专利名称：洋地黄提取物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种洋地黄提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
洋地黄叶为玄参科植物紫花洋地黄(Digitalis purpurea L.)的干燥叶。目 前已从紫花洋地黄叶中分离出20余种强心甙，由三种不同的甙元洋地黄毒甙元 (digitoxigenin)、轻基洋地黄毒试元(gitoxigenin)禾口吉他洛试元(gitaloxigenin)与不 同的糖缩合而成。将从洋地黄中提取得到的有效成分应用于临床疾病治疗的历史悠久，例如洋地 黄毒苷用于治疗充血性心力衰竭已有近百年的历史。近年来，大量研究表明，洋地黄的某些 有效成分可以用来治疗眼部视疲劳。目前糖尿病视网膜病变是医疗领域的难题，临床上只 能采取一些辅助治疗手段，至今没有专门治疗的药品。
发明内容
本发明的目的是提供一种洋地黄提取物及其制备方法与应用。本发明提供了一种洋地黄提取物的制备方法，包括如下步骤(1)将洋地黄叶进行醇提，得到粗提液；(2)将步骤(1)的粗提液和酸乙醇混合，静置后过滤，得到滤液；所述粗提液和所 述酸乙醇的体积比为1 1 ；所述酸乙醇是乙醇和醋酸的水溶液，乙醇的含量为94%-95% (质量百分含量)，醋酸的含量为0.6%-0.7% (质量百分含量)；(3)将步骤(2)的滤液50-60°C、0. 08-0. 12MPa蒸发，得到提取液；(4)将步骤(3)的提取液与正丁醇混合，分层后弃正丁醇层，得到萃取液；(5)在步骤⑷的萃取液中加入4-6倍体积的水，经过截留分子量10K Da的超滤 柱超滤，得到粗滤液；将粗滤液经过截留分子量5K Da的超滤柱超滤，得到超滤液；(6)将步骤(5)的超滤液蒸干，得到洋地黄提取物。步骤(1)中，所述醇提可为将洋地黄叶用95% (质量百分含量)乙醇水溶液 75-85°C提取1. 5-2. 5小时；所述洋地黄叶和所述95%乙醇水溶液的配比为lg洋地黄叶 9-1 lmL 95%乙醇水溶液；所述醇提优选为将洋地黄叶粉末用所述95%乙醇水溶液80°C 提取2小时；所述洋地黄叶和所述95%乙醇水溶液的配比为lg洋地黄叶10mL 95%乙醇 水溶液。步骤(1)中，进行所述醇提后，可50°C，0.092MPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体积 的1/23-1/24，得到所述粗提液。所述步骤⑵中，可将步骤(1)的粗提液和酸乙醇混合，静置40分钟后过滤，得到 滤液；所述酸乙醇的制备方法为每100ml 95% (质量百分含量)乙醇水溶液中加入0.5ml 冰醋酸(冰乙酸)。所述步骤(3)中，可将步骤(2)的滤液55°C、0. IMPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体 积的51% -57%，得到提取液。
所述步骤(4)中，可将步骤(3)的提取液与正丁醇等体积混合。所述步骤(5)中，可在步骤(4)的萃取液中加入5倍体积的水。所述步骤(6)中，可将步骤(5)的超滤液60°C蒸干，得到洋地黄提取物。所述洋地黄可为紫花洋地黄。以上任一所述方法制备得到的洋地黄提取物也属于本发明的保护范围。本发明还保护一种眼用凝胶，是用如下原料制备得到的-.2. 7-3. 2质量份所述洋 地黄提取物、145-155质量份NaOH、480-520质量份卡波姆943、25_29质量份富马酸二甲酯 和49300-49350质量份水。所述眼用凝胶具体可为用如下原料制备得到的3质量份所述洋地黄提取物、150 质量份Na0H、500质量份卡波姆943、27质量份富马酸二甲酯和49320质量份水。所述眼用凝胶具体可为用如下方法制备的将所述洋地黄提取物用水溶解，过滤 后收集滤液；将所述NaOH、所述卡波姆943、所述富马酸二甲酯用水溶解，灭菌后得到无菌 基质；将所述滤液和所述无菌基质混合，加入水，得到洋地黄苷眼用凝胶。本发明还保护一种治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的药物，它的活性成分为以 上任一所述的眼用凝胶。本发明从紫花洋地黄中提取得到一种提取物，通过制剂技术将其生产成为眼用凝 胶制剂，可高效预防和治疗糖尿病视网膜病变。本发明提供的药物第一个专门用于预防和 治疗糖尿并视网膜病变的药品，改变了糖尿病视网膜病变的治疗现状。
图1为洋地黄提取物的色谱图。图2七叶洋地黄双苷滴眼液的色谱图。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。紫花洋地黄购于上海中药材公司；卡波姆943 购于北京会友化工有限公司；富 马酸二甲酯购于上海欧乐化工有限公司。糖尿病视网膜病变的评价标准如下(根据眼底改变，将糖尿病视网膜病变分为六 期)I (1)数。II (2)易数。III (3)
易数增殖型。IV (4)V (5)
4视网膜有微动脉瘤或并有小出血点；(+)极少量，易数；(++)较多，不易视网膜有黄白“硬性渗出”或并有出血斑；(+)极少量，易数；(++)较多，不视网膜有白色“软性渗出”或并有出血斑；(+)极少量，易数；(++)较多，不视网膜有新生血管和/或玻璃体出血。 视网膜有新生血管和纤维增殖
VI (6)视网膜有新生血管和纤维增殖并发现网膜脱离。其中，I、II、III期统称为单纯型视网膜病变，IV、V、VI期统称为增殖型视网膜病变。实施例1、洋地黄提取物的制备一、洋地黄提取物的制备1、醇提取紫花洋地黄叶300g粉碎，加入95%的乙醇水溶液3000ml，在80°C温度回流提 取2小时，过滤后得到粗提滤液。利用真空旋转蒸发仪将粗提滤液在50°C，0. 092MPa的条 件下减压除乙醇至无醇味，得到粗提液约128ml。2、沉淀向粗提液中加入等体积酸乙醇，混勻后静置40分钟，过滤，得滤液252ml ；酸乙 醇的配方每IOOml 95 %的乙醇水溶液中加入0. 5ml冰醋酸(含乙醇94. 3 %，冰醋酸 0. 65% )0利用真空旋转蒸发仪将滤液在55°C，0. IMPa的条件下减压除乙醇至无醇味，得到 提取液135ml。3、萃取向提取液中加入等体积正丁醇，保留水层、弃正丁醇层，得到萃取液约130ml。4、超滤向萃取液中加入650ml水，经过截留分子量IOK Da的超滤柱超滤，得到粗滤液；粗 滤液再经过截留分子量5K Da的超滤柱超滤，得到超滤液710ml左右。5、干燥超滤液60°C蒸干，得到70mg左右的洋地黄提取物。二、洋地黄提取物的色谱检测采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱(200mmX4. 6mm, 5 μ m)；以水-乙 腈为流动相(水与乙腈的体积比为18 1)；流速lml/min ；检测波长220nm。将Img洋地黄提取物用20ml水溶解，配成浓度为0. 05mg/ml的溶液，取10 μ 1进 样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图1。以德国视都灵药厂生产的七叶洋地黄 双苷滴眼液(批号081009)为供试品，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图2。由图1可知，洋地黄提取物在该色谱条件下，在保留时间10-30分钟之间，有峰面 积占总面积超过15%的6个色谱峰。洋地黄提取物和七叶洋地黄双苷滴眼液的图谱有明显 的差别，表明两者的主要成分明显不一致。实施例2、洋地黄苷眼用凝胶的生产1、称取实施例1制备的洋地黄提取物0. 3g，用IOOOml水溶解，溶液经过0.22um微 孔滤膜过滤，收集滤液；2、称取NaOH 15g、卡波姆(943) 50g、富马酸二甲酯2. 7g，用2000ml水溶解得基质； 121°C高压灭菌20min，得到无菌基质；3、将步骤1的滤液和步骤2的无菌基质混合，加水至5000g，混勻，得到洋地黄苷眼
用凝胶。将洋地黄苷眼用凝胶用铝管灌装，5g/支。上述步骤均在无菌条件下操作，所使用的器皿和铝管事先都进行无菌处理。
实施例3、洋地黄苷眼用凝胶用于预防糖尿病视网膜病变的疗效一、制作糖尿病大鼠模型将链脲佐菌素(STZ)以0. lmol/L，pH4.2的柠檬酸缓冲液溶解配制成2% (2g链脲 佐菌素溶于100毫升缓冲液)STZ溶液。SD大鼠60只(购于辽宁医学院实验动物中心)， 按65mg/kg体重尾静脉注射链脲佐菌素(注射过程中药物置于冰浴中)。注射后48h检测 尿糖和血糖，尿糖在+++以上，血糖高于16. 65m mol/L为糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠模 型，血糖、尿糖均保持在较高水平，并且随病程延长有所提高，同时均出现多饮、多食、多尿、 消瘦、活动减少等表现。二、洋地黄苷眼用凝胶用于预防糖尿病视网膜病变的疗效2周后，选择血糖值在350 550mg* dl的大鼠30只用于实验。实验动物喂养 于动物中心的标准化饲养房，并饲以标准颗粒饲料。饲养房条件室内通风良好，相对湿度 40% 70%，室温 18 22°C。将30只糖尿病大鼠随机分3组，每组10只。3组大鼠分别进行给药，具体如下第一组(空白对照组)滴加生理盐水，每日三次，每次一滴，滴入眼结膜囊内(近 耳侧外眼角)；第二组(阳性对照组)滴加七叶洋地黄双苷滴眼液(德国视都灵药厂生产，批号 081009)，每日三次，每次一滴，滴入眼结膜囊内(近耳侧外眼角)；第三组(治疗组)滴加实施例2制备的洋地黄苷眼用凝胶，每日三次，每次一滴， 滴入眼结膜囊内(近耳侧外眼角)。连续给药20周，然后检查视网膜，根据糖尿病视网膜病变的评价标准进行评价， 见表1。表1不同组大鼠的视网膜病变的评价结果
\^号 组别^\12345678910平均值第一组45655655455第二组23323223322. 5第三组10010112110.8空白对照组糖尿病视网膜病变非常严重，20%处于6期，60%处于5期，20%处于 4期。阳性对照组病程有所缓解，50%处于3期，50%处于2期。治疗组效果最好，10%处 于2期，60%处于1期，30%未见糖尿病视网膜病变。实验结果显示，本发明所得的洋地黄 苷眼用凝胶预防糖尿病视网膜病变疗效明显，而且明显好于德国视都灵药厂生产的七叶洋 地黄双苷滴眼液。实施例4、洋地黄苷眼用凝胶用于治疗糖尿病视网膜病变的疗效一、制作糖尿病大鼠模型同实施例1的步骤一。二、洋地黄苷眼用凝胶用于治疗糖尿病视网膜病变的疗效成模12周后观察大鼠的视网膜，选择视网膜病变处于4期且病变程度相近的大鼠30只用于实验。实验动物喂养于动物中心的标准化饲养房，并饲以标准颗粒饲料。室内通 风良好，相对湿度40 % 70 %，室温18 22 °C。将30只糖尿病大鼠随机分3组，每组10只。3组大鼠分别进行给药，具体如下第一组(空白对照组)滴加生理盐水，每日三次，每次一滴，滴入眼结膜囊内(近 耳侧外眼角)；第二组(阳性对照组)滴加七叶洋地黄双苷滴眼液(德国视都灵药厂生产，批号 081009)，每日三次，每次一滴，滴入眼结膜囊内(近耳侧外眼角)；第三组(治疗组)滴加实施例2制备的洋地黄苷眼用凝胶，每日三次，每次一滴， 滴入眼结膜囊内(近耳侧外眼角)。连续给药10周，然后检查视网膜，根据糖尿病视网膜病变的评价标准进行评价， 见表2。表2不同组大鼠的视网膜病变的评价结果 空白对照组60%处于6期，40%处于5期。阳性对照组10%处于4期，40%处于 2期，50%处于2期。治疗组20%处于2期，80%处于1期。实验结果显示，本发明所得的 洋地黄苷眼用凝胶治疗糖尿病视网膜病变疗效显著，而且明显好于德国视都灵药厂生产的 七叶洋地黄双苷滴眼液。
权利要求
一种洋地黄提取物的制备方法，包括如下步骤(1)将洋地黄叶进行醇提，得到粗提液；(2)将步骤(1)的粗提液和酸乙醇混合，静置后过滤，得到滤液；所述粗提液和所述酸乙醇的体积比为1∶1；所述酸乙醇是乙醇和醋酸的水溶液，乙醇的含量为94％-95％(质量百分含量)，醋酸的含量为0.6％-0.7％(质量百分含量)；(3)将步骤(2)的滤液50-60℃、0.08-0.12MPa蒸发，得到提取液；(4)将步骤(3)的提取液与正丁醇混合，分层后弃正丁醇层，得到萃取液；(5)在步骤(4)的萃取液中加入4-6倍体积的水，经过截留分子量10K Da的超滤柱超滤，得到粗滤液；将粗滤液经过截留分子量5K Da的超滤柱超滤，得到超滤液；(6)将步骤(5)的超滤液蒸干，得到洋地黄提取物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中，所述醇提为将洋地黄叶用 95% (质量百分含量)乙醇水溶液75-85°C提取1. 5-2. 5小时；所述洋地黄叶和所述95% 乙醇水溶液的配比为lg洋地黄叶9-llmL 95%乙醇水溶液；所述醇提优选为将洋地黄叶 粉末用所述95%乙醇水溶液80°C提取2小时；所述洋地黄叶和所述95%乙醇水溶液的配 比为lg洋地黄叶10mL 95%乙醇水溶液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于步骤(1)中，进行所述醇提后，50°C、 0. 092MPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体积的1/23-1/24，得到所述粗提液。
4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，将步骤(1)的 粗提液和酸乙醇混合，静置40分钟后过滤，得到滤液；所述酸乙醇的制备方法为每100ml 95% (质量百分含量)乙醇水溶液中加入0. 5ml冰醋酸。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述步骤(3)中，将步骤⑵ 的滤液55°C、0. IMPa蒸发，蒸发后体积为蒸发前体积的51% _57%，得到提取液；所述步骤 ⑷中，将步骤⑶的提取液与正丁醇等体积混合；所述步骤(5)中，在步骤⑷的萃取液中 加入5倍体积的水；所述步骤(6)中，将步骤(5)的超滤液60°C蒸干，得到洋地黄提取物； 所述洋地黄为紫花洋地黄。
6.权利要求1至5中任一所述方法制备得到的洋地黄提取物。
7.—种眼用凝胶，是用如下原料制备得到的2. 7-3. 2质量份权利要求6所述洋地黄 提取物、145-155质量份Na0H、480-520质量份卡波姆943、25_29质量份富马酸二甲酯和 49300-49350质量份水。
8.如权利要求7所述的眼用凝胶，其特征在于是用如下原料制备得到的3质量份权 利要求6所述洋地黄提取物、150质量份Na0H、500质量份卡波姆943、27质量份富马酸二甲 酯和49320质量份水。
9.如权利要求7或8所述的眼用凝胶，其特征在于是用如下方法制备的将所述洋地 黄提取物用水溶解，过滤后收集滤液；将所述NaOH、所述卡波姆943、所述富马酸二甲酯用 水溶解，灭菌后得到无菌基质；将所述滤液和所述无菌基质混合，加入水，得到洋地黄苷眼 用凝胶。
10.一种治疗和/或预防糖尿病视网膜病变的药物，它的活性成分为权利要求7至9中 任一所述的眼用凝胶。
全文摘要
本发明公开了一种洋地黄提取物及其制备方法与应用。本发明提供了一种洋地黄提取物的制备方法，包括如下步骤(1)将洋地黄叶进行醇提，得到粗提液；(2)将粗提液和酸乙醇混合，静置后过滤，得到滤液；(3)将滤液蒸发，得到提取液；(4)将提取液与正丁醇混合，分层后弃正丁醇层，得到萃取液；(5)将萃取液经过截留分子量10K Da和5K Da的超滤柱超滤，得到超滤液；(6)将超滤液蒸干，得到洋地黄提取物。本发明还保护所述方法制备得到的洋地黄提取物以及用所述洋地黄提取物制备的眼用凝胶。所述眼用凝胶，可高效预防和治疗糖尿病视网膜病变。本发明提供的药物是第一个专门用于预防和治疗糖尿并视网膜病变的药品，改变了糖尿病视网膜病变的治疗现状，具有重大的经济前景和社会意义。
文档编号A61K9/00GK101874848SQ200910242110
公开日2010年11月3日 申请日期2009年12月8日 优先权日2009年12月8日
发明者于洪儒 申请人:于洪儒