一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷的方法，干燥生地黄用75％乙醇水溶液加热回流提取制得地黄总浸膏，地黄总浸膏经大孔吸附树脂分离，梯度洗脱，收集5?10％乙醇洗脱液制得毛蕊花糖苷粗品，再用高速逆流色谱进行分离纯化，制得毛蕊花糖苷纯品。本发明方法利用大孔树脂获得5?10％乙醇洗脱液富集物，充分利用了生药资源，以高速逆流色谱分离纯化制得毛蕊花糖苷标准品，实现了单体纯化工艺的自动化和可操作性，可一次性获得纯度达98％以上的单体成品，具有方便简捷，产品纯度高，节约资源，速度快，毒性小，操作可控等特点。
【专利说明】
一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷的方法 (一)
技术领域
[0001] 本发明涉及一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷纯品的方法。 (二)
【背景技术】
[0002] 地黄(学名:Rehmannia glutinosa)为玄参科植物地黄的新鲜或干燥块根，为玄参 科植物。广泛分布于中国河南、湖北、山西、四川、浙江、内蒙古、湖南、山东、辽宁和其他省 市。鲜地黄性寒，味甘、苦，有清热生津、凉血、止血效果;生地黄性寒，味甘，具有清热凉血、 养阴、生津的功效;熟地黄性微温，味甘，具有滋阴补血、益精填髓的效果。经过近30年的研 究总结，已大致确定地黄的主要成分有苷类、糖类及氨基酸三大类，苷类含量最多且种类丰 富，其中毛蕊花糖苷属于苯乙醇苷类，是地黄药材质控指标之一，毛蕊花糖苷的别名为麦角 甾苷、毛蕊花苷、类叶升麻苷，其英文名为六(^6081(16、'\^1^38〇081(16、1(11838；[11；[11，其分子式 为C29H36015，分子量为624.59，结构式为如式1所示：
[0003]
[0004] 式1毛蕊花糖苷化学结构式
[0005] 查阅文献发现已经有很多分离纯化毛蕊花糖苷化合物的方法，例如从裸花紫珠、 肉苁蓉、桂花、毛泡桐花中提取分离毛蕊花糖苷，这些分离纯化过程主要采用反复柱层析的 方法来获取高纯度的毛蕊花糖苷样品，反复层析过程存在耗时长、溶剂耗费量大等缺陷；另 外，有多篇文献报道采用高效液相色谱分析这些植物中的毛蕊花糖苷含量。目前尚未有文 献报道从地黄中制备性分离纯化毛蕊花糖苷的高效方法。 (三)
【发明内容】
[0006] 本发明是为了建立一种高效的从地黄中提取分离毛蕊花糖苷纯品的方法。
[0007] 本发明采用大孔树脂富集-高速逆流色谱纯化地黄中毛蕊花糖苷，建立了一种从 地黄中提取分离毛蕊花糖苷纯品的方法。
[0008] 本发明提供了一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷的方法，所述方法包括以下 步骤：
[0009] A)提取:将干燥生地黄切成小块，加入体积分数75 %乙醇水溶液，加热回流提取2 ~5次，合并所有提取液，过滤，滤液蒸馏回收试剂得地黄总浸膏；
[0010] B)大孔树脂富集毛蕊花糖苷粗品：将D101型大孔吸附树脂装柱，将步骤A)制备的 地黄总浸膏上柱，吸附完全后，用乙醇水溶液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序依次为： 纯水、5 %、10 %、20 %体积浓度的乙醇水溶液，收集5 %和10 %体积浓度的乙醇水溶液洗脱 得到的洗脱液，浓缩得毛蕊花糖苷粗品；
[0011] C)高速逆流色谱分离纯化制备毛蕊花糖苷纯品：将步骤B)制备的毛蕊花糖苷粗品 进行高速逆流色谱分离纯化，以体积比1~2:3~4:5的乙酸乙酯、正丁醇与水为高速逆流溶 剂体系，所述高速逆流溶剂体系中，有机相和水相的体积比为1:1，将所述高速逆流溶剂体 系充分混合均匀，静置饱和，分层，分别得到上相和下相，取上相为固定相，下相为流动相， 取毛蕊花糖苷粗品，用体积比1:1的上相和下相的混合溶剂溶解后进样，高速逆流色谱分 离，紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，将含有毛蕊花糖苷的 流出液浓缩干燥，制得毛蕊花糖苷纯品。
[0012] 所述步骤A)中，所述体积分数75%乙醇水溶液的体积用量一般以生地黄的质量计 为 1 ~3mL/g，优选1 · 5~2mL/g。
[0013] 所述步骤A)中，所述加热回流提取2~5次，每次提取的时间通常为1~3小时，优选 1.5小时。
[0014]所述步骤B)中所用大孔吸附树脂为D101型，D101型大孔吸附树脂在使用前均需经 过预处理，大孔吸附树脂的预处理方法是本领域技术人员公知的。
[0015] 所用的洗脱剂为不同浓度的乙醇水溶液，梯度洗脱，梯度为纯水、5 %、10 %、20% 体积浓度乙醇溶液，收集5-10 %乙醇洗脱液，主要含毛蕊花糖苷。
[0016] 所述梯度洗脱时，每个梯度洗脱至流出液为无色时，即可更换下一个梯度。一般每 个梯度需要20~25个柱体积的洗脱剂。
[0017] 进一步，步骤B)优选按以下工艺进行:将预处理后D101型大孔树脂装柱，加步骤A) 中的地黄总浸膏用水稀释后上柱进行吸附，控制树脂柱的流速为4柱体积/h，直至吸附完 全，然后用不同梯度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序为:纯水、5%、10%、 20 %体积浓度的乙醇水溶液，收集5 %和10 %乙醇水溶液洗脱得到的洗脱液，浓缩得毛蕊花 糖昔粗品。
[0018] 所述步骤C)中，所述高速逆流溶剂体系中，有机相和水相的体积比为1:1，有机相 的体积是指乙酸乙酯和正丁醇的总体积。
[0019] 所述步骤C)中，优选所述高速逆流溶剂体系为下列之一：体积比2: 3 : 5的乙酸乙 酯、正丁醇和水;体积比1:4:5的乙酸乙酯、正丁醇和水。
[0020] 所述步骤C)优选按以下操作:将步骤B)制备的毛蕊花糖苷粗品进行高速逆流色谱 分离纯化，以体积比1~2:3~4: 5的乙酸乙酯、正丁醇与水为高速逆流溶剂体系，将所述高 速逆流溶剂体系充分混合均匀，静置饱和，分层，分别得到上相和下相，取上相为固定相，下 相为流动相，先将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分离柱，设定高速逆流色谱仪，柱 温15°C~30°C (优选30°C)，在500~1000r/min转速（优选800r/min转速）下，以0.5~5ml/ min(优选1.5ml/min)的流速注入流动相，以波长200-400nm(优选340nm)的紫外检测器检 测，当柱尾端明显有流动相流出时，取毛蕊花糖苷粗品，用体积比1:1的上相和下相的混合 溶剂溶解后进样，高速逆流色谱分离，紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形收集 对应流出液，将含有毛蕊花糖苷的流出液浓缩干燥，制得毛蕊花糖苷纯品。
[0021] 所述步骤C)中，高速逆流色谱的分离条件优选：柱温30°C，检测波长340nm，流速 1.5ml/min，正车专，车专速800r/min〇
[0022] 本发明通过高速逆流色谱分离纯化制得毛蕊花糖苷标准品，具有如下有益效果：
[0023] (1)本发明可以利用大孔树脂获得5-10%乙醇洗脱液富集物，从而充分利用了生 药资源。
[0024] (2)本发明创新性地以高速逆流色谱分离纯化制得毛蕊花糖苷标准品，实现了单 体纯化工艺的自动化和可操作性，可一次性获得纯度达98%以上的单体成品。
[0025] (3)本发明制备方法具有方便简捷，产品纯度高，节约资源，速度快，毒性小，操作 可控等特点。 (四）
【附图说明】
[0026]图1为实施例1中溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水(2:3:5)，5 %乙醇水溶液洗脱得 到的洗脱液浓缩后所得毛蕊花糖苷粗品的高速逆流色谱图。
[0027]图2为实施例2中两相溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（1:4:5)，10%乙醇水溶液 洗脱得到的洗脱液浓缩后所得毛蕊花糖苷粗品的高速逆流色谱图。
[0028]图3为实施例3中两相溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（1:4: 5)，510%乙醇水溶 液洗脱得到的洗脱液浓缩后所得毛蕊花糖苷粗品的高速逆流色谱图。
[0029]图4实施例3中5%和10%乙醇水溶液洗脱的洗脱液合并后的样品的HPLC色谱图。 [0030]图5高速逆流色谱分离得到的毛蕊花糖苷产品的HPLC色谱图。 (五)
【具体实施方式】
[0031]为进一步说明本发明，以下结合实施例说明本发明提供的一种从中药地黄中提取 分离毛蕊花糖苷标准品方法的具体操作。
[0032] 实施例1:
[0033] 提取:称地黄药材300g，置1000ml的圆底烧瓶中，加体积分数75%乙醇溶液500ml， 加热回流提取，提取次数为2次，每次时间为1.5h。合并提取液，冷却，过滤，将滤液移至 1000ml的烧瓶中，用旋转蒸发仪旋干得浸膏。大孔树脂富集毛蕊花糖苷:取一定量已预处理 的D101型大孔树脂，装柱，取浸膏用水稀释后上样，控制流速4BV/h，直到吸附完全。然后进 行梯度洗脱，先用水洗脱除去糖类，然后依次用5%、10%、20%体积浓度的乙醇水溶液洗 脱，每个梯度洗脱时，流出液无色时即可更换下一个梯度，收集5%乙醇水溶液洗脱的洗脱 液，浓缩得毛蕊花糖苷粗品。高速逆流色谱分离纯化:柱温30°C，检测波长340nm，配制两相 溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水(2:3:5)，充分混合后静置，分层，以上相作固定相，下相为 流动相，流速1.5ml/min，正转转速约800r/min，取上述粗品约350mg，量取10ml上相与10ml 下相溶解350mg样品，作为进样样品。将上相作为固定相栗入高速逆流色谱仪，待上相完全 充满管道后，打开主机，转速800r/min，将下相以1.5m/min流速栗入分离柱。平衡后进样，高 速逆流色谱分离，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，将含有毛蕊花糖苷的流 出液浓缩干燥，制得毛蕊花糖苷纯品。5%乙醇水溶液洗脱的洗脱液收集浓缩后的样品的高 速逆流色谱图见图1。分离纯化得到的毛蕊花糖苷165mg，其纯度达98.5 %。HPLC检测其保留 时间与毛蕊花糖苷的商用标准品的保留时间相同。
[0034] 实施例2:
[0035] 提取:称地黄药材300g，置1000ml的圆底烧瓶中，加75%乙醇溶液500ml，加热回流 提取2次，每次时间为1.5h。合并提取液，冷却，过滤，将滤液移至1000ml的烧瓶中，用旋转蒸 发仪旋干得浸膏。大孔树脂富集毛蕊花糖苷:取一定量已预处理的D101型树脂(相当于10g 干树脂），装柱，将地黄总浸膏用水稀释作为上样溶液，控制树脂柱的流速为4BV/h，直至吸 附完全。然后进行梯度洗脱，先用水洗脱除去糖类成分，然后依次用10%、20%体积浓度的 乙醇水溶液洗脱，每个梯度洗脱时，流出液无色时即可更换下一个梯度，收集10%乙醇水溶 液洗脱的洗脱液，旋干得毛蕊花糖苷粗品约380mg。高速逆流色谱分离纯化:柱温30°C，检测 波长340nm，配制两相溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（1:4:5)，充分混合后静置，以上相作 固定相，下相为流动相，流速1.5ml/min，正转转速约800r/min，取上述粗品380mg，量取10ml 上相与10ml下相溶解样品，作为进样样品，分离纯化得到的毛蕊花糖苷170mg，其纯度达 98%。10%乙醇水溶液洗脱的洗脱液浓缩后的样品的高速逆流色谱图见图2 APLC检测其保 留时间与毛蕊花糖苷的商用标准品的保留时间相同。
[0036] 实施例3:
[0037] 提取:称地黄药材300g，置1000ml的圆底烧瓶中，加75%乙醇溶液500ml，加热回流 提取2次，每次时间为1.5h。合并提取液，冷却，过滤，将滤液移至1000ml的烧瓶中，用旋转蒸 发仪旋干得浸膏。大孔树脂富集毛蕊花糖苷:取一定量已预处理的D101型树脂(相当于10g 干树脂），装柱，将地黄总浸膏稀释后上样，控制树脂柱流速为4BV/h，直至吸附完全。然后进 行梯度洗脱，先用水洗脱除去糖类成分，然后依次用5 %、10 %、20%体积浓度的乙醇水溶液 洗脱，每个梯度洗脱时，流出液无色时即可更换下一个梯度，收集5%和10%乙醇水溶液洗 脱的洗脱液，合并，合并后的洗脱液的HPLC色谱图见图4,图4中，t = 26.7min为毛蕊花糖苷。 旋干得毛蕊花糖苷粗品约473mg。高速逆流色谱分离纯化:柱温30°C，检测波长340nm，配制 两相溶剂体系为乙酸乙酯-正丁醇-水（1:4: 5)，充分混合后静置，以上相作固定相，下相为 流动相，流速1.5ml/min，正转转速约800r/min，取上述粗品250mg，量取10ml上相与10ml下 相溶解样品，作为进样样品，分离纯化得到的毛蕊花糖苷126mg，其纯度达99%。高速逆流色 谱图见图3.最终产品的高效液相色谱图见图5,图5中，t = 27.2min为毛蕊花糖苷。与毛蕊花 糖苷的商用标准品的保留时间相同。
【主权项】
1. 一种从中药地黄中提取分离毛蕊花糖苷的方法，其特征在于所述方法包括以下步 骤： A) 提取：将干燥生地黄切成小块，加入体积分数75 %乙醇水溶液，加热回流提取2~5 次，合并所有提取液，过滤，滤液蒸馏回收试剂得地黄总浸膏； B) 大孔树脂富集毛蕊花糖苷粗品：将D101型大孔吸附树脂装柱，将步骤A)制备的地黄 总浸膏上柱，吸附完全后，用乙醇水溶液进行梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序依次为:纯水、 5 %、10 %、20 %体积浓度的乙醇水溶液，收集5 %和10 %体积浓度的乙醇水溶液洗脱得到的 洗脱液，浓缩得毛蕊花糖苷粗品； C) 高速逆流色谱分离纯化制备毛蕊花糖苷纯品：将步骤B)制备的毛蕊花糖苷粗品进行 高速逆流色谱分离纯化，以体积比1~2:3~4:5的乙酸乙酯、正丁醇与水为高速逆流溶剂体 系，所述高速逆流溶剂体系中，有机相和水相的体积比为1:1，将所述高速逆流溶剂体系充 分混合均匀，静置饱和，分层，分别得到上相和下相，取上相为固定相，下相为流动相，取毛 蕊花糖苷粗品，用体积比1:1的上相和下相的混合溶剂溶解后进样，高速逆流色谱分离，紫 外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，将含有毛蕊花糖苷的流出 液浓缩干燥，制得毛蕊花糖苷纯品。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤A)中，所述体积分数75 %乙醇水溶液 的体积用量以生地黄的质量计为1~3mL/g。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤C)中，所述高速逆流溶剂体系为下列 之一:体积比2:3:5的乙酸乙酯、正丁醇和水;体积比1:4:5的乙酸乙酯、正丁醇和水。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤C)按以下操作:将步骤B)制备的毛蕊 花糖苷粗品进行高速逆流色谱分离纯化，以体积比1~2:3~4:5的乙酸乙酯、正丁醇与水为 高速逆流溶剂体系，将所述高速逆流溶剂体系充分混合均匀，静置饱和，分层，分别得到上 相和下相，取上相为固定相，下相为流动相，先将固定相充满高速逆流色谱仪的多层线圈分 离柱，设定高速逆流色谱仪，柱温15°C~30°C，在500~1000r/min转速下，以0.5~5ml/min 的流速注入流动相，以波长200-400nm的紫外检测器检测，当柱尾端明显有流动相流出时， 取毛蕊花糖苷粗品，用体积比1:1的上相和下相的混合溶剂溶解后进样，高速逆流色谱分 离，紫外检测器检测，根据紫外检测器光谱图的峰形收集对应流出液，将含有毛蕊花糖苷的 流出液浓缩干燥，制得毛蕊花糖苷纯品。
【文档编号】C07H1/08GK106065024SQ201510726192
【公开日】2016年11月2日
【申请日】2015年10月30日 公开号201510726192.9, CN 106065024 A, CN 106065024A, CN 201510726192, CN-A-106065024, CN106065024 A, CN106065024A, CN201510726192, CN201510726192.9
【发明人】童胜强, 步知思, 李行诺, 楚楚
【申请人】浙江工业大学