连翘酯苷i的应用及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物用途领域，具体涉及植物提取物的应用和制备。
【背景技术】
[0002] 连翘酯苷是从木犀科连翘属植物连翘中提取的有效成分，连翘酯苷具有抗微生 物、抗病毒、抗氧化等药理作用。之前的研究发现连翘酯苷中几乎全是连翘酯苷A在起作 用，但连翘酯苷A很难单独稳定存在，因此习惯上，常把含有连翘酯苷A的连翘酯苷类有效 成分称作连翘酯苷。连翘酯苷A的分子式为C29H36015，结构式如下：
[0003] 连翘酯苷I为棕色无定型粉末，高分辨质谱显示连翘酯苷I分子式为C29H 36015，与 连翘酯苷A的分子式相同，并且其IR、IDNMR和MS谱与连翘酯苷A也十分相似，显示连翘酯 苷I与连翘酯苷A是同分异构体，不同之处主要表现在咖啡酰基与葡萄糖基的连接位置不 同。结构式如下：
连翘酯苷A、连翘酯苷I在水溶液、光照、加热情况下都会发生转化，在甲醇溶液中会缓 慢转化，在纯乙酸乙酯溶液中较稳定。
[0004] 正是因为连翘酯苷I的不稳定，在制备或加工过程中容易发生转化，因此连翘酯 苷I制备和保存比较困难，目前对于连翘酯苷I的研究还不多，因为对连翘酯苷I的具体抗 菌活性还不了解。
【发明内容】
[0005] 本发明目的是提供一种连翘酯苷I的应用及其制备方法。
[0006] 所述连翘酯苷I在制备抑制合胞病毒药物中的应用。
[0007] 为了实现上述技术方案将连翘酯苷I制成片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂。
[0008] 连翘酯苷I的用量为每天22. 5-90mg/kg。
[0009] -种连翘酯苷I的制备方法，是由以下步骤制成的： (1)、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液； (2 )、纯化：将步骤（1)所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步 纯化，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集20%乙醇洗脱液； (3) 、去杂质：取步骤（2)所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无 水乙醇溶剂系统进行洗脱，得到各流份，取流份5-7 ; (4) 、液相色谱单体分离：对步骤（3)所得的流份5-7进行分离，得到目标化合物单体溶 液。
[0010] 作为优选，所述连翘酯苷I是由以下步骤制成的： (1)、提取：取连翘叶，加10倍量水提取3次，每次1小时，得到连翘叶水提液； (2 )、纯化：将步骤（1)所得连翘叶水提液通过大孔树脂AB-8对连翘酯苷成分进行初步 纯化，树脂与药材量比为1:〇.8，上样速率为川￥/11，依次以水、20%、40%乙醇梯度洗脱，收集 20%乙醇洗脱液； (3) 、去杂质：取步骤（2)所得20%乙醇洗脱部位，采用硅胶柱去杂质，用乙酸乙酯和无 水乙醇溶剂系统进行洗脱，以连翘酯苷I的含量计算，上样量与硅胶用量为1:150,以乙酸 乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液为1个流份，得到10个流份，收集流份 5-7 ； (4) 、液相色谱单体分离：对步骤（3)所得的流份5-7进行分离，流动相为甲醇：水 =40:60，检测波长33〇11111，流速12〇1]117111；[11，进样量：2 1]11^得到目标化合物单体溶液。 [0011] 为了选择更佳的制备工艺，做了以下工艺研究： 一、提取工艺研究： 1、连翘叶中连翘酯苷I、A含量测定： 采用《中华人民共和国药典》2010年版一部"连翘"项下含量测定方法对连翘叶中连翘 酯苷I、A进行含量测定，测定结果见表1，图谱见图1、2、3。
[0012] 结果表明，连翘叶中连翘酯苷I和连翘酯苷A的含量分别为0. 15%和2. 11%，其中 连翘酯苷A含量远高于药典中规定的连翘果实含量（0. 25%)。
[0013] 2、连翘叶提取溶剂考察： 采用水、30%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇对连翘叶提取溶剂进行考察。 结果发现：水提取液中连翘酯苷A转化为连翘酯苷I和另一连翘酯苷类物质(命名为连翘酯 苷H)，所以连翘酯苷I的含量最高。30%乙醇提取液中连翘酯苷A略有转化，50%、60%、70%、 80%乙醇提取液中连翘酯苷A转化均不明显。结论：以连翘酯苷I提取率为指标，优选水提 取。
[0014] 3、连翘叶提取正交试验： 以连翘酯苷I提取率为指标，采用4因素3水平正交试验法，考察提取时的溶剂用量、 提取时间和提取次数。根据正交试验及验证试验结果得到最优工艺参数为：1〇倍量水提取 3次，每次1小时。
[0015] 4、连翘叶提取放大试验： 根据正交实验选择的工艺对连翘叶进行提取：连翘叶约500 g用水提取，溶媒用量为 10倍，回流提取3次，每次1 h。经提取，提取液中连翘酯苷I和连翘酯苷A的含量分别为 0. 71%和0. 94%，提取率分别为48. 05%和44. 52%。经计算，提取液中含连翘酯苷I 3. 68 g， 连翘酯苷A 4.87 g。提取液图谱见图4。
[0016] _、大孔树脂畐集工艺： 连翘酯苷成分的初步纯化多采用大孔树脂，其中AB-8大孔树脂的吸附率及解析率均 最高，前期预试验也证明AB-8大孔树脂分离连翘酯苷效果好。
[0017] 连翘叶水提液直接过AB-8大孔树脂柱，树脂与药材量比为1:0. 8(g/g)，上样速率 为lBV/h，考察不同浓度乙醇的洗脱率，洗脱速率lBV/h，收集不同洗脱部分：水洗液部分、 20%乙醇洗脱部分、40%乙醇洗脱部分。各洗脱部分连翘酯苷I、A含量、洗脱率见表2,图谱 见图5、6。
[0018] 由表2可知，20%乙醇洗脱基本上能将大部分目标化合物洗脱出来。因此，后续工 艺暂以20%洗脱部分进行化合物分离。由图6可知经大孔树脂初步纯化后，样品中仍有许 多杂质，连翘酯苷I和连翘酯苷A的纯度还很低，分别为16%和30%，因此需要再经过硅胶柱 分离除去杂质。
[0019] 三、硅胶柱分离工艺： 硅胶柱分离连翘酯苷成分多用乙酸乙酯和甲醇系统。为降低毒性，我们采用乙酸乙酯 和无水乙醇溶剂系统进行洗脱。
[0020] 连翘酯苷20%乙醇洗脱部位采用硅胶柱色谱分离，以连翘酯苷I的含量计算，上样 量与硅胶用量为1:150 (g/g)。以乙酸乙酯为流动相洗脱10倍柱体积，一倍柱体积洗脱液 为1个流份，经过高效液相色谱检测各流份的纯度，收集只含有连翘酯苷I和连翘酯苷A两 种成分的流份。结果表明流份5-7符合要求，编号为样品1、2、3,三个样品中两个峰总含量 均在80-90%。样品1、2、3的连翘酯苷I、A含量见表3,图谱见图7-9。
[0021] 四、制备液相分离： 采用汉邦制备液相色谱对硅胶柱分离到的样品1、2、3进行单体分离。经过色谱条件摸 索，最终确定色谱条件如下：流动相为甲醇：水=40:60,检测波长330 nm，流速120 mL/min， 进样量：2 mL。制备过程采取套针循环进样，如图10所示： 经制备可得到连翘酯苷I和连翘酯苷A的单体溶液。
[0022] 为了研究连翘酯苷I的抗病毒作用，作了如下研究： 第一部分 一、研究内容 评价药物体外安全性 测试连翘的2个样品（A为纯度90%的连翘酯苷I，B为纯度90%的连翘酯苷I、连翘酯 苷A、连翘酯苷Η的混合物，下面的样品A、B均同）。以MTT法评价受试样品体外对细胞的 毒性，确定药物的安全浓度范围。采用Reed-Muench法计算药物半数细胞毒性浓度（TC5。）。
[0023] 确认药物体外抗多种呼吸道病毒的活性 以多种呼吸道病毒作为研究对象(具体病毒种类见表4,均为呼吸疾病国家重点实验室 保存的标准毒株，或已作鉴定分型的临床分离株)，按照病毒类别进行分组筛选，评价送试 样品对呼吸道病毒的抑制作用，用Reed-Muench法计算半数抑制浓度（IC5。)。
[0024] 经广谱筛选有效的抗病毒药物，进一步明确体外抗病毒环节和特点 利用直接、治疗及预防3种策略，以及单个感染复制周期模型，以细胞病变法，评价对 经体外药效筛选有效毒株的抑制作用环节(吸附，脱壳或核释放等)。
[0025] 第二部分实际完成情况 第一节连翘抗病毒活性的筛选 一、材料与方法 1、实验