科罗索酸的医药用图
【专利摘要】本发明涉及医药学领域，特别是涉及一种科罗索酸的医药用途。本发明的科罗索酸可用于制备防治肺癌的药物和保健品。
【专利说明】
科罗索酸的医药用途
技术领域
[0001] 本发明设及医药保健品领域，特别是设及一种科罗索酸的医药用途。
【背景技术】
[0002] 肿瘤干细胞(cancer stem cell,CSC)是肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质 性肿瘤细胞的细胞，在肿瘤组织中比例约在0.1-2%之间。CSC的概念于2001年提出，至今已 在多种组织中得到证实，包括白血病、肺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤等。
[0003] 肿瘤干细胞与成体干细胞相似，具有分化和自我复制能力。它与成体干细胞的分 化和自我复制不同之处在于，肿瘤干细胞的自我复制能力是一种不受限的自我生长。
[0004] 肿瘤干细胞能够不断地进行自我更新、分化，表现为具有很强的致瘤性，仅需少量 肿瘤干细胞即可形成肿瘤，而一般肿瘤细胞需要大量细胞才能形成肿瘤。肿瘤干细胞形成 肿瘤的能力是其他肿瘤细胞的百倍W上。运是肿瘤干细胞区别于普通肿瘤细胞的特点之 〇
[0005] 放化疗药物为临床肿瘤治疗的常用手段。但是传统放化疗治疗只能杀死肿瘤细 胞，而对肿瘤干细胞则没有明显地抑制作用，并且在一定程度上还会富集肿瘤干细胞。运是 导致患者在放化疗后，易出现肿瘤复发的主要原因。基于W上因素，抑制肿瘤干细胞增殖的 药物研发才是肿瘤药物开发的重点和难点。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的旨在提供一种科罗索酸的新的医药用途。
[0007] 具体地说，本发明的第一方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物 或前药在制备预防或治疗人肺支气管癌化650的药物或保健品中的应用。
[000引本发明的第二方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制 备预防或治疗人大细胞肺癌H460的药物或保健品中的应用。
[0009] 本发明的第Ξ方面是提供了科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制 备抑制肺癌肿瘤干细胞增殖的药物或保健品中的应用。
[0010] 在一优选例中，所述肺癌肿瘤干细胞为非小细胞肺癌H1650肿瘤干细胞。
[0011] 本发明各个方面的细节将在随后的章节中得W详尽描述。通过下文W及权利要求 的描述，本发明的特点、目的和优势将更为明显。
【附图说明】
[0012] 图1是科罗索酸对非小细胞肺癌各种病理类型细胞增殖48小时的影响（图la:人肺 支气管癌细胞H1650 ;图lb:肺腺癌细胞SPC-A-1;图Ic:肺腺癌A549;图Id:人大细胞肺癌 H460);
[0013] 图2是科罗索酸对非小细胞肺癌化650克隆形成的影响；
[0014] 图3是科罗索酸对化650肿瘤干细胞球体形成的影响；
[0015] 图4是科罗索酸对非小细胞肺癌化650中TGF/Smad信号通路核移位的影响。
【具体实施方式】
[0016] 本发明人通过实验研究，意外地发现科罗索酸能够显著性地抑制非小细胞肺癌的 增殖W及抑制非小细胞肺癌肿瘤干细胞的增殖。故而，该化合物可用于制备预防或治疗非 小细胞肺癌的药物或保健品。
[0017] 如本领域的技术人员所知，本发明的科罗索酸(Corosolic acid),又名化-径基熊 果酸（2-alpha-hyh(Myursolic acid)，其具有如下结构通式：
[001 引
[0019]分子式：〔3地48〇4，分子量：472.71
[0020] 本发明还包括上述化合物的相应的所有药学上可W接受的盐、水合物或前药。运 些盐可W由化合物中带正电荷的部分(例如，胺基)与具有相反电性的带负电荷(例如，Ξ氣 醋酸)形成;或者由化合物中带负电荷的部分(例如，簇基)与正电荷(例如，钢、钟、巧、儀)形 成。化合物可W含有一个非芳香性的双键，具有一个或多个不对称中屯、。所W，运些化合物 可W作为外消旋的混合物、单独的对映异构体、单独的非对映异构体、非对映异构体混合 物、顺式或反式异构体存在。所有运些异构体都是可预期的。所述的"科罗索酸的前药"通常 指一种物质，当用适当的方法施用后，可在受试者体内进行代谢或化学反应而转变成科罗 索酸或其盐。
[0021] 本发明的科罗索酸可通过本领域的常规方法从大花紫薇中提取获得，或者利用市 售原料，通过现有技术中传统的化合物合成方法合成获得。本领域的普通技术人员根据现 有公知技术可W合成本发明的化合物。合成的化合物可W进一步通过柱色谱法、高效液相 色谱法或结晶等方式进一步纯化。
[0022] 合成化学改造、保护官能团方法学(保护或去保护)对合成应用化合物是很有帮助 的，并且是现有技术中公知的技术，如R.Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers(1989)；T.W.Greene and P.G.M.Wuts.Protective Groups in Organic Synthesis ,Ed., John Wiley and Sons(1999)；L.Fieser and M.Fieser,Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1994)；and L.Paquette,ed..Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis, John Wiley and Sons(1995)中都有公开。
[0023] 本发明的科罗索酸可W单独使用或W药物组合物的形式使用。药物组合物包括作 为活性成分的本发明的科罗索酸及可药用载体。较佳地，本发明的药物组合物含有0.1~ 99.9%重量百分比的作为活性成分的本发明的科罗索酸。"可药用载体"不会破坏本发明的 科罗索酸的药学活性，同时其有效用量，即能发挥药物载体作用时的用量对人体无毒。
[0024] 所述可药用载体包括但不限于:软憐脂、硬脂酸侣、氧化侣、离子交换材料、自乳化 药物传递系统、吐溫或其他表面活化剂、血清蛋白、缓冲物质如憐酸盐、氨基乙酸、山梨酸、 水、盐、电解质如硫酸盐精蛋白、憐酸氨二钢、憐酸氨钟、氯化钢、锋盐、娃酸儀、饱和脂肪酸 部分甘油醋混合物等。
[0025] 其他常用的药物辅料如粘合剂（如微晶纤维素）、填充剂(如淀粉、葡萄糖、无水乳 糖和乳糖珠粒）、崩解剂(如交联PVP、交联簇甲基淀粉钢、交联簇甲基纤维素钢、低取代径丙 基纤维素）、润滑剂(如硬脂酸儀）W及吸收促进剂、吸附载体、香味剂、甜味剂、赋形剂、稀释 剂、润湿剂等。
[0026] 本发明的科罗索酸W及其药物组合物可按本领域常规方法制备并可W通过肠道 或非肠道或局部途径给药。口服制剂包括胶囊剂、片剂、口服液、颗粒剂、丸剂、散剂、丹剂、 膏剂等;非肠道给药制剂包括注射液等；局部给药制剂包括霜剂、贴剂、软膏剂、喷雾剂等。 优选为口服制剂。
[0027] 本发明的科罗索酸W及其药物组合物的给药途径可W为口服、舌下、经肌肉或皮 下、静脉、尿道、阴道等。
[0028] 本发明的科罗索酸可W保健品的形式使用。所述保健品包括有效量的本发明的科 罗索酸及其他保健品领域常规的添加剂，例如增溶和改善口昧的物质，如增加甜味的甜味 剂;抗氧化的抗氧化剂;做成各种剂型所需的药学上允许的载体、赋形剂等。含有本发明的 科罗索酸的保健品可W被制成各种形式，例如饮料、颗粒剂、片剂、胶囊等形式，W便于服 用。
[0029] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，运些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按 重量计。
[0030] 除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意 义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中 所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
[0031] 本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可W任意组合。本专利说明书所掲 示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所掲示的各个特征，可W任何可提供相 同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所掲示的特征仅为均等或相似 特征的一般性例子。
[0032] 实施例1科罗索酸对非小细胞肺癌增殖的抑制作用
[0033] 选择4种非小细胞肺癌细胞株(肺细支气管肺泡癌H1650,人大细胞肺癌细胞H460， 肺腺癌细胞SPC-A-1，人肺腺癌细胞A549)对科罗索酸的体外抗肿瘤活性进行测试，使用含 10%胎牛血清的DMM培养基(含lOOU/ml青霉素，100μg/ml链霉素），37°(：、5%0)2条件下过 夜培养，每周传代两次。采用Μ?Τ法检测科罗索酸对细胞增殖的影响。
[0034] 实验方法(MTT法）：收集对数生长期细胞，用含0.05%抓TA的0.25 %膜酶消化，重 悬并计数。W每孔5X103个细胞接种于96孔细胞培养板。培养24小时后吸取上清液，加入含 不同浓度科罗索酸(μΜ/L)的培养液2(Κ)化继续培养48小时。每孔加入MTT溶液(5mg/ml)20y L，置于细胞培养箱37 °C继续培养4小时，弃去上清，每孔加入DMS0 15化L，室溫混匀10分钟， 用酶标仪在570nm下检测。利用Graphpad Prism5进行统计分析，分析细胞死亡率，计算ICso。
[0035] 实验结果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌中各种病理亚型的细胞株增殖具有抑制 作用，且呈剂量依赖性(如图1所示）。半数抑制浓度(IC50)值详见表1。
[0036] 表1科罗索酸对非小细胞肺癌细胞株的半数抑制浓度(μΜ/L)
[0037] _
[0038] 实施例2科罗索酸对非小细胞肺癌细胞平板克隆形成的影响
[0039] 平板克隆形成实验是测定单个细胞增殖能力的有效方法之一。基本原理是单个细 胞在体外持续增殖6代W上，其后代所组成的细胞群体，成为克隆(集落）。通过克隆形成实 验，可对单个细胞的增殖能力进行分析。此方法可用于有效评价药物的抑癌能力。
[0040] 实验方法（克隆形成实验）：取处于指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05%EDTA的 0.25%膜酶消化，重悬并计数。利用细胞计数板调节细胞浓度为60个/ml,取5ml加入到60mm 培养皿中，细胞均匀分布，铺满培养皿表面。细胞培养过夜后，弃去培养基，加入含不同浓度 科罗索酸(μΜ/L)的培养基。一般培养10-12天，观察是否有克隆形成W及克隆大小。经过固 定和吉姆萨染色，在显微镜下进行克隆计数。每团细胞数大于20个时作为一个克隆，即可计 数。
[0041] 实验结果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌H1650细胞克隆形成具有抑制作用，且呈 浓度依赖性，与Μ?Τ实验结果相一致(如图2所示）。
[0042] 实施例3科罗索酸对非小细胞肺癌中肿瘤干细胞球体形成的影响
[0043] 肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)是指一小群特定的肿瘤发生细胞，在特定 的肿瘤组织中具有很强的自我更新和增殖分化能力。虽然数量很少，但是却具有很强的致 瘤作用。运类细胞是肿瘤发生、进展、复发及转移的根源，也是肿瘤对放化疗耐受的根本原 因。肿瘤干细胞与干细胞具有很多相似的特性，能够进行自我更新。但是由于肿瘤干细胞缺 少干细胞的自我更新调控和定向分化能力，肿瘤干细胞能够不断地分裂形成肿瘤细胞，导 致细胞数目不断增加，肿瘤组织不断变大。由于肿瘤干细胞由于具有自我更新、增殖的能 力，能够在不贴壁、无血清的培养条件下成球，因此可通过肿瘤干细胞成球实验，评价药物 的抑癌能力。
[0044] 实验方法(球体形成实验）：取指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05%抓TA的0.25% 膜酶消化，重悬并用PBS清洗2-3次，去除培养基中所含血清。细胞重新悬浮于DMEM培养基 (含EGF 20ng/ml，bFGF2 20ng/ml，Vitamin B27，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素），进行培 养。按照每孔1500个细胞的数量接种到未处理的6孔板中，第二天开始进行药物处理(μΜ/ L)，共处理7-10天，根据球体形成的数量来评价药物对肿瘤干细胞球体形成的影响。实验结 果表明，科罗索酸对非小细胞肺癌Η1650中肿瘤干细胞球体形成具有抑制作用，且呈浓度依 赖性，明确了科罗索酸对肺癌肿瘤干细胞增殖的抑制作用。
[0045] 实验结果与肿瘤细胞中ΜΤΤ实验、平板克隆形成实验结果相一致，表明科罗索酸是 通过抑制肿瘤干细胞增殖来达到抗癌的作用(如图3所示）。
[0046] 实施例4科罗索酸对非小细胞肺癌中TGF-iVSmad信号通路的影响
[0047] 凡事有两面性，人有善恶同在。在癌症的发生发展中，也存在着运么一个亦正亦邪 的细胞因子，那就是转化生长因子e(TGF-i3)"TGF-i3在肿瘤形成的早期发挥抑制作用，是通 过抑制细胞增殖，诱导细胞调亡、抑制炎症因子来实现。相对于TGF-β的抑癌作用，TGF-β的 促癌作用多发生在癌症形成过程的后期，主要表现:促进肿瘤生长、转移，促进肿瘤细胞的 免疫逃逸，W及促进血管的生成，加剧肿瘤患者病程的发展，是导致肿瘤复发、转移的主要 因素之一。在肿瘤干细胞研究中TGF-β能够调控肿瘤干细胞标记物CD133,具体表现在激活 Smad3能够富集CD133+亚群细胞。因此，在肿瘤后期有效抑制TGF-iVSmad信号通路的激活，将 会有效抑制肿瘤的增殖、复发、转移。
[004引在TGF-e/Smad信号通路中，活化的I型TGF-β受体催化Smad2/3憐酸化，继而Smad2/ 3与Smad4形成多聚体，进入细胞核并调节祀基因转录。且非小细胞肺癌中Π 、虹期患者的 TGF-f3、Smad2/3水平也与肺癌的预后、转移有相关性。因此复合物Smad2/3/4是TGF-β信号下 游关键的蛋白祀点。
[0049] 实验方法:取指数生长期的肿瘤细胞，用含0.05%抓TA的0.25%膜酶消化，重悬并 计数。将5X106个细胞接种100mm培养皿，培养过夜后，弃去培养基，加入含不同浓度科罗索 酸(μΜ/L)的培养基。分别处理8、15、30分钟和1、2、4小时，采用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽 提试剂盒(碧云天生物技术有限公司）提取蛋白，WBCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技 术有限公司）进行蛋白定量，进行蛋白质印迹检测(Western Blot)，上样量25yg<3SDS-PAGE 电泳后转移到NC膜，W5%脱脂奶粉封闭后，加入一抗（Smad2，Smad3，Smad4(l:1000)， Hi stone (1:2000 )，CST公司）解育过夜。加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1: 2000，Santa Cruz )，解育1小时，化学发光法检测蛋白水平变化。
[0050] 实验结果表明，科罗索酸能够有效减低肿瘤细胞中Smad2/3/4蛋白复合体的核移 位水平，进而达到抑制TGF-iVSmad信号通路的作用，干预肿瘤细胞的增殖调控，从而达到抗 癌的目的(如图4所示）。
[0051] 本发明所设及的多个方面已做如上阐述。然而，应理解的是，在不偏离本发明精神 之前提下，本领域专业人员可对其进行等同改变和修饰，所述改变和修饰同样落入本申请 所附权利要求的覆盖范围。
【主权项】
1. 科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人肺支气管癌 Hl 650的药物或保健品中的应用。2. 科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备预防或治疗人大细胞肺癌 H460的药物或保健品中的应用。3. 科罗索酸或其药学上可接受的盐、水合物或前药在制备抑制肺癌肿瘤干细胞增殖的 药物或保健品中的应用。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述肺癌肿瘤干细胞为非小细胞肺癌H1650 肿瘤干细胞。
【文档编号】A61P35/00GK105878253SQ201610401922
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年6月7日
【发明人】刘俊, 许锦文, 凌霜
【申请人】上海中医药大学