包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分的抗病毒组合物的制作方法

专利名称：包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分的抗病毒组合物的制作方法
包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分的抗病毒组合物相关申请的交叉引用本专利申请要求于2009年11月03日提交的韩国专利申请No. 10-2009-0105438,于2009年11月03日提交的韩国专利申请No. 10-2009-0105439,于2010年11月03日提交的韩国专利申请No. 10-2010-0108831,于2010年11月03日提交的韩国专利申请No. 10-2010-0108832以及于2010年11月03日提交的PCT专利申请No. PCT/KR2010/007724的优先权利益，所述专利申请的内容通过引用并入本文。
背景技术：
1.发明领域本发明涉及包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分(fraction)的抗病毒组合物。 2.相关技术的描述许多人类的传染病由病毒引起，病毒能够导致多种严重的疾病，诸如狂犬病、天花、脊髓炎、肝炎、黄热病、免疫缺陷、脑炎和艾滋病。这些病毒性传染病，例如流感、麻疹、腮腺炎和水痘极易传染，不仅会造成急性症状，而且会造成呼吸道或消化系统功能障碍。一些病毒，诸如麻疫病毒和细胞巨化病毒能够造成出生缺陷，其他被认为是致癌病毒的病毒能够在人类中造成肿瘤和癌症。因此，迄今为止，对于抗病毒药物已经进行了长期的、充分的研究。抗病毒药物削弱或者消除了袭击人体的病毒的作用，包括奥司他韦(Oseltamivir)(达菲Tamiflu)、扎那米韦(Zanamivir)(瑞乐沙Relenza)、干扰素、免疫球蛋白制剂等。然而，就已经被用来预防和治疗病毒性传染病的传统抗病毒药物而言，由于病毒耐药和对抗这些药物的突变病毒的副作用而在连续使用时会存在一些问题。因而，发展新的、天然产品来源的能够解决传统抗病毒药物的问题的抗病毒药物是需要的，而且，特别是发展无毒的、适用于医药和饲料添加剂的天然材料是需要的。干扰素-Y (IFN- Y )是由免疫系统中活化的T细胞和自然杀伤(NK)细胞产生的、响应外来物质、诸如病毒、寄生虫和肿瘤细胞侵袭的天然蛋白。IFN-Y是由T辅助性细胞I (Thl)、细胞毒T细胞(Tc)、树突状细胞、或NK细胞释放的双分子细胞因子，其会响应双链RNA的存在，是病毒感染的重要指标，是II型干扰素的成员。IFN-Y具有强大的巨噬细胞激活作用，最初被称为巨噬细胞激活因子。根据目前的研究，IFN-Y诱导大约30个基因的转录变化，产生了多种免疫和细胞响应增加巨噬细胞的抗原呈递，提高巨噬细胞的溶酶体活性，激活巨噬细胞中的溶酶体；抑制Th2细胞的活性；增加正常细胞中I类MHC分子的表达；增加白细胞的迁移；并且提高NK细胞的活性。IFN-Y抑制病毒复制，激活NK细胞，增加向淋巴细胞的抗原呈递，并且提高宿主细胞中对病毒感染的抵抗力，促进免疫响应。当抗原呈递给待匹配的T和B细胞时，这些细胞以有策略且特异的方式区分并移除外源性物质。在这方面，抗原呈递是免疫响应中非常重要的机制。已知NK细胞参与先天性和获得性免疫应答。NK细胞通过细胞毒性和细胞因子的产生来调节它们的效应子功能，并且作为靶细胞受体和配体调节的细胞毒性细胞来起作用。用于细胞毒性的NK特异性受体包括NKp46(Sivori，S. et al.，J Exp Med,186 :1129-1136,1997)、NKp30(Pende，D. et al.，JExp Med,190 :1505-1516，1999)和NKp44(Cantoni, C. et al. , J Exp Med，189 :787_796，1999)，其被称为天然细胞毒性受体(NCR)。已知的用于NCR的配体包括流行性感冒病毒(IV)的血凝素(HA)、仙台病毒(SV)的血凝素-神经氨酸酶(HN) (Arnon, T. I. et al.，Eur J Immunol, 31 :2680-2689,2001)和膜相连的硫酸肝素蛋白聚糖(Bloushtain, N. et al.，J Immunol, 173 :2392-2401，2004)。NK细胞也通过分泌细胞因子，诸如IFN-Y在促进获得性免疫应答的发展中起到重要的作用(Stetson, D. B. et al. ,J Exp Med，198 :1069-1076，2003)，据报道 IFN-Y 在鼠巨细胞病毒感染中具有抗病毒活性。NK细胞既参与直接的先天防御又参与获得性免疫应答的形成。在几个小鼠模型中，NK细胞抑制了肿瘤的发展和微生物感染。特别地，NK细胞在小鼠巨细胞病毒(MCMV)感染初期阶段直接杀死病毒感染的细胞，并且产生IFN-Y，其作为调节子来起作用。在NK细胞中产生IFN- y的主要路径依赖蛋白激酶C 0 (PKC 0 )的活化作用。Tassi领导的研究人员报道NK细胞受体的结合导致PKC 0迅速激活，NK细胞受体通过免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)传递信号。对来自PKC 0-缺陷小鼠的NK细胞的分析表明 PKC 9 是 ITAM-介导的 IFN-Y 分泌所需的因子(Tassi, I. et al. ,Blood, 112 :4109-4116,2008)。磷脂酶C Y (PLCy)是IFN-Y分泌中非常固有的基础因子。与野生型细胞相比，PLC y 2-缺陷NK细胞中产生IFN- y的基础水平显著降低，以抗NKl. I刺激不会使IFN- y释放增加(Caraux, A. et al. , Blood, 107 :994-1002, 2006) PLC Y 2-缺陷 NK 细胞产生IFN-Y或者粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的能力严重受损，PLCY2在NKG2D以及NKl. I-介导的细胞因子生产中起到关键的作用(Regunathan, J. et al. , J Immunol,177 :5365-5376, 2006)。在小鼠中，这些包括Fe受体(FcR)的Y -链，该受体的结合导致相关转接蛋白的ITAM的酪氨酸磷酸化，从而募集脾酪氨酸激酶(Syk)。该激酶活化多个下游信号传导介质(signaling mediators),包括用于活化T细胞的连接子、含有SH2结构域的76kDa的白细胞蛋白、PLC、PI3K和Erk激酶。总体而言，这些信号传导介质引发基因转录和用于裂解性颗粒胞吐的细胞程序，这使得NK细胞溶解靶细胞，且产生前炎性趋化细胞因子和细胞因子，尤其是 IFN-Y (Tassi, I. et al.，J Immunol, 175 =749-754,2005) 如前所述，由于IFN-Y发挥抗病毒、抗增殖和免疫调节作用，所以它已经被用来治疗肝炎、各种病毒感染疾病和癌症。同时，大部分病毒具有免疫逃避策略，以保护自身对抗宿主IFN响应。尤其是，关于通过病毒来抑制IFN-Y信号传导的各种机理已经被报道。例如，已知爱泼斯坦-巴尔病毒会抑制IFN-Y受体基因的表达，阻止抗病毒IFN响应(Morrison, T. E. , et al. , Immunity15 :787-799, 2001)，已知诱导人肿瘤的疱疹病毒会抑制IFN-Y受体l(Li，Q.，J Virol 81，2117-2127，2007)。因此，需要发展一种物质，该物质能够促进IFN分泌，并且提高IFN活性，并由此提高抗病毒活性和免疫活性。桐树(油桐)是大戟科(Euphorbiaceaefamily)、猶牛儿苗目(Geraniales)、木兰纲(Magnoliopsida)中的落叶树。它的学名为油桐(Aleurites fordii),它通常也称为“桐油树”。它生长在中国，也生长在南韩的南部海岸。树生长到大约7. 5至IOm高，树皮为灰褐色，具有皮孔，粗枝向各个方向广泛蔓延。树叶相互交替，呈心形或圆形，带有淡红色的白色花朵在五月盛开。果实是蒴果，在九月成熟，圆形，且每个蒴果含有三颗种子。在南方，油桐作为遮阴树和园林树木来种植。从种子中收集油，该油被称为“桐油”。在东方，桐油传统上用于照明，但是其还有重要的现代工业用途。在东方传统医学中，油桐的果实在促进吐出由风引起的痰、消肿解毒和诱导排尿和排便方面有功效，且用于治疗由风痰诱发的咽炎(喉结核病、喉梅毒等)、疥疮、丹毒、烫伤、脓疱病、消化不良和大小便功能障碍。根在消化食物、充分除水、除痰和除寄生虫方面有功效，且用于治疗由于消化的食物滞留而引起沉重感、水肿、腹胀、哮吼、淋巴结核和蛔虫病。叶子在治疗痈、蜂窝织炎、受伤肿胀和解毒方面有功效，且用于治疗疖、丹毒、胫骨脓肿、冻伤、挤疮和痢疾(Bosup Chung, Minkyo Shin, Illustrated unabridged dictionary ofnative herbal drugs, Youngrimsa, Seoul, Korea, pp.741-742,1998)。关于油桐化学成份的研究表明油桐包含二萜酯、留醇、丹宁酸、油、香豆素和基于香豆素木质素(coumaroIignan)的化合物(Ishikura, N. et al. ， I. Botanical Magazine,88 :41-45, 1975 ；Nonaka, G. et al. , Chem. Pharm. Bull. 38 :861-865,1990 ；Fozdar, B.I.et al. , Phytochemistry 28，2459-2461，1989 ；Hiroto, M. et al. , Agriculturaland Biological Chemistry 43,2523-2529,1979 ;0kuda, T. et al. , Phytochemistry 14，509-515，1975)。关于油桐生物活性的研究显示人类多形核白细胞活化因子、人类嗜中性白细胞活化因子等以及油桐提取物和二萜酯被报道会诱发爱泼斯坦-巴尔病毒活化。油桐的12-0-十六烷酰-16-羟基佛波醇13-醋酸酯被报道在提高人类嗜T细胞病毒I型(HTLV-I)诱发的淋巴细胞的集落形成方面有功效。已知油桐的12-0-棕榈酰-16-羟基佛波醇13-醋酸酯和12-0-棕榈酰-4-脱氧-4 P-16-羟基佛波醇13-醋酸酯对于鱼具有与鱼藤酮相似的毒性(Hiroto，M. et al. ,Agricultural and Biological Chemistry 43,2523-2529,1979;Okuda, T. et al. , Phytochemistry 14,2513-2514,1975 ；Shichijo, S. et al, Journal ofClinical Laboratory Immunology 27,183-189,1988 ；Matsuda,S.et al. , InternationalJournal of Cancer 38,859-865,1986 ;Shichijo, S. et al. , Arerugi 34,190-197,1985 ；Ito, Y. et al. , Cancer Letters 18,87-95,198)。毛瑞香(Daphnekiusiana)是瑞香科(Thymelaeaceae family)、桃金娘目(Myrtales)、木兰纲(Magnoliopsida)中的常绿阔叶灌木。它的学名是毛瑞香，也称为“白瑞香”。它原产于南韩，且主要生长在庆尚南道的巨济岛、全罗南道的黑山岛和济州岛中海拔50至1，300m的海边山脚。它大约Im高。树叶相互交替，呈椭圆或倒披针形，约3至8cm长，约I. 2至3. 5cm宽，奇数边，光滑，底部尖锐，连接到短叶柄上。花雌雄异株，在二至四月开白色花，开在簇中的枝条顶上，且具有强烈的气味。苞为披针形，花梗短，带有灰色柔毛，花萼也有柔毛，且分为4个萼片。果实为浆果，像蛋形球，约8mm长，在五、六月份成熟为深红色。莖直，宝蓝色，多枝状形成展开的树形(spreading tree form)。在东方传统医学中，毛香瑞的花已经被用来治疗咽喉炎、牙疼、风湿痛、腹胀和早期乳腺癌；根已经被用于治疗喉咙痛；叶已经被用于治疗创伤、痛风和慢性皮炎。然而，生物活性还没有被清楚地知道(Bosup Chung, Minkyo Shin, Illustrated unabridgeddictionary of native herbal drugs, Youngrimsa, Seoul, Korea, pp. 741-742,1998)。关于毛瑞香的化学成分的研究报道毛瑞香包含基于花青素和基于香豆素的化合物(Ishikura，N， I.Botanical Magazine，88 :41_45，1975 ;Nakabayashi， T， Yakugaku Zasshi,74 192-193,1954) o然而，并没有关于油桐或毛瑞香抗病毒活性和免疫活化作用的报道。因此，本发明已经进行研究从而从植物天然提取物中搜寻能够解决传统抗病毒药物的问题的抗病毒材料，并且发现油桐的叶、茎和果实的提取物或组分，以及毛瑞香的叶、茎、花和根的提取物或组分显著提高了自然杀伤(NK)细胞中干扰素-Y (IFN-y)的分泌，并且具有抗病毒作用，从而完成了本发明。
发明概要本发明的一个目的是提供一种抗病毒组合物，该组合物包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分。本发明的另一个目的是提供一种用于缓解或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括 给患有病毒性疾病的个体施用包含作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分的组合物。本发明的又一个目的是提供一种用于预防病毒性疾病的方法，该方法包括给个体施用包含作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分的组合物。为了达到该目的，本发明提供一种用于预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物。本发明也提供一种用于预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的有机溶剂组分，其中，该有机溶剂组分通过以有机溶剂进一步提取油桐或毛瑞香提取物来制备。此外，本发明提供一种用于预防或缓解病毒性疾病的健康食品，该健康食品包括作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分。本发明还提供一种预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂，该饲料添加剂包括作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分。此外，本发明提供一种用于缓解或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括给患有病毒性疾病的个体施用药物组合物，其中，该药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分。本发明还提供一种用于预防病毒性疾病的方法，该方法包括给个体施用包含作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分的组合物。此外，本发明提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或治疗病毒性疾病的药物组合物的用途。本发明还提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的健康食品的用途。此外，本发明提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂的用途。本发明的油桐或毛瑞香的提取物或其组分能够诱导NK细胞中免疫相关细胞因子IFN-Y的分泌，从而显示强效的抗病毒活性或对病毒性疾病优良的作用，并因而能够作为活性成分被有效用于抗病毒组合物。
附图的简要i兑明本发明的以上或其他目的、特点和其他优点将从以下结合附图的详细描述中更清楚地被理解，其中图I为显示以油桐的叶、茎和果实的各甲醇提取物，由甲醇提取物分离的正己烷组分、乙酸乙酯组分、丁醇组分或水组分处理的NK92细胞中IFN-Y分泌的分析结果的图M :油桐的甲醇提取物；
H :油桐的正己烷组分；E :油桐的乙酸乙酯组分；B :油桐的丁醇组分；W :油桐的水组分；NC:阴性对照；以及PC:阳性对照。图2为显示以由油桐的叶、茎和果实的各提取物分离的各组分处理的NK92细胞中IFN-Y分泌的分析结果的图A :油桐叶的正己烷组分；B :油桐果实的正己烷组分；C :油桐茎的正己烷组分；以及D :油桐果实的乙酸乙酯组分。图3是显示以毛瑞香的叶、茎、花和根的各甲醇提取物，由甲醇提取物分离的正己烷组分、乙酸乙酯组分、丁醇组分或水组分处理的NK92细胞中IFN-Y分泌的分析结果的图A :毛瑞香的甲醇提取物；和B :毛瑞香的甲醇提取物的有机溶剂组分M :毛瑞香的甲醇提取物；H :毛瑞香的正己烷组分；E :毛瑞香的乙酸乙酯组分；B :毛瑞香的丁醇组分；W :毛瑞香的水组分；NC:阴性对照；以及PC:阳性对照。图4为显示以由毛瑞香的叶、茎、花和根的各提取物分离的各组分处理的NK92细胞中IFN-Y分泌的分析结果的图A :毛瑞香的甲醇提取物的有机溶剂组分(DKCS :培养的毛瑞香样品的茎JPDKCL 培养的毛瑞香样品的叶)；B :培养的毛瑞香样品的叶的正己烷组分；以及C :培养的毛瑞香样品的叶的乙酸乙酯组分。图5为显示以不同浓度的油桐的叶、茎和果实的各甲醇提取物处理的NK92细胞中IFN- y分泌的分析结果的图。图6为显示测量能够产生IFN- y的毛瑞香提取物的最小活性浓度的结果的图。
图7为显示不同时间通过RT-PCR测量以油桐提取物处理的NK92细胞中IFN-YmRNA表达的图。图8为显示不同时间通过RT-PCR测量以毛瑞香提取物处理的NK92细胞中IFN-YmRNA表达的图。图9为显示Bay-II (NF- k B活性抑制剂)或Rotterin处理(PKC活性抑制剂)之后，油桐提取物诱导的IFN-Y产生的变化的图；AF-I :油桐提取物。

图10显示通过FACS分析参与以油桐提取物或毛瑞香提取物处理的NK92细胞活性的细胞表面物质表达变化的结果的图。图11显示通过RT-PCR测量由油桐提取物处理流行性感冒病毒感染的肺上皮A549细胞中IFN-a和IFN-PmRNA表达的图； AF-I :油桐提取物。
_9] 优选实施方式的描述通过以下参考附图的现有优选实施方案的详细描述，本发明的特点和优点将被更加清楚地理解。首先指出，本文使用的术语或词语应当被解释为与本发明的技术精神对应的含义或概念，其基于以下原则本发明人能够恰当定义术语的概念，以最好地描述其自己的发明。此外，应当理解，与本发明相关的熟知的功能和结构的详细描述将被省略，以便使本发明的重点不受到不必要的模糊化。在下文中，本发明用到的术语将被描述。本说明书中的术语“提取物”具有一般用在本领域中的粗提取物的意思，但是从广义上讲,该术语也包括下述的组分。用在本说明书中的术语“组分”是指活性组分，其通过以与在提取中使用的溶剂不同的溶剂来分离本发明感兴趣的活性成分来获得。本发明中使用的术语“预防”是指通过施用本发明的组合物抑制病毒性疾病或延迟病毒性疾病进程的所有行为。本发明中使用的术语“治疗”和“缓解”是指通过施用本发明的组合物使得病毒性疾病的症状好转或者使它们变得更好的所有行为。本发明中使用的术语“施用”是指以任意合适的方式向个体提供本发明的组合物。本发明中使用的术语“个体”是指患有通过施用本发明的组合物能够使病毒性疾病的症状好转的疾病的所有动物，诸如人、猴子、狗、山羊、猪、大鼠等。本发明中使用的术语“饲料”是指提供维持家畜的生活和产奶、肉、蛋、毛皮等所需的有机或无机营养的物质。在下文中，本发明将被详细地描述。本发明提供一种用于预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该组合物包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物。油桐或毛瑞香提取物或其组分可以通过本领域熟知的各种提取方法来获得。油桐或毛瑞香提取物可以通过包括但不限于以下步骤的制备方法来制备(I)向油桐或毛瑞香中添加提取溶剂，并提取油桐或毛瑞香提取物；(2)冷却并过滤步骤⑴的提取物；以及
(3)在减压下浓缩步骤(2)过滤的提取物，并干燥经浓缩的提取物。在上述方法中，油桐或毛瑞香可以是任意油桐或毛瑞香，包括但不限于种植或购买的油桐或毛瑞香。油桐的干的叶、茎或果实中的每种均可以使用，毛瑞香的干的叶、茎、花或根中的每种均可以使用。提取溶剂可以是本领域中常规使用的任何提取溶剂，优选为水、醇或其混合物。醇可以是仏至(2的低级醇。低级醇可以是乙醇或甲醇。提取方法可以是但不限于，振摇提取，回流提取，超临界提取，或亚临界提取。添加到油桐或毛瑞香中提取溶剂的量可以是干的油桐或毛瑞香量的约2倍至约20倍。提取温度可以是但不限于，约20至50°C。提取时间可以是但不限于，约10至48小时，优选为24小时。提取可以重复三到五次，优选为三次，但不限于此。在上述方法中，步骤(3)中在减压下浓缩可以使用，但不限于真空降压浓缩器或真空旋转蒸发器。干燥可以是但不限于，减压干燥、真空干燥、沸腾干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。 油桐或毛瑞香提取物的组分可以通过包括但不限于以下的制备方法来制备向油桐或毛瑞香提取物中再添加有机溶剂，并制备有机溶剂组分。在该方法中，有机溶剂可以是本领域中常规使用的任何提取溶剂，可以是无水或含水的C1至C4的低级醇(甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、正丙醇、异丙醇或正丁醇等)、低级醇和水的混合溶剂、丙酮、乙酸乙酯、氯仿、1，3-丁二醇、己烷、二乙基醚或醋酸丁酯等。优选地，有机溶剂可以是但不限于，己烷、乙酸乙酯或丁醇。根据提高的极性(最低至最高)，通过向油桐或毛瑞香提取物添加己烷、乙酸乙酯、丁醇和水获得的各有机溶剂层的组分可以是优选的，且组分可以通过使用分液漏斗来分离，但不限于此。具体地，油桐或毛瑞香提取物可以悬浮在去离子水中，可以将己烷添加到其中，然后可以分离己烷层；可以再将乙酸乙酯添加到剩余的水层，可以分离乙酸乙酯层；可以再将丁醇添加到剩余的水层，然后可以分离丁醇层。各有机溶剂层的所有组分均能够使用。油桐或毛瑞香提取物或其组分可以通过但不限于诱导自然杀伤(NK)细胞中的干扰素-Y (IFN-y)分泌来发挥抗病毒活性。病毒性疾病可以是但不限于，受选自以下的一种或多种病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。本发明的组合物可以进一步包含除以上成分以外的一种或多种具有相同或相似功能的活性成分。以本发明组合物的总重量计，可以包含但不限于以重量计约0. I至约50份的油桐或毛瑞香提取物或其组分。除以上所述的活性成分外，本发明的组合物可以包括药学上可接受的载体。包含在本发明组合物中的药学上可接受的载体可以是任何常规用在制剂中的载体。药学上可接受载体的实例可以包括但不限于，乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁、矿物油等。除上述成分外，本发明的组合物可以进一步包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、芳香剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在“雷氏药学大全”(第9版，1995)中有详细描述。合适的本发明组合物的给药剂量可以根据诸如制备方法、给药方法、年龄、体重、性别、患者的健康状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄率和反应灵敏度等因素进行各种各样的规定。本发明组合物的口服给药剂量可以是但不限于，每天约0. 0001至约100mg/kg体重。本发明的组合物可以口服或胃肠外给药。对于胃肠外给药，可以选择静脉注射、皮下注射、肌肉注射、腹腔注射、真皮给药等。本发明的组合物的给药途径可以根据应用的疾病种类来确定。本发明的组合物可以根据本领域技术人员能实现的方法通过使用药学上可接受的载体和/或赋形剂制成单位剂型或装在多剂量容器中。制剂可以是油或在水性介质中的溶液、悬浮液或乳液、或提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊，可以进一步包括分散剂或稳定剂。 为了调查油桐或毛瑞香提取物或其组分的抗病毒活性，本发明人通过酶联免疫吸附试验研究了油桐或毛瑞香的提取物或其组分诱导干扰素-Y (IFN-Y)分泌的能力。结果，油桐叶、茎或果实的提取物或其组分(正己烷组分、乙酸乙酯组分或丁醇组分)显著增加了 NK细胞中IFN- y的分泌(表I、图I和图2)，IFN- y分泌以剂量依存的方式随油桐提取物浓度的增加而增加(图5)。此外，毛瑞香叶、茎、花或根的提取物或其组分(正己烷组分、乙酸乙酯组分或丁醇组分)显著增加了 NK细胞中IFN-Y的分泌(表2、图3和图4), IFN-y分泌以剂量依存的方式随毛瑞香提取物浓度的增加而增加(图6)。以油桐或毛瑞香提取物处理的NK92细胞中IFN- y的mRNA显著增加(图7和图8)。本发明人发现以Bay II处理的NK92细胞中由油桐提取物诱导的IFN-y产生减少，因此发现由油桐提取物诱导的IFN- y产生受NF- K B信号传导介导。以PKC信号传导通路抑制剂rotterin处理时IFN- y产生减少，表明NF- K B信号传导通路的上游信号转导通过PKC活性来诱导(图9)。通过FACS分析方法研究油桐或毛瑞香提取物对NK92细胞中细胞表面物质的表达的作用，结果表明，参与NK细胞活性的NKG2C和D的表达显著增加，与NK细胞自然杀伤活性相关的NKp44的表达显著增加(图10)。此外，以油桐提取物处理流行性感冒病毒A529细胞加速增加IFN-P的表达(图11)。IFN-y是具有强大的巨噬细胞活化作用的细胞因子，称为巨噬细胞活化因子，已知会在自然杀伤细胞(NK)中产生免疫和细胞应答。发现油桐或毛瑞香提取物或其组分诱导IFN-Y的分泌，因而具有强大的抗病毒活性。因此，该结果表明本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分能够有效用于用来预防或治疗病毒性疾病的药物组合物。此外，本发明提供一种用于缓解或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括给患有病毒性疾病的个体施用药物组合物，其中，该药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分。本发明还提供一种用于预防病毒性疾病的方法，该方法包括给个体施用包含作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分的组合物。药学有效量可以是但不限于，约0. 0001至约100mg/kg，优选为约0. 001至约10mg/kgo给药剂量可以根据体重、年龄、性别、健康状况、某些患者的饮食、给药时间、给药方法、清除率、疾病严重性等而变化。个体可以是脊椎动物，优选为哺乳动物，更优选为实验动物，诸如大鼠、兔子、豚鼠、仓鼠、狗和猫，更优选为类人猿，诸如黑猩猩和大猩猩。给药方法可以是口服给药或胃肠外给药。对于胃肠外给药，可以选择腹腔注射、直肠注射、皮下注射、静脉注射、肌肉注射、子宫内硬膜外注射、脑内注射或胸内注射。病毒性疾病可以是但不限于，受选自以下的一种或多种病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分能够诱导NK细胞内免疫相关细胞因子IFN-y的分泌，并因而显示强效的抗病毒活性和对病毒性疾病优良的作用，因此能够有效 用于预防或治疗病毒性疾病。此外，本发明提供一种用于预防或缓解病毒性疾病的健康食品，该健康食品包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分。病毒性疾病可以是但不限于，受选自以下的一种或多种病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分可以原封不动添加，或与其他食品或食品成分一起使用，并且可以根据常规方法合理使用。本发明的健康食品可以包括常规食品制备所添加的成分，例如蛋白质、碳水化合物、脂肪、营养物和调味品。对于食品的种类没有特别限制。能够向其中添加油桐或毛瑞香提取物或其组分的食品的例子包括肉、香肠、面包、巧克力、糖、点心、糖果、比萨、即食面条、其他面条、□香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、饮品、含酒精的饮料和复合维生素等，且包括所有传统意义上的健康食品。本发明的健康饮料组合物可以如传统饮料一样包括作为附加成分的各种调味剂或天然碳水化合物等。天然碳水化合物可以是单糖，诸如葡萄糖和果糖；二糖，诸如麦芽糖和蔗糖；多糖，诸如糊精和环糊精；以及糖醇，诸如木糖醇、山梨醇、赤藻糖醇等。天然甜味齐U，诸如奇异果甜蛋白和甜菊提取物或合成甜味剂，诸如糖精和天冬氨酰苯丙氨酸甲酯可以用作甜味剂。基于IOOmL本发明的组合物，天然碳水化合物的量通常可以是约0.01至
0.04g，优选为 0. 02 至 0. 03g。除此之外，本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分可以包括各种营养补充剂、维生素、电解质、调味剂、着色剂、果胶酸及其盐、褐藻酸及其盐、有机酸、保护性胶状增稠剂(protective colloidal thickeners)、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、用在碳酸饮品中的碳化剂等。此外，本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分可以包括用于制备天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。尽管不关键，但是以100重量份的本发明的组合物计，这些添加剂的通常用量为约0. 01至约0. I份。本发明的油桐或毛瑞香提取物或其组分能够诱导NK细胞中免疫相关的细胞因子IFN-y的分泌，并因而呈现强效的抗病毒活性和对病毒性疾病优良的作用，因此能够被有效地用于用来预防或缓解病毒性疾病的健康食品。本发明也提供一种用于预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂，该饲料添加剂包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分。病毒性疾病可以是但不限于，受选自以下的一种或多种病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。饲料添加剂具有抗病毒功效，因而通过不断地向家禽、家畜等供给饲料添加剂已经能够预防病毒性疾病和缓解已经发生的病毒性疾病。根据营养价值、主要成分、分配、含水量、混合条件和加工形式等可以以各种方式对饲料进行分类。饲料可以是但不限于，粗饲 料、浓缩饲料、补充饲料、蛋白质饲料、淀粉饲料、脂肪饲料或纤维饲料。本发明的饲料添加剂可以是但不特别限于，由0. I重量％至20重量％的油桐或毛瑞香提取物或其组分、0. 001重量％至0. 01重量％的脂肪酶、I重量％至20重量％的磷酸三钙、0. 01重量％至0. I重量％的维生素E、1重量％至10重量％的酶粉末、0. I重量％至10重量％的乳酸菌、0. 01重量％至10重量％的杆菌培养基和20重量％至90重量％的葡萄糖组成。任何饲料添加剂，倘若其包括有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分就可以是本发明的饲料添加剂。有效量意指通过不断向家禽、家畜等供给能够预防病毒性疾病或缓解已发生的病毒性疾病的量。此外，不产生超过添加该饲料添加剂益处的副作用的量更好。此外，饲料添加剂可以进一步包括家禽、家畜等可接受的载体。在本发明中，饲料添加可以原封不动使用，或熟知的载体、稳定剂等可以添加到饲料添加剂中。必要时，可以添加各种营养物，诸如维生素、氨基酸、矿物质等、抗氧化剂、抗生素、抗菌剂和其他添加剂。饲料添加剂可以有合适的剂型，诸如粉末、颗粒、丸、悬浮液等。本发明的饲料添加剂可以单独或与饲料混合供应给家禽、家畜等。本发明的油桐或毛瑞香的提取物或其组分能够诱导NK细胞中与免疫相关的细胞因子IFN-Y的分泌，并因而呈现强效的抗病毒活性和对病毒性疾病优良的作用，因此能够被有效用于用来预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂。此外，本发明提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或治疗病毒性疾病的药物组合物的用途。本发明还提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的健康食品的用途。此外，本发明提供油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂的用途。病毒性疾病可以是但不限于，受选自以下的一种或多种病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。本发明的油桐或毛瑞香的提取物或其组分能够诱导NK细胞中与免疫相关的细胞因子IFN-Y的分泌，并因而呈现强效的抗病毒活性和对病毒性疾病优良的作用，因此能够被有效用于制备用来预防、缓解或治疗病毒性疾病的药物组合物、健康食品或饲料添加剂。在下文中，将参考以下实施例和制备例更详细地描述本发明。然而，提供以下实施例和制备例仅用于解释的目的，其不应以任何方式限制本发明的范围。<实施例1> :油桐和毛瑞香提取物的制备<1-1>油桐叶、茎和果实甲醇提取物的制备油桐在韩国济州岛的西归浦收集。将4L甲醇分别添加到2kg干的油桐叶、茎和果实中。室温下进行旋转提取24h，收集经过滤的上清液。提取后，减压浓缩溶剂。然后，得到276g油桐叶提取物、120g油桐茎提取物和IOOg油桐果实提取物。
<1-2>毛瑞香叶、茎、花和根甲醇提取物的制备毛瑞香在韩国全罗南道的穆安收集。将4L甲醇分别添加到Ikg干的毛瑞香叶、茎、花和根中。室温下进行旋转提取24h，收集经过滤的上清液。提取后，减压浓缩溶剂。然后，得到118g毛瑞香叶提取物、140g毛瑞香莖提取物、80g毛瑞香花提取物和105g毛瑞香根提取物。〈对比实施例1>:完花的甲醇提取物的制备芫花(被报道具有抗流感病毒活性)在韩国京畿道的龙仁收集。根据〈实施例1>中提取物的制备方法，使用干芫花来制备芫花的甲醇提取物。<实施例2> :来自油桐提取物或毛瑞香提取物组分的制备〈2-1>油桐组分的制备〈2-1-1〉油桐的正己烷组分将实施例〈1-1>获得的油桐叶、茎和果实各自的甲醇提取物悬浮在I. 5L去离子水中，并且将I. 5L正己烷添加到该混合物中。分离正己烷的可溶性组分和水溶性组分。该操作重复三次。将正己烷的可溶性成分过滤，并减压浓缩，获得27. 6g油桐叶的正己烷组分、28g油桐茎的正己烷组分、4g油桐果实的正己烷组分。〈2-1-2〉油桐的乙酸乙酯组分添加1.5L乙酸乙酯，并且与实施例〈2-1-1〉中分离了油桐叶、茎和果实的正己烷组分的各自剩余组分相混合。分离乙酸乙酯组分。重复该操作三次。将乙酸乙酯组分过滤，并减压浓缩，获得80g油桐叶乙酸乙酯组分、18g油桐茎乙酸乙酯组分和40g油桐果实乙酸乙酯组分。〈2-1-2〉油桐的丁醇组分添加I. 5L 丁醇，并且与实施例〈2-1-2〉中分离了油桐叶、茎和果实的乙酸乙酯组分的各自剩余组分相混合。分离丁醇组分。重复该操作三次。将丁醇组分过滤，并减压浓缩，以获得55g油桐叶丁醇组分、24g油桐茎丁醇组分和12g油桐果实丁醇组分。〈2-2>毛瑞香组分的制备〈2-2-1〉毛瑞香的正己烷组分毛瑞香的正己烷组分是根据实施例〈2-1-1〉中描述的方法由实施例〈1-2>获得的毛瑞香叶、茎、花和根的甲醇提取物制备而成，获得31g毛瑞香叶的正己烷组分、36g毛瑞香茎的正己烷组分、2Ig毛瑞香花的正己烷组分和27g毛瑞香根的正己烷组分。
〈2-2-2〉毛瑞香的乙酸乙酯组分毛瑞香的乙酸乙酯组分是根据实施例〈2-1-2〉中描述的方法制备而成，获得7g毛瑞香叶的乙酸乙酯组分、8. 4g毛瑞香茎的乙酸乙酯组分、5g毛瑞香花的乙酸乙酯组分和6g毛瑞香根的乙酸乙酯组分。〈2-2-3〉毛瑞香油桐的丁醇组分毛瑞香的丁醇组分是根据实施例〈2-1-3〉中描述的方法制备而成，获得20g毛瑞香叶的丁醇组分、24g毛瑞香茎的丁醇组分、14g毛瑞香花的丁醇组分和18g毛瑞香根的丁醇组分。〈实施例3>检测油桐或毛瑞香提取物或其组分诱导干扰素-Y(IFN-Y)分泌的活性<3-1>自然杀伤(NK)细胞培养基 白细胞介素-2(IL-2)依赖性自然杀伤细胞系NK92(人NK淋巴瘤)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。NK92细胞在37°C、5% CO2下，在含有20%胎牛血清(FCS) (HyClone, Logan, UT)、2mM L-谷氨酸、100 y g/mL 青霉素、100 y g/mL 链霉素(LifeTechnologies)、补充有 100U/mL IL-2 (Chiron,Emeryville, CA)的 a-MEM( a -最低必须培养基)(Life Technologies, Karlsruhe, Germany)中培养。<3-2>通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测油桐或毛瑞香提取物或其组分诱导干扰素-Y (IFN- y )分泌的活性处理2 ii g/mL油桐叶、茎或果实各自的提取物或各自的组分(正己烷组分、乙酸乙酯组分、丁醇组分或水组分)或毛瑞香叶、茎、花或根各自的提取物或各自的组分，加到根据实施例〈3-1>培养的NK92培养基中，并且在37°C下培养18h，然后除去NK细胞以获得上清液。为了定量NK92细胞的培养基中存在的人IFN-Y，根据制造商的说明使用商用单克隆抗体(mAb) (Endogen)进行酶联免疫吸附试验。芫花提取物和二甲亚砜(DMSO)分别用于阳性对照(PC)和阴性对照(NC)。IFN-y的定量数值表示为三次重复分析的平均值土标准偏差。因此，对于油桐提取物或其组分，如表I和图I所示，以油桐叶、茎或果实的各甲醇提取物处理NK92细胞分泌约I. 7至2. 0ng/mL的IFN- y。当NK92以除水层以外的有机溶剂组分(正己烷组分、乙酸乙酯组分或丁醇组分)，油桐叶、茎或果实的提取物组分处理时，以正己烷组分处理的NK92细胞分泌大约I. 7至2. Ing/mL的IFN- y ;以乙酸乙酯组分处理的NK92细胞分泌大约I. 5至2. 0ng/mL的IFN- y ；以丁醇组分处理的NK92分泌大约
I.2至I. 7ng/mL的IFN- y。以油桐水组分处理的NK92细胞分泌大约0. 3至0. 4ng/mL的IFN- y，与油桐提取物或有机溶剂组分相比，其数量明显低，因此，油桐水组分有少许分泌IFN-y的能力。与阴性对照(0. 3ng/mL)相比较，所有以油桐提取物或其组分处理的NK92细胞分泌更大量的IFN-Y (表I和图I)。如图2所示，油桐叶、茎或果实的提取物的组分分泌IFN-Y的作用被证实(图2)。因此，结果表明油桐叶、茎或果实的提取物或其组分具有诱导NK细胞中IFN- y分泌的活性。同时，对于毛瑞香提取物或其组分，如表2和图3所示，以毛瑞香叶、茎、花或根的各甲醇提取物处理的NK92细胞分泌约2. 4至2. 6ng/mL的IFN- y。当NK92以除水层以外的有机溶剂组分(正己烷组分、乙酸乙酯组分或丁醇组分)，毛瑞香叶、茎、花或根的提取物组分处理时，以正己烷组分处理的NK92细胞分泌大约I. 7至I. 8ng/mL的IFN- Y ;以乙酸乙酯组分处理的NK92细胞分泌大约I. 4至I. 8ng/mL的IFN- y ；以丁醇组分处理的NK92分泌大约I. 6至I. 9ng/mL的IFN- y。以毛瑞香水组分处理的NK92细胞分泌大约0. 2至
0.4ng/mL的IFN- Y，因此，毛瑞香水组分有少许分泌IFN- y的能力。与阴性对照(0. 3ng/mL)相比较，所有以毛瑞香提取物或其组分处理的NK92细胞分泌更大量的IFN- Y (表2和图3)。如图4所示，毛瑞香叶、茎、花或根的提取物或组分分泌IFN-Y的作用被证实(图4)。因此，结果表明毛瑞香叶、茎、花或根的提取物或其组分具有诱导NK细胞中IFN-Y分泌的活性。表I
样品(2 (ig/mL)IFN-y 分泌物(ng/mL)--
丁醇组分_1.7__
水组分0.3
曱醇提取物2.0
正己烷组分1.7
油桐果实乙酸乙酯组分2.0
丁醇组分1.7
水组分0.3
兖花曱醇提取物(阳性对照)2.0_
DMSO 阴性对照0.3表权利要求
1.一种用于预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物。
2.根据权利要求I所述的药物组合物，其中所述油桐或毛瑞香提取物通过以水、C1至C2的低级醇或其混合物提取油桐或毛瑞香的干物质来制备。
3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述油桐的干物质是油桐的叶、茎或果实。
4.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述毛瑞香的干物质是毛瑞香的叶、茎、花或根。
5.根据权利要求2所述的药物组合物，其中所述低级醇是乙醇或甲醇。
6.一种用于预防或治疗病毒性疾病的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的有机溶剂组分，其中所述有机溶剂组分通过以有机溶剂进一步提取权利要求I所述的油桐或毛瑞香提取物来制备。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述有机溶剂为己烷、乙酸乙酯或丁醇。
8.根据权利要求I至6中任一项所述的药物组合物，其中，所述病毒性疾病包括受一种或多种选自以下的病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疹病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。
9.一种用于预防或缓解病毒性疾病的健康食品，该健康食品包括作为活性成分油桐或毛瑞香提取物或其组分。
10.根据权利要求9所述的健康食品，其中所述病毒性疾病包括受一种或多种选自以下的病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。
11.一种用于预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂，该饲料添加剂包括作为活性成分油桐或毛瑞香提取物或其组分。
12.根据权利要求11所述的饲料添加剂，其中所述病毒性疾病包括受一种或多种选自以下的病毒感染的疾病猪流行性感冒病毒(SIV)、流行性感冒病毒、A型流感病毒HlNl亚型、禽流感病毒、鼻病毒、腺病毒、冠状病毒、副流感病毒、呼吸道融合病毒、疱疫病毒(HSV)、人免疫缺陷病毒(HIV)和肝炎病毒。
13.一种用于缓解或治疗病毒性疾病的方法，该方法包括给患有病毒性疾病的个体施用药物组合物，其中所述药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分。
14.一种用于预防病毒性疾病的方法，该方法包括给个体施用药物组合物，其中所述药物组合物包括作为活性成分的药学有效量的油桐或毛瑞香提取物或其组分。
15.油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或治疗病毒性疾病的药物组合物的用途。
16.油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的健康食品的用途。
17.油桐或毛瑞香提取物或其组分用于制备用来预防或缓解病毒性疾病的饲料添加剂的用途。
全文摘要
本发明涉及包含作为活性成分的油桐或毛瑞香提取物或其组分的抗病毒组合物。具体地，油桐或毛瑞香的提取物或其组分能够诱导自然杀伤(NK)细胞中免疫相关细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)的分泌，并因而显示强效的抗病毒活性和对病毒性疾病优良的作用，并因此能够被有效用于抗病毒组合物中。
文档编号A61K36/83GK102762217SQ201080060577
公开日2012年10月31日 申请日期2010年11月3日 优先权日2009年11月3日
发明者吴世湸, 姜虎範, 安璄燮, 宋在成, 崔仁杓, 李炯圭, 金斗英, 金正姬, 金载和 申请人:韩国生命工学研究院