蛋白酶体抑制剂mln9708单独或联合阿霉素在制备治疗乳腺癌药物中的用图
【专利摘要】本发明公开了蛋白酶体抑制剂MLN9708单独或联合阿霉素在制备治疗乳腺癌药物中的用途，属于医药技术领域。本发明人以肿瘤细胞中蛋白质代谢所必需的蛋白酶体及其抑制剂的生理作用与阿霉素的抗肿瘤机制为理论依据，通过研究发现，蛋白酶体抑制剂MLN9708作为单药，能够诱导癌细胞凋亡，在一定程度上可能减缓癌细胞的恶性程度，进一步的，本发明发明人还发现将蛋白酶体抑制剂MLN9708与阿霉素联用可以有效提高阿霉素化学治疗的敏感性。本发明的提出为乳腺癌的化学治疗提供了一种新的有效的技术手段，蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素能够有效增强化学治疗乳腺癌的敏感性，降低细胞毒性化学药物的使用剂量，延缓了肿瘤耐药的发生以及肿瘤细胞的恶性进展。
【专利说明】
蛋白酶体抑制剂MLN9708单独或联合阿霉素在制备治疗乳腺 癌药物中的用途
技术领域
[0001] 本发明设及一种治疗乳腺癌的新药物，特别设及一种蛋白酶体抑制剂单独或联合 细胞毒性化学治疗药物在治疗乳腺癌中的用途，本发明属于医药技术领域。
【背景技术】
[0002] 根据2013年全国肿瘤登记分析，乳腺癌的发病率位于女性癌症发病率之首，因乳 腺癌导致的死亡率在全部女性癌症中位列第四。浸润性乳腺癌占全部病例的90 % W上。根 据癌细胞的不同类型，对治疗的敏感性也存在较大的差异，但目前为止，化学治疗仍是乳腺 癌非手术治疗中基础性的组成部分。公认并推荐的化学治疗方案中含有细胞毒性化学治疗 药物阿霉素(doxorubicin, Dox)。运是一种主要作用于DNA的细胞周期非特异性的蔥环类化 疗药物，对各种生长周期的肿瘤细胞都有杀灭作用。自上世纪70年代起，阿霉素广泛应用于 多种血液系统恶性肿瘤如白血病及何杰金淋己瘤W及多种恶性实体瘤包括乳腺癌等的治 疗。该药能嵌入DNA而抑制核酸的合成从而发挥广谱的细胞毒性作用。但阿霉素的持续使用 会导致一系列的副作用，包括白细胞和血小板减少、脱发等，最重要的是屯、脏毒性，可W引 起屯、律失常、屯、肌损伤、屯、功不全甚至可在停药半年后引起迟发性严重屯、力衰竭。屯、脏毒性 与累积给药剂量密切相关。总剂量超过550mg/m2者，此类副反应发生率可达30 %。
[0003] 蛋白酶体是位于真核细胞内的具有多重蛋白降解能力的蛋白复合物，分布于细胞 质及细胞核中。主要的功能是对泛素化的细胞内蛋白进行降解，是实现细胞内蛋白质组稳 态的关键性结构，从而使细胞能动态地适应由于各种内外环境变化而引起的蛋白质组改 变。超过80%的细胞内蛋白会经过由蛋白酶体参与构成的泛素化-蛋白酶体通路而被降解。 运些细胞内的蛋白种类繁多，参与了细胞功能调节的各种环节，如细胞周期、细胞调亡、转 录、DNA损伤修复、抗原呈递等。自从上世纪70年代起，研究者逐步了解到蛋白酶体的结构与 功能，发现人类的26S蛋白酶体是由20S的核屯、催化区与19S的催化功能调节区构成。20S的 催化核屯、区呈空屯、柱状，是由4个环状结构Κα-β-β-α的顺序累加而成。其主要的催化功能 区位于β环，又是由3类具有不同催化特性的亚单位构成，分别称为m(caspase-Uke，C-L)、 02(1:巧93；[]1-1化6，1'-]^)和05((3115〇]1〇1:巧93；[]1-1146，〔1'-]^)亚单位。目前已证实主要有5类化 合物能作为蛋白酶体抑制剂，由于代谢活性不稳定、抑制能力差或缺乏特异性等原因，真正 已经应用于临床治疗的主要还是W第一代蛋白酶体抑制剂PS-341(Bortezomib，棚替佐米） 为代表的棚氨酸类肤的类似物。本发明中使用的是新一代蛋白酶体抑制剂MLN9708 αxazom化），是PS-341的下一代药物，该药现已获得美国抑A许可，用于难治性/复发性多发 骨髓瘤的临床治疗。目前对MLN9708的相关研究主要集中在血液系统恶性肿瘤，已公开发表 的文献中尚无应用于浸润性乳腺癌相关报道。
【发明内容】
[0004] 针对浸润性乳腺癌的常规化学治疗过程中存在阿霉素的剂量依赖性的毒副作用， 本发明的目的在于提供一种新的化学药物治疗策略来治疗乳腺癌。
[0005] 为了达到上述目的，本发明采用了 W下技术手段：
[0006] 本发明人W肿瘤细胞中蛋白质代谢所必需的蛋白酶体及其抑制剂的生理作用与 阿霉素的抗肿瘤机制为理论依据，通过研究发现，蛋白酶体抑制剂MLN9708作为单药，能够 诱导癌细胞调亡，在一定程度上可能减缓癌细胞的恶性程度，进一步的，本发明人还发现将 蛋白酶体抑制剂MLN9708与阿霉素联用可W强化阿霉素诱导的MAPK的激活，延缓NF-KB的激 活，有效地降低阿霉素的使用剂量，从而减轻阿霉素的毒副作用。本发明针对不同分子亚型 的浸润性乳腺癌联合应用上述组合方案，检测发现肿瘤细胞MAPK的激活增强，NF-KB的激活 延迟，而PARP，Caspase3的降解得到增强，细胞增殖能力明显下降，细胞调亡提前出现，证明 该组合可W有效提高阿霉素化学治疗的敏感性。本发明的方法改进了浸润性乳腺癌的化学 治疗策略，蛋白酶体抑制剂联合应用阿霉素有效增强了化学治疗乳腺癌的敏感性，降低了 肿瘤细胞的恶性程度。
[0007] 因此，在上述研究的基础上，本发明提出了蛋白酶体抑制剂MLN9708作为唯一有效 成分在制备治疗乳腺癌药物中的用途，所述的蛋白酶体抑制剂MLN9708 ( 4- (carboxymethyl)-2-((R)-1-(2-(2,5-dichlorobenzamido)acetamido)-3-methylbutyl)- 6-oxo-l, 3,2-dioxabo;rinane-4-ca;rbo巧lie acid，4-簇基-2-[ (lR)-1-[ [2-[ (2,5-二氯苯 甲酯基)氨基]乙酷基]氨基]-3-甲基下基]-6-氧代-1，3,2-二氧棚杂环己-4-乙酸）的分子 式为C20出浊CI2N2O9，分子量517.12162，其化学结构式如式I所示：
[000引
[0009] 所述的蛋白酶体抑制剂MLN9708可购自美国APExBIO公司（货号#A4007)。
[0010] 在本发明中，优选的，所述的乳腺癌为浸润性乳腺癌。
[0011] 进一步的，本发明还提出了蛋白酶体抑制剂MLN9708联合阿霉素在制备治疗乳腺 癌，特别是浸润性乳腺癌药物中的用途。W及一种用于治疗乳腺癌的药物组合物，其有效成 分由蛋白酶体抑制剂MLN9708 W及阿霉素组成。
[0012] 相较于现有技术，本发明的有益效果是：
[001引（1)提出了蛋白酶体抑制剂MLN9708在治疗乳腺癌中的用途，即为乳腺癌的治疗提 供了一种新的，有效的技术手段；
[0014] (2)提出了蛋白酶体抑制剂MLN9708与阿霉素联用治疗乳腺癌的方法，相较于单独 使用阿霉素，该方法提高了肿瘤细胞对W阿霉素为代表的现有细胞毒性化学治疗的敏感 性，降低了细胞毒性化学药物的使用剂量，延缓了肿瘤耐药的发生，延缓了肿瘤细胞的恶性 进展；
[001引（3)由于本发明的蛋白酶体抑制剂MLN9708可W 口服，因此今后临床应用会更为方 便。
【附图说明】
[0016] 图1是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞存活曲线图；
[0017] 包括乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0018] 图2是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞存活状态图；
[0019] 包括乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0020] 图3是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞细胞平板克隆形成示意图；
[0021] 包括乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、肥 C1954、MDA-MB-468、MDA-MB- 231和BT-549;
[0022] 图4是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞错定非依赖生长示意图；
[0023] 包括乳腺癌细胞 了470、]\?3^7、]\?^-18-361、]\?^-18-468、]\?^-18-23巧邮1'-549;
[0024] 图5是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞错定非依赖生长统计图；
[00 巧]A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:MDA-MB-468;E:MDA-MB-231;F:BT-549;
[00%] 图6是单独加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后乳腺癌细胞中PARP和化spase 3裂解的 Western blot图；
[0027] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC19 5 4;F:MDA-MB-46 8;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0028] 图7是蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素后乳腺癌细胞存活柱形图；
[00 巧]A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC1954;F:MDA-MB-468;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0030] 图8是蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素后乳腺癌细胞中PARP和化spase 3 裂解的Western blot图；
[0031] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC19 5 4;F:MDA-MB-46 8;G:MDA-MB- 231；H：BT-549；
[0032] 图9是蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素后乳腺癌细胞中JNK、p3如溝酸化和 ΙκΒα表达的Western blot图。
[0033] A:T47D;B:MCF7;C:MDA-MB-361;D:SK-BR-3;E:HCC1954;F:MDA-MB-468;G:MDA-MB- 231；H：BT-549〇
【具体实施方式】
[0034] 下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，应该理解的是，运些实施例仅用于 例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
[0035] 实施例1蛋白酶体抑制剂MLN9708对乳腺癌细胞恶性程度的影响
[0036] 1、蛋白酶体抑制剂MLN9708单独对乳腺癌细胞的作用
[0037] (1 )MLN9708单独对乳腺癌细胞存活能力的影响
[0038] 从ATCC中选择乳腺癌细胞系作为研究对象，包括了 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK- BR-3、HCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和 BT-549,分别代表 ER/PR+/-、HER2+和 ER/PR/ 肥R2-型乳腺癌类型，具体分型如表1所示。
[0039] 表1.乳腺癌细胞系分子分型
[0040]
[0041 ] 注：AC:腺癌；BaA:Basal A，基底细胞样型A;BaB:Basal B，基底细胞样型B;Ca, carcinoma; Due.化：导管癌；IDC:浸润性导管癌；Lu: luminal;化P:乳头状癌；P. Br:原发性 乳腺癌;PE:胸腔积液
[0042] 邸/PR/肥R2型:ER/PR阳性和肥R2表达来源于Sanger网站。方括号表示数据来源于 mRNA水平，没有蛋白数据。
[0043] ①绘制细胞生存曲线检测加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后的细胞增殖能力变化， 计算半数抑制浓度（I巧0)值
[0044] 乳腺癌细胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3JCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549)分别按每孔5X103个接种入96孔板培养，24h后加入MLN9708使其终浓度分别为 0. (ΠμΜ、0.03μΜ、0.1μΜ、0.3μΜ、1μΜ、3μΜΚ及ΙΟμΜ，同时设不力日MLN9708的细胞作为对照，培 养72h。加入CCK-8解育化后读取450nm吸光值，绘制细胞存活曲线，结果如图1所示。从图1结 果可W看出，与对照组细胞相比，加入MLN9708后细胞存活数量明显降低，说明MLN9708可降 低乳腺癌细胞的增殖能力。根据细胞存活曲线计算MLN9708在各种乳腺癌细胞中的IC50值， 结果如表2所示，可知IC50值范围在0.043μΜ(Τ470)至1.007μΜ(ΒΤ-549)之间。
[0045] 表2 .MLN9708在乳腺癌细胞系中的IC50值
[0046]
[0047] ②显微镜下观察加入蛋白酶体抑制剂MLN9708后细胞存活状态
[004 引 上述乳腺癌细胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、HCC1954、MDA-MB-468、MDA- MB-231和BT-549)分别按每孔5乂103个接种入96孔板培养，2地后加入肥脚708使其终浓度 分别为0.0化]?、0.0化]?、0.化]\1、0.34]\1、化]\1、34]\1^及1化]\1，同时设不加肥脚708的细胞作为对 照，培养72h。显微镜下拍照观察加入MLN9708后细胞的存活状态，结果如图2所示（只显示了 0、0.化1和0.341浓度下的细胞）。从图2结果可^看出，与对照组细胞相比，加入肥脚708后 细胞存活数量明显降低，进一步证实MLN9708可降低乳腺癌细胞的增殖能力。
[0049]③细胞克隆形成能力检测
[00 加]乳腺癌细胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3JCC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549)分别按每孔5X103个计数，接种于6孔板中培养。4化后加入MLN9708使其终浓度 分别为0 . ΙμΜΚ及0 .化M，同时设不加 MLN9708的细胞作为对照，培养7化后，更换成没有 MLN9708的正常培养液继续培养两周。甲醇固定，结晶紫染色后拍照。结果如图3所示，从图3 结果可W看出，与对照组细胞相比，加入MLN9708后细胞克隆数量明显降低，说明抑制剂可 降低乳腺癌细胞的增殖能力。
[0051] (2)检测蛋白酶体抑制剂MLN9708对乳腺癌细胞错定非依赖生长的影响
[0052]乳腺癌细胞（T47D、MCF7、MDA-MB-361、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和 ΒΤ-549)分别按 每孔5 X ΙΟ3个计数，加入MLN9708使其终浓度分别为0. ΙμΜ和0.3μΜ，同时设不力日MLN9708的 细胞作为对照，接种于6孔板软琼脂培养基中培养3~4周，直至出现肉眼可见克隆。结晶紫 染色后拍照。结果如图4所示，从图4结果可W看出，与对照组细胞相比，加入MLN9708后细胞 克隆数量明显降低。统计细胞克隆数目，绘制成图，通过统计学方差分析（Dunnett's multiple comparison post-test)，冲<0.05、*冲<0.01、**冲<0.001，有统计学意义，结果 如图5所示，说明抑制剂MLN9708可降低细胞的错定非依赖生长能力。
[0053] (3)检测蛋白酶体抑制剂MLN9708诱导乳腺癌细胞调亡的作用
[0化4] MLN9708是否可W诱导乳腺癌细胞发生调亡，通过常规Western blot技术，检测抑 制剂作用于细胞是否出现PARP裂解和化spase 3活化。
[0055]乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入MLN9708使其终浓度分别为0.0341、0.化1、0.341^及化1，同时设不加 MLN9708的细胞作为对照，作用24h。常规蛋白质提取，蛋白质浓度测定，SDS-PAGE凝胶电泳， Western blot分析，用针对PARP和化spase 3的特异性抗体检测抑制剂作用于细胞是否出 现PARP裂解和活化的化spase 3裂解片段。结果见图6,从图6结果可W看出，在乳腺癌细胞 中随着MLN9708从低到高浓度的作用，出现了PARP裂解和活化的化spase 3的裂解片段。说 明MLN9708可W诱导乳腺癌细胞发生调亡。
[0056] 2、检测蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素对乳腺癌细胞生物学行为的影响
[0057] (1)检测蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素对乳腺癌细胞存活能力的影响
[005引 乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549分别按每孔5 ΧΙΟ3个接种入96孔板培养，24h后加入阿霉素使其终浓度为化Μ、 0.0扣Μ、0. ΙμΜ、0.2μΜ、0.5μΜ、ΙμΜ、2μΜW及扣Μ，单独或联合应用MLN9708 0. ΙμΜ培养48h。加 入CCK-8解育化后读取450nm吸光值，绘制细胞存活柱形图，结果如图7所示，从图7结果可W 看出，联合应用阿霉素和MLN9708后细胞存活数量明显低于单独使用阿霉素时的细胞存活 数量，说明MLN9708可W增强阿霉素诱导的细胞毒性作用，增强了乳腺癌细胞对阿霉素的敏 感性。
[0059] (2)检测蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素诱导乳腺癌细胞调亡的作用
[0060] 乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入阿霉素 ΙμΜ单独应用或联合应用MLN9708 Ο.ΙμΜ作用0、16h或2地。常规蛋白 质提取，蛋白质浓度的测定，SDS-PAGE凝胶电泳，Western blot分析，检测抑制剂作用于细 胞是否出现PARP裂解和活化的化spase 3裂解片段。结果见图8,从图8结果可W看出，在乳 腺癌细胞中随着MLN9708加入，PARP裂解和活化的化spase 3的裂解片段相比于单独使用阿 霉素时提前出现，或者加强。说明MLN9708可W增强乳腺癌细胞对阿霉素诱导细胞调亡的敏 感性。
[0061] (3)检测蛋白酶体抑制剂MLN9708联合应用阿霉素诱导的信号通路的改变
[0062] 乳腺癌细胞 T47D、MCF7、MDA-MB-361、SK-BR-3、WC1954、MDA-MB-468、MDA-MB-231 和BT-549,加入阿霉素20μΜ单独应用或联合应用MLN9708 ΙμΜ作用0、化、祉或地。常规蛋白 质提取，蛋白质浓度的测定，SDS-PAGE凝胶电泳，Western blot分析，检巧UMLN9708作用于细 胞是否对阿霉素诱导的细胞信号通路有影响。结果见图9,从图9结果可W看出，在乳腺癌细 胞中阿霉素可W诱导细胞出现MAPK通路JNK和p38发生憐酸化，并可W诱导ΙκΒα降解而激活 NF-κΒ通路。当阿霉素联合应用MLN970別寸，细胞出现ΜΑΡΚ通路JNK和ρ38的憐酸化水平明显 增加，ΙκΒα降解NF-KB激活受到抑制。说明MLN9708可W增强阿霉素诱导的JNK和ρ3如溝酸化， 从而诱导细胞出现调亡；并可W通过抑制ΙκΒα降解，抑制NF-KB通路激活，从而抑制了细胞 的存活能力。
[0063] W上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的； 本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改 变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。
【主权项】
1. 蛋白酶体抑制剂MLN9708作为唯一有效成分在制备治疗乳腺癌药物中的用途，所述 的蛋白酶体抑制剂MLN9708的化学结构式如式I所示：2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的乳腺癌为浸润性乳腺癌。3. 蛋白酶体抑制剂MLN9708联合阿霉素在制备治疗乳腺癌药物中的用途，所述的蛋白 酶体抑制剂MLN9708的仆-4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的乳腺癌为浸润性乳腺癌。5. -种用于治疗乳腺癌的药物组合物，其特征在于所述的药物组合物的有效成分由蛋 白酶体抑制剂MLN9708以及阿霉素组成，所述的蛋白酶体抑制剂MLN9708的化学结构式如式 I所示：
【文档编号】A61K31/69GK105878257SQ201610202268
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月1日
【发明人】崔云甫, 王浩, 钟翔宇, 王志东, 苏志雷
【申请人】哈尔滨医科大学