骤(3)中，所述抗体可变区基因谱包含抗体 的重链和轻链可变区基因信息； 优选地，所述基因信息是通过高通量DNA测序确定的； 进一步优选地，所述高通量DNA测序包括在测序反应的同时进行合成、连接或者杂交； 以及单分子DNA测序、多聚合酶群落测序、纳米孔测序或其组合； 优选地，所述高通量测序通过以下实施： 以细胞总mRNA为模板，使用SMARTer RACE技术合成第一链cDNA;设计上游引物，并根据 抗体恒定区序列保守区设计下游引物，以扩增抗体序列可变区。4. 根据权利要求1-3任一项所述的方法，其中，步骤(4)中，从抗体可变区基因谱中选取 包含高丰度CDR3或者包含与所述高丰度CDR3高度相似的CDR3的轻链基因作为第二候选配 对基因。5. 根据权利要求1-4任一项所述的方法，其中，在从抗体可变区基因谱中选定第二候选 配对基因的CDR3的情况下，通过以下方法获得第二候选配对基因的抗体可变区： 从包含所选定CDR3的抗体基因片段的测序结果中，依次选取最高丰度的CDR2和CDR1片 段信息，然后挑选最高丰度的包含选定CDR2和CDR1片段信息的可变区全长序列，作为第二 候选配对基因的抗体可变区序列。6. 根据权利要求1-5任一项所述的方法，其中，还包括用所述至少一种靶抗原对所得抗 体进行鉴定的步骤。7. 根据权利要求6所述的方法，所述鉴定步骤包括体外表达所得抗体的scFv或Fab片段 或IgG，将所得scFv、Fab片段或IgG与祀抗原进行结合力测试； 优选地，所述体外表达方法包含但是不限于:通过原核细胞、噬菌体展示方法或酵母系 统表达scFv或者Fab片段，或者通过哺乳细胞外源基因表达Fab或者IgG; 优选地，所述测试方法包括但不限于ELISA和/或SPR。8. 根据权利要求1-7任一项所述的方法制得的重组抗体。9. 根据权利要求8所述的重组抗体，其为特异性靶向HA的重组抗体，所述重组抗体的重 链可变区包括如SEQ ID NO:40,42和50所示的⑶R3,并且所述重组抗体的轻链可变区包括 如SEQ ID 从)：20,53,68和103所示的〇)1?3。10. 根据权利要求8所述的重组抗体，其为特异性靶向ro-Li的重组抗体，所述重组抗体 的重链可变区包括如SEQ ID NO:84所示的⑶R3,并且所述重组抗体的轻链可变区包括如 SEQ ID 从)：23,89和105所示的〇)1?3。
【文档编号】C07K16/28GK106065031SQ201610023897
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2016年1月14日 公开号201610023897.9, CN 106065031 A, CN 106065031A, CN 201610023897, CN-A-106065031, CN106065031 A, CN106065031A, CN201610023897, CN201610023897.9
【发明人】陈维之, 王晓红, 洪媛媛, 陈豫, 孙中平
【申请人】苏州金唯智生物科技有限公司