基于高通量测序检测人EGFR基因变异的质控方法及试剂盒与流程

本发明涉及基因检测领域，具体涉及一种基于高通量检测人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的质控方法及试剂盒。
背景技术：
：在血液中存在着游离的小片段DNA(cell-freeDNA，cfDNA)，它们来自死亡的细胞。通常死亡的细胞会被清除掉，因此cfDNA的含量是非常低的，通常一个健康人的1ml血浆中含25ngcfDNA。而癌症患者的cfDNA的含量高出正常几倍，其中一部分是ctDNA(circulatingtumorDNA)。ctDNA的相对含量与肿瘤的负荷和对治疗的反应是相关的，可用于鉴定驱动基因、指导临床治疗、监测临床治疗效果及癌症复发、揭示治疗抗性以及检测疾病进展。在有些方面ctDNA方法的灵敏度甚至高传统的手段。例如，与传统的影像学检测相比，追踪早期乳腺癌患者术后血液中的肿瘤DNA，可以提前7.9个月发现乳腺癌复发。在肺癌中检测cfDNA的EGFR突变对肺癌也有着重要的诊断价值。ctDNA在癌症早期就可以被检测到。因为cfDNA容易收集，在肺癌中已显示与组织中的变异高度一致，因此ctDNA的液体活检越来越受到关注。血液中ctDNA含量，在癌症早期占cfDNA的比例是非常低，通常小于0.1％。ctDNA检测方法很多，如用数字化PCR(DigitalPCR)，或下一代测序(NextGenerationSequencing,NGS)等。通过NGS优化ctDNA的深度测序(CAPP-seq)使突变检测的敏感度达到0.02％，特异性为100％。此方法结合降低背景噪声的iDES(integratedDigitalErrorSuppression)分析方法后，使检测频率的阈值进一步下降到0.004％。从而大大提高了分析CtDNA的检出率。肺癌(lungcancer)是全球范围内最普遍和最致命的恶性肿瘤，5年生存率仅为17％左右，每年造成160万人的死亡。在中国吸烟和环境污染是两个最主要的肺癌致病因素。据统计2015年在中国有60万肺癌患者死亡，新增73万例。并有增长趋势，到2025年可能造成100万人死亡。肺癌根据组织病理学分类分为小细胞肺癌(small-celllungcarcinomas,SCLC)与非小细胞肺癌(no-small-celllungcarcinomas,NSCLC)，非小细胞肺癌又分为肺腺癌(adenocarcinomas)、鳞状细胞癌(squamouscellcarcinomas)和大细胞肺癌(large-cellcarcinomas)。比例最大的是肺腺癌，占40％，其次为占30％的鳞状细胞癌，大细胞肺癌和小细胞肺癌各占15％。全身性化疗一直是肺癌的主要治疗方式，缺乏特异性，副作用大。随着在NSCLC中一些重要基因变异的发现，针对这些基因变异的靶向药物被研制出来并已用于临床治疗。如吉非替尼是针对EGFR(epidermalgrowthfactorreceptor)变异的NSCLC靶向治疗药物。EGFR在细胞信号转导中起着重要作用，一旦被激活，可导致肿瘤细胞内酪氨酸蛋白激酶活化和自身的磷酸化，从而使细胞增生、转移、血管生成和细胞凋亡的抑制。EGFRexon19缺失和L858R突变激活EGFR，使对EGFR的抑制剂药物更敏感。在亚洲人中约50％NSCLC中含有EGFR，并且90％是上述激活型的突变。因此EGFR突变的鉴定对治疗NSCLC有着非常重要的作用。通过对人循环肿瘤DNAEGFR基因的检测可筛检出肺癌及其他相关恶性肿瘤的高危人群，利于该类疾病的早期诊断治疗。高通量测序技术(Highthroughputsequencing)又称二代测序技术(NextGenerationSequencing,NGS)，能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，然后将测序结果与参考序列进行比对，找到DNA分子上存在的突变信息。高通量测序技术是一种高效、精准的基因突变检测方法。目前国内尚无针对人循环肿瘤DNAEGFR基因测序检测的质控品和试剂盒。技术实现要素：本发明的目的是提供一种基于高通量测序检测人EGFR基因变异的质控方法及试剂盒。根据本发明的一个方面，提供人EGFR基因变异检测质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)选择EGFR基因变异阳性的、可稳定传代的人肿瘤细胞系，提取基因组并通过Sanger测序法测定每个细胞系中EGFR基因上的潜在变异位点，经Sanger测序法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点；(2)培养所选择的人肿瘤细胞系，将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合，获得质控品。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先提取各个细胞系的基因组DNA，分别片段化，然后将片段化的各个细胞系基因组DNA按照一定比例混合。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先提取各个细胞系的基因组DNA，将各个细胞系的基因组DNA按照一定比例混合，然后片段化。在一些实施方案中，“将来自各个细胞系的基因组DNA片段化并按照一定比例混合”可以是先将各个细胞系的基因组DNA片段化，再提取各个细胞系的片段化基因组DNA，然后将各个细胞系的片段化基因组DNA按照一定比例混合。在一些实施方案中，在按照一定比例混合之前，先将各个细胞系的片段化的或未片段化的基因组DNA稀释到相同浓度。在一些实施方案中，所述片段化是通过酶切片段化或通过超声处理片段化。在优选的实施方案中，通过MNase(微球菌核酸酶)酶切使DNA片段化。本发明的质控品中每一潜在变异位点上的变异频率值可以按照混合比例以及经Sanger测序法测定的变异频率确定，计算公式如下：其中混合比例i是指所选择的第i个细胞系的基因组DNA在质控品中的混合比例，变异频率i是指所选择的第i个细胞系的基因组DNA在该位点上的变异频率。在优选的实施方案中，所选择的可稳定传代的人肿瘤细胞系是A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系。在进一步优选的实施方案中，由A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系获得的片段化的或未片段化的基因组DNA按照1:1:1:1:1:1的比例(质量比)均匀混合。应当理解，根据本发明，所使用的细胞系包括但不限于A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系，可以使用其它人肿瘤细胞系。由A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417细胞系获得的片段化的或未片段化的基因组DNA也可以按照其它比例进行均匀混合。本发明可以通过选取不同的细胞系，配置不同的片段化的或未片段化的基因组DNA的比例，以及验证不同的变异位点来制备人EGFR基因变异检测质控品。选取不同的细胞系、配制不同的片段化的或未片段化的基因组DNA的比例时，所获得的质控品的变异位点和/或位点变异频率可能会有所不同，但不会妨碍其作为质控品的应用。在一些实施方案中，步骤(2)是：培养所选择的人肿瘤细胞系，使各个细胞系的基因组DNA片段化，然后提取纯化各个细胞系的片段化基因组DNA，再将各个细胞系的片段化基因组DNA按照一定比例混合，获得质控品。在一些实施方案中，所述人肿瘤细胞系的培养条件是包括37℃恒温，5％CO2，湿度50％培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括通过酶切使各个细胞系的基因组DNA片段化。在优选的实施方案中，所述酶是MNase(微球菌核酸酶)。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括在细胞生长对数期收集细胞，弃上清，用预冷PBS溶液重悬，吸弃上清，然后用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育后离心，吸弃上清，然后加入BSA和MNase，孵育后加入EDTA中止酶反应。在一些实施方案中，使各个细胞系的基因组DNA片段化包括在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清，然后使用预冷PBS溶液重悬，5000rpm速度4℃离心5min，吸弃上清；然后用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃离心10min；然后吸弃上清，加入1XMNaseBuffer，重悬沉淀；然后吸弃上清，加入1×MNaseBuffer，重悬沉淀；然后加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min，加入EDTA中止酶反应。在一些实施方案中，片段化的或未片段化的各个细胞系的基因组DNA在混合前分别被稀释至15±1ng/μL。在一些实施方案中，用TE溶液稀释片段化的或未片段化的各个细胞系的基因组DNA。根据本发明的另一个方面，提供通过上述方法获得的人EGFR基因变异检测质控品。根据本发明的另一个方面，提供人EGFR基因变异检测试剂盒，其中包含本发明的人EGFR基因变异检测质控品。本发明的人EGFR基因变异检测试剂盒还可以包含用于人EGFR基因变异的高通量测序检测的任何其它组分。在优选的实施方案中，所述人EGFR基因变异检测试剂盒进一步包含选自末端修复酶混合物、末端修复反应缓冲液、DNA连接酶、连接反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、PCR预混液、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交缓冲液、杂交增强剂、磁珠洗液、杂交洗液、捕获文库PCR引物、捕获探针、核酸纯化磁珠、链霉亲合素磁珠的一种或多种试剂。本发明的人EGFR基因变异检测试剂盒任选地还可以包含阴性质控品。在特别优选的实施方案中，所述人EGFR基因变异检测试剂盒包含上述全部试剂。根据本发明的又一方面，提供上述人EGFR基因变异检测质控品或人EGFR基因变异检测试剂盒在人EGFR基因变异的高通量测序检测的质量控制中的应用，特别是在人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的高通量测序检测的质量控制中的应用。本发明中，检测人EGFR基因变异可以包括检测人基因组EGFR基因变异，还可以包括检测人循环肿瘤DNAEGFR基因变异。本发明所述的“高通量测序”也被称为二代测序，其主要特点是能够同时对输入的序列进行大规模平行测序，获得大量短序列的测序结果。高通量测序的基本原理是将待测DNA随机打断成小片段，经末端修复、连接接头序列、PCR等步骤进行文库构建，最后使用Illumina，IonTorrent等测序仪进行测序。本发明的人EGFR质控品可以作为阳性质控品。本发明的人EGFR质控品包含不同的变异频率的变异位点，有利于控制分析准确性。本发明提供的人EGFR基因变异检测质控品和试剂盒能够有效对人EGFR基因变异(特别是人循环肿瘤DNAEGFR基因变异)的高通量测序检测体系的可靠性进行评估，提高了效率并降低检测质控成本。附图说明图1是质控品的电泳检测图。具体实施方式下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料和试剂，如无特殊说明，均可以从商业途径获得。实施例1：人循环肿瘤DNAEGFR基因变异检测质控品的制备1.1.从ATCC购买获得六株常用的可稳定传代人肿瘤细胞系A549、NCI-H720、NCI-H1650、NCI-H1975、SW48及SW1417。用Sanger法对每个细胞系的基因组DNA进行测序，经Sanger法确认的杂合和纯合变异位点作为阳性对照位点。经验证共含有12个阳性变异位点。1.2.采用专用培养基培养这六株人肿瘤细胞系，培养条件：37℃恒温，5％CO2，湿度50％。培养至细胞密度达培养皿面积80-90％时传代，在细胞生长对数期收集，1500g的速度4℃离心5min取沉淀弃上清。1.3.使用预冷PBS溶液重悬，5000rpm速度4℃离心5min，吸弃上清。重复本步骤一次。1.4.吸弃上清，使用0.1％TritonX-100重悬沉淀，冰上孵育10min，5000rpm速度4℃离心10min。吸弃上清，加入1XMNaseBuffer，重悬沉淀。1.5.吸弃上清，加入1×MNaseBuffer，重悬沉淀。加入1×BSA及MNase，37℃孵育5min。加入EDTA中止酶反应。2000g离心1min后取上清使用LifeTechMagMax试剂盒提取，最终将提取的六株人肿瘤细胞系核酸用TE溶液稀释至15±1ng/μL，并等比例混合，-20℃保存。取少量等比例混合物使用GXTouch和配套的DNAHighSensitivityReagentKit(二者均购自PerkinElmer,Inc.)进行电泳检测，按说明书进行操作。检测结果如图1所示。电泳结果表明：质控品片段化后大小集中于143bp，与人体中cfDNA大小接近，达到质控品制备要求。其中MNase是微球菌核酸酶，1XMNaseBuffer和MNase购自NEB。BSA是牛血清清蛋白，购自NEB。实施例2：人循环肿瘤DNAEGFR基因变异检测试剂盒的制备2.1.设计并合成针对人循环肿瘤DNAEGFR基因上不同目标区域的多个捕获探针，所有捕获探针的集合能够覆盖人EGFR基因全部编码外显子区域及外显子内含子交界区域；捕获探针上具有生物素标记；所述捕获探针的序列如下述中SEQIDNO:1-195所示。2.2.将上表中SEQIDNO:1-195所示的全部捕获探针按相同比例混合在一起，并将混合物稀释为工作浓度1.5PM(PM＝皮摩尔/升)，-20℃保存。2.3.将捕获探针混合物和实施例1中获得的质控品分别分装。2.4.准备说明书、外包装，组装封口。2.5.其中捕获探针混合物的用量为6μL/3反应，12μL/6反应，24μL/12反应，48μL/24反应；质控品的用量为5μL/3反应，10μL/6反应，20μL/12反应，40μL/24反应。实施例3：人循环肿瘤DNAEGFR基因变异的测序检测本实施例中测序所使用的仪器为基因序列自动分析仪CN500。质控品的制备方法同实施例1。3.1.从15例阳性血浆样本中提取人cfDNA，质控品直接使用，无需提取。3.2.文库构建3.2.1.末端修复0.2mlPCR反应管，加入30ng提取后的cfDNA样本或质控品，用LowEDTATE补齐至50μL，震荡混匀，短暂离心。分别加入1μL末端修复酶混合物和6μL末端修复反应缓冲液，震荡混匀短暂离心后在37℃保温5min，随后在65℃保温30min，37℃保温5min，进行末端修复。反应结束后取出PCR反应管，将产物全部转移至新的1.5mL离心管中；在每个离心管中加入108μL核酸纯化磁珠，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。在每个离心管中分别加入30μLLowEDTATE、18μL缓冲液、1μL修复酶G3、1μL修复酶G4，充分混匀后，于20℃孵育20min。取出离心管，分别加入50μLPEGNaCl，吹打混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上，室温静置2min后，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清。重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。3.2.2.接头连接向干燥后的离心管中分别单独加入5μL接头，并做好标记；分别加入20μLLowEDTATE、3μL接头缓冲液、2μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，25℃恒温孵育15min。加入49.5μLPEGNaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留。将离心管保持在磁力架上，室温干燥5min。分别加入30μLLowEDTATE、16μL缓冲液、3μL连接酶，充分混匀并重悬磁珠后，40℃恒温孵育10min。加入82.5μLPEGNaCl，充分混匀后室温孵育5min。将离心管转移至磁力架上静置2min，小心吸弃上清。加入200μL80％乙醇，室温静置30s后，小心吸弃上清，重复操作一次，确保无液体残留，室温干燥5min(不可使磁珠过度干燥)。加入20μLLowEDTATE，室温孵育3min。将离心管转移至磁力架上，静置2min，小心吸取上清至新的1.5mL离心管中。3.2.3文库扩增与纯化分别加入25μLPCR扩增酶混合物、5μL引物混合物进行PCR扩增。向反应完成的离心管中，加入1.65倍的PEGNaCl溶液，并吹打混合均匀，室温孵育。孵育完成后，将离心管置于磁力架上静置2-3min，待溶液澄清后，吸弃溶液，期间切忌接触磁珠。在离心管中加入新鲜的80％乙醇200μL，静置30s后，吸弃乙醇，切勿接触磁珠，重复操作一次。吸弃乙醇后，将磁珠晾干至表明呈磨砂状，切勿使磁珠过干，出现许多裂缝，磁珠晾干后，加入LowEDTATEbuffer20μL，并室温孵育。孵育完成后，置于磁力架上，静置2-3min，待溶液澄清后，吸取溶液，转移至新的1.5mLLoBind离心管中。3.3.文库捕获3.3.1.杂交将1-6个文库混合在一个样品池中进行杂交捕获，将文库按量混合于1.5mLLoBind离心管中成为一个样品池，样本用量不低于125ng，样品池总量不超过1μg。向样品池中加入2μL接头封闭剂和5μLDNA封闭剂，震荡混匀，短暂离心后冷冻真空抽干。加入8.5μL杂交缓冲液(2×)、2.7μL杂交增强剂和3.8μLPCR-gradewater，震荡混匀，短暂离心后，室温静置5min重溶。将重溶后的液体全部转移至新的0.2mLPCR反应管中，95℃保温10min。取出PCR反应管，短暂离心后加入2μL实施例2获得的捕获探针混合物，震荡混匀3-5s，短暂离心后在68℃保温4h以上，热盖温度为78℃。3.3.2.富集取链霉亲合素磁珠洗涤后加入1倍体积磁珠洗液，振荡重悬后按每管100μL分装到不同的0.2mLPCR反应管中。将步骤3.3.1中的PCR反应管取出，短暂离心后将全部杂交产物转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR反应管中，充分悬浮后于PCR仪上65℃孵育45min，期间每隔12min吸打混匀一次。孵育结束后，每管加入100μL65℃预热的1×洗液Ⅰ，将全部悬液转移至1.5mLLoBind离心管中，震荡混匀，短暂离心后转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。加入200μL65℃预热的1×杂交洗液，震荡混匀，短暂离心后65℃孵育5min，转移至磁力架上静置20s，吸弃上清。重复本步骤一次。再用磁珠洗液充分洗脱后加入18μLNuclease-freewater，震荡重悬后全部转移至0.2mLPCR反应管中备用。3.3.3.捕获文库扩增与纯化向上述PCR反应管中分别加入25μL2×PCR预混液和捕获文库PCR引物各2.5μL，充分混匀短暂离心后按下述程序进行PCR扩增：95℃3min；10个循环，每个循环为98℃20s，60℃30s，72℃30s；72℃1min；4℃保存备用。将PCR反应管短暂离心后，将产物全部转移至1.5mL离心管中。加入75μL核酸纯化磁珠，震荡混匀，室温静置10min后短暂离心，转移至磁力架上静置1min，吸弃上清。加入200μL80％乙醇，静置30s后，吸弃上清。重复洗涤一次，开盖晾干至无液滴残留。加入21.6μLNuclease-freewater震荡重悬磁珠，室温静置5min，转移至磁力架上静置1min，取20μL上清至新的1.5mLLoBind离心管中备用。取2μL捕获文库或捕获的质控品DNA进行定量(使用Qubit荧光定量仪)。3.4.测序及数据分析3.4.1.测序按照测序仪器及配套试剂使用说明进行上机测序。平均有效覆盖深度≥5000×。3.4.2.数据分析获得原始测序数据后，与参比数据库比对，进行变异分析和解读。检测结果如下：临床样本的突变位点及检测结果如表1所示。临床样本检测符合率：15/15＝100％。所有临床样本经数字PCR法验证无误。表1临床样本突变位点及检测结果质控品的变异位点检测结果如表2所示，其中参考突变频率为根据混合比例以及经数字PCR法测定的变异频率计算获得的理论检测值为高通量测序实验检测结果。表2质控品变异位点及检测结果No.基因cDNA变异信息蛋白变异信息参考频率检测结果1EGFRc.T2709Cp.T903T67.57％65.38％2EGFRc.C474Tp.N158N55.70％56.96％3EGFRc.G2361Ap.Q787Q57.13％51.11％4EGFRc.G1562Ap.R521K30.05％29.71％5EGFRc.T1887Ap.T629T55.47％58.24％6EGFRc.C2047Tp.L683L8.05％8.26％7EGFRc.2235_2249delp.745_750del9.17％17.69％8EGFRc.C1839Tp.A613A16.65％15.77％9EGFRc.C2369Tp.T790M11.92％12.3810EGFRc.G2028Ap.P676P4.42％4.59％11EGFRc.T2573Gp.L858R11.93％13.57％12EGFRc.G2155Ap.G719S5.30％5.28％由表2的结果可见，质控品中变异位点检测符合率为100％。实施例4：可重复性实验按照实施例1的制备方法制备质控品E-P2。使用质控品E-P2按照实施例2的制备方法生产三批试剂盒，批号分别为20160314，20160315，20160316。按照实施例3的检测方法进行高通量测序检测。同一批次试剂盒20160316，检测E-P2三次，检测结果见表3。不同批次试剂盒20160314，20160315，20160316，检测E-P2各三次，检测结果见表4。表3批内差异批号样本名称阳性变异符合率20160316E-P2100％(12/12)20160316E-P2100％(12/12)20160316E-P2100％(12/12)表4批间差异批号样本名称阳性变异符合率20160314E-P2100％(12/12)20160315E-P2100％(12/12)20160316E-P2100％(12/12)检测结果：试剂盒可重复性满足要求。当前第1页1 2 3