连翘苷对脓毒症大鼠的治疗作用
【专利摘要】本发明涉及脓毒症的治疗领域，具体是一种能降低大鼠的死亡率，并相对延长生存时间的药物。目前研究发现，连翘提取物有摧毁细菌内毒素，对各种革兰阳性及阴性细菌有抑制作用，但因作用机制尚未完全阐述清楚，影响了其向国际市场的推广。本发明通过运用硅胶柱层析、Saphadex LH?20柱层析、重结晶等方法从50％连翘乙醇提取物中分离获得物质；采用化学鉴别、核磁共振氢谱、核磁共振碳谱、薄层色谱、高效液相色谱等方法对物质进行结构鉴定，确定其结构和名称。通过复制大鼠盲肠结扎穿孔动物模型，模拟人类脓毒症病理过程。尾静脉注射给药，观察术后各大鼠术后存活率。本发明主要用于以连翘苷为主要成分，制备成注射剂用于脓毒症的治疗。
【专利说明】
连翘苷对脓毒症大鼠的治疗作用
技术领域
[0001]本发明涉及脓毒症的治疗领域，具体是一种能降低大鼠的死亡率，并相对延长生存时间的药物。
【背景技术】
[0002]脓毒症(Sepsis)是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是机体对感染的一种全身性炎症反应(SIRS)，是严重感染、重度创伤、大手术后、重型急性胰腺炎和休克等常见的并发症，进一步发展可导致感染性休克、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)和多器官功能障碍综合征(MODS)，其发病机制复杂，对机体组织器官损伤大、治疗难，已经成为世界性攻关难题。国外流行病学调查显示，脓毒症的病死率已超过急性心肌梗死，每年欧洲和美国死于此病超过35万人，每年全球有超过1800万严重脓毒症病例，且患者数目每年以
1.5 %速度递增。每年脓毒症病人超过300万人，因此造成多脏衰的死亡人数高达50万人以上。脓毒症来势凶猛，病情进展迅速，病死率高，给临床救治带来极大困难，已成为现代创、烧伤外科及危重病医学面临的突出难题。
[0003]近年来，国内关于脓毒症的治疗的有关研究报道主要有，四川医学杂志2011年12月第12期和创伤与急危重病医学2014年I月第I期上分别刊载了 “脓毒症及其治疗研究进展”和“脓毒症和感染性休克治疗进展”的研究文章。文章中提出脓毒症的主要治疗方案为:1.扩容疗法，在颈静脉或锁骨下中央静脉内插管(CVC)，以便快速补液进行液体恢复；
2.早期正确的抗生素应用，要早期静脉给予广谱抗生素；3.激素的应用，应用氢化可的松扭转休克症状，降低病死率；4.器官支持治疗，如急性肾损伤时要适当补液和保持适当血管内容量、维持适当的灌注压、避免使用肾毒性药物。而急性肺损伤和急性呼吸窘迫综合症时应用机械通气进行生命支持。
[0004]脓毒症发病机制极其复杂，确切机制仍不十分明确，并涉及局部和全身性反应的复杂病理过程，以上疗法可以对治疗脓毒症有一定的疗效，但其有效特异性不强。我国临床上使用中药治疗脓毒症有着长期的用药经验，如王今达教授就提出了脓毒症治疗的“三证三法”，即热证用清热解毒法，瘀证用活血化瘀法，虚证用扶正固本法；与“菌毒炎并治”细菌-内毒素-炎性介质同时治疗的方法，将脓毒症患者的死亡率降低了 50%，并开发出针对“瘀证”的中药注射用剂“血必净”；除活血化瘀法外，还有用清热解毒方下调肠道水通道蛋白治疗脓毒症的研究，研究说明清热解毒方可通过对结肠水通道蛋白的抑制作用而产生泻下效应治疗脓毒症。目前在大量的临床观察及前期动物实验研究中发现，中药连翘对脓毒症的防治疗效甚佳，同时连翘也是历代温病学家手中的利器，研究工作研究中也发现，连翘提取物对各种革兰阳性及阴性细菌有抑制作用。同时体外实验发现连翘提取物有很强的摧毁细菌内毒素作用，但是因为中药成分复杂，作用机制尚未完全阐述清楚，影响了其向国际市场的推广。因此，从中医中药角度出发，应用现代药理研究方法对中药进行研究，阐明其对脓毒症的作用机制，将会是脓毒症治疗进展的新的突破点。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于阐明连翘对脓毒症治疗的物质基础及作用机理。
[0006]本发明是采用如下技术方案实现的:
[0007]连翘通过50%乙醇大孔树脂洗脱液，减压浓缩，回收乙醇，得到洗脱液浸膏354.39g，备用。
[0008]取少量50%乙醇洗脱部位浸膏，无水乙醇溶解，作为样品，用于点样。将样品、对照药材和连翘苷在硅胶G板上点样，展开剂分别用氯仿-甲醇、乙酸乙酯-甲醇、乙酸乙酯-乙醇、二氯甲烷-甲醇。每种展开剂按不同的比例配置展开，结果氯仿-甲醇系统分离间隔好，不拖尾，分离点最多且Rf值合适，是合适的溶剂系统。选择氯仿-甲醇作为50%乙醇洗脱部位粗分洗脱剂，在该体系中展开，分别用5%香草醛浓硫酸、10%硫酸-乙醇、三氯化铝试剂显色，结果表明5%香草醛浓硫酸显色明显，选择5%香草醛浓硫酸作为显色剂。用氯仿-甲醇不同比例为展开剂时，可看出不同比例出斑点数量不同，在10: I左右出点较集中，故采用梯度洗脱时在10: I左右的梯度变换要缓和。
[0009]采用干法上样，将得到的洗脱液浸膏350g加无水乙醇超声溶解，用350g硅胶(60-100目)拌样(I: I拌样)，在通风橱中挥干溶剂，研磨均匀，即得。
[0010]取硅胶(160-200目)约3000g(l: 8左右)，预先用氯仿浸泡过夜，湿法装柱(柱高78cm，柱径Ilcm)。先用氯仿平衡柱体至液面不再下降，然后将上述样品缓缓地装入硅胶柱，边装边敲打使样品均匀平整的铺在硅胶上。首先用氯仿洗脱，然后逐渐加入甲醇(0-50% )变换梯度进行洗脱。当溶剂色带接近柱底时，开始接收洗脱液，每100ml收集浓缩，薄层色谱对流分实时检测决定洗脱剂比例的更换。依次为氯仿(12500ml)、三氯甲烷:甲醇=50: I (15000ml),20: I (18000ml)、15: I (22000ml)、10: I (13000ml)、
8: I (17000ml)、6: I (21000ml)、5: I (15000ml)、2: I (12000ml)梯度洗脱，经薄层检测合并相同流分，得到9个极性段，从以下3个部分1-1II，三氯甲烷:甲醇(I = 15: K II=10: UIII = 8: I)分离出4个化合物。分离过程见图8。
[0011]从I部分氯仿:甲醇(15: I)洗脱得到组分Fr.1，将Fr.1浓缩，用热乙醇溶解后放置，析出大量白色针状结晶LQ-1 (2g);从II部分氯仿:甲醇(10: I)洗脱得到组分Fr.2，经200-300目硅胶，氯仿:甲醇(4: 1-0: I)梯度洗脱，再经反相柱色谱20%-50%甲醇逐级洗脱，得棕黄色粉末LQ-3(0.6g);从III部分氯仿:甲醇(8: I)洗脱得到组分Fr.3，经200-300目硅胶，乙酸乙酯:甲醇(7: 1-5: I)梯度洗脱、S^hadex LH-20凝胶柱纯化得化合物LQ-2(0.1g)和LQ-4(0.1g)，均为黄色粉末。
[0012]在通过运用娃胶柱层析、Saphadex LH-20柱层析、重结晶等方法从50%连翅乙醇提取物中分离获得的白色针状结晶；采用化学鉴别、核磁共振氢谱(IH-NMR)、核磁共振碳谱(13C-NMR)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)等光谱色谱方法对所分离出的白色针状结晶进行结构鉴定，确定化合物的结构和名称。首先采用化学方法对化合物进行鉴别，确定基本骨架后结合氢谱、碳谱进行数据比对归属，再用TLC、HPLC进一步进行验证。由鉴定的化合物可得出，分离出的白色针状结晶化合物为一个木脂素类(连翘苷)。其化学结构式见图9:
[0013]通过复制大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)动物模型，来模拟人类感染引起一系列病理生理反应的自然过程。大鼠购来后适应性喂养I周，称重，编号，将90只SD大鼠按随机数字表法分为3组:模型组(η = 30)、假手术组(η = 30)、给药组(η = 30)，模型组采用CLP复制脓毒症模型，假手术组除不进行盲肠结扎及穿孔外其余同模型组，给药组CLP复制脓毒症模型，术后待大鼠清醒后，尾静脉注射给药，一天两次，间隔约12小时，连续6天，模型组及假手术组给予等量的生理盐水。观察术后各组大鼠术后24h、48h及一周存活率。大鼠手术后，给药后及处死后腹腔状态见图1-6，连翘苷提取物见图7
[0014]使用结果:本发明所述的连翘苷具有显著降低脓毒症大鼠死亡率的效果。
【附图说明】
[0015]图1是发明实验中假手组术大鼠:大鼠正常进食饮水，自由活动，呼吸平稳，体重增加，皮毛有光泽。
[0016]图2是模型组:多数术后苏醒延迟，苏醒后进食饮水减少，竖毛、寒战、不活动、嗜睡、呼吸急促、眼角渗出物等，体重减轻明显，多数出现腹泻，部分甚至出现脓便、脓尿；随着病程进展，症状逐渐加重，濒死前表现精神萎靡、对被动仰卧无反抗、四肢颤抖、皮毛无光泽。
[0017]图3是给药组大鼠:大鼠精神相对萎靡，眼睑、鼻部分沁物增多，毛松散，弓背，懒动，部分大鼠腹大，腹部存在包块，饮食减少，皮毛失去光泽，呼吸困难，皮下出血，对被动仰卧无反抗，感觉迟钝，腹泻，便稀，体温偏低，体重下降，濒死前部分动物出现轻度皮下出血，呼吸窘迫，四肢肌张力增高，颈项强直。
[0018]图4为假术组处死时，尸解见腹腔内无明显渗液，盲肠无肿胀、粘连，肝肾无充血，肺粉红色，质地均匀，72h生存率为100%。
[0019]图5为模型组处死时，尸解见大鼠腹内肠体粗胀，色灰白或暗黄，轻度粘连与黄稠积液存在，或腹内积液不显，腹内散在白色斑点，肝脏色暗红，脾脏大，盲肠部粘连或包块状，与腹壁粘连，分离困难。
[0020]图6为给药组处死时，腹腔内可散在白色斑块状物，肠体偏细或轻度粗大，色灰白，积液不显，肝脏色红，脾脏大，盲肠部包块，分离因难。
[0021 ] 图7是连翘提取物连翘苷。
[0022]图8为连翘苷结构分子式。
[0023]图9为50 %乙醇大孔树脂洗脱物分离流程图。
【具体实施方式】
[0024]脓毒症大鼠模型制备
[0025]采用大鼠盲肠结扎穿孔(CLP)模型，术前12h禁食，不禁水，5%水合氯醛麻醉(350-400mg/kg)腹腔麻醉，前腹正中备皮，消毒腹部皮肤，于腹部正中做2.5cm切口，取出盲肠后，游离肠系膜和盲肠，距盲、回肠结合部约盲肠全长1/3处，4号手术缝线尽量回避血管结扎，于距结扎处远端约0.8-lcm处回避血管,三棱针(2.6 X 65mm)贯穿孔,3 X 30mm胶条贯穿盲肠留滞，放回腹腔，缝合切口。术后颈部皮下补液10mL，补充术中液体流失，抗休克。假手术组大鼠麻醉、开腹后只做盲肠翻动，不做结扎及穿孔，其余同模型组；对照组大鼠不予手术处理。给药组同模型组。
[0026]动物的分组及给药
[0027]大鼠购来后适应性喂养I周，称重，编号，按随机数字表法分为3组:模型组(η =30)、假手术组(η = 30)、给药组(η = 30)，模型组采用CLP复制脓毒症模型，假手术组除不进行盲肠结扎及穿孔外其余同模型组，给药组CLP复制脓毒症模型，术后待大鼠清醒后，尾静脉注射给药，一天两次，间隔约12小时，连续6天，模型组及假手术组给予等量的生理盐水。观察术后各组大鼠一般状况，连翘提取物连翘苷对脓毒症大鼠术后24h、48h及一周存活率的影响。
[0028]给药剂量
[0029]连翘用药量(生药)为6_15g/d (中国药典2010版)，取均值10g/d。实验动物给药剂量折算公式方法(见附录一)，计算得大鼠用药量为lg/kg.d，单体的给药剂量定位3mg/kg。
[0030]观察指标及检测方法
[0031]分别观察各组大鼠造模前后体重、精神状态、活动情况、肛温、呼吸、剖腹时腹腔情况、脏器大体情况等。
【主权项】
1.连翘苷在制备抗脓毒症药物中的用途。2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的连翘苷是指用各种方法从连翘属科植物提取的，纯度在90 %以上的单体。3.根据权利要求1或2所述的药物，其特征在于，以连翘苷为有效成分配以辅料，按药学上的规定制备方法制成注射剂。4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述注射剂注射液。
【文档编号】A61P31/04GK105878262SQ201410457545
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月10日
【发明人】李志军
【申请人】李志军