包含胞外基质组织材料和成骨蛋白的产品的制作方法
【专利说明】包含胞外基质组织材料和成骨蛋白的产品
[0001 ] 相关申请的参考
[0002]本申请要求2013年9月2日提交的并且发明名称为包含胞外基质材料和成骨蛋白的产品的美国专利申请系列N0.61/872，827的优先权权益，将其全部按引用并入本文中。
[0003]罝量
[0004]本发明公开内容涉及治疗组合物，并且在某些形式中，涉及包括胞外基质组织材料和骨形态生成蛋白的组合的成骨组合物。
[0005]现今许多医学程序依赖于使骨再生，所述骨作为疾病或年龄的结果已经变得退化或已经受到损坏(例如，骨折)。尽管可利用各种外科程序，但现代医学的进展使得可以补充某些技术，并且有时候甚至可以替代这些外科手术。例如，已经鉴定出许多遗传因子，如果递送至正确部位，则其可以用于这一目的。尽管该构思看起来容易进行，但仍然存在问题。
[0006]通常所了解的是，用于软骨内骨形成的治疗因子(例如，成骨因子)的成功递送需要蛋白质与载体的关联。目前，存在许多现有技术中鉴定的载体，其全部都有局限性。例如，载体包括有机物质，如去矿化的骨基质、非胶原性蛋白、胶原蛋白(例如，胶原蛋白海绵)、纤维蛋白、自溶抗原提取的同种异体的骨(AAA-骨)、聚乙醇酸、聚乳酸、水凝胶，以及无机材料，如羟磷灰石、磷酸三钙、其他生物陶瓷、生物活性玻璃、金属、珊瑚、珊瑚-胶原蛋白复合物、天然骨矿物质、几丁质、热灰化(thermoashed)骨矿物质、非去矿化的骨颗粒、陶瓷骨颗粒、陶瓷牙质、聚磷酸聚合物、受辐射的松质骨芯片、硫酸钙和烧结骨。尽管这些材料在将治疗因子递送至所需组织中有些有效性，但它们具有其局限性。例如，一些递送载体不能将治疗因子在局部保持足够长的时间段。其他递送载体不能在施用其的宿主中充分地再吸收。还有其他的递送载体和含有其的组合物在成骨因子和载体之间缺乏协同的相互作用以增强组织形成。
[0007]鉴于这一背景，仍然需要改进的或备选的可以非常有益利用成骨因子的成骨组合物，以及相关的使用和制备方法。
[0008]挺述
[0009]已经发现了胞外基质组织材料当与成骨因子一起使用时，可以作为非常有益的载体或协同组分来产生硬组织，如骨。胞外基质组织材料可以用于有利地结合成骨因子，并且由于来自用于胞外基质组织材料的源组织的残留天然生物活性物质的存在而以优选的形式提供组织形成的补充生物活性支持。
[0010]在某些方面中，提供了包括胶原性胞外基质组织材料和骨形态生成蛋白的成骨组合物。提供了优选的组合物形式，其中胶原性胞外基质组织材料是固体基质，并且其中骨形态生成蛋白由固体基质来携带。胶原性胞外基质组织材料可以保留来自用于胶原性胞外基质组织材料的源组织的天然肝素、硫酸乙酰肝素和/或其他天然组分，并且骨形态生成蛋白的至少一部分可以结合天然肝素、硫酸乙酰肝素和/或其他天然成分。骨形态生成蛋白可以是或包含任何人骨形态生成蛋白，优选:BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和/或BMP-9，甚至更优选ΒΜΡ-2ο在一些形式中，骨形态生成蛋白包括重组人骨形态生成蛋白，例如，BMP-2(“rhBMP-2”)。可以以组合物中相对低的载量来提供BMP-2和/或其他骨形态生成蛋白，例如，以约75yg至约300yg/克胶原性胞外基质组织材料，和/或约25yg至约10yg/平方厘米胶原性胞外基质组织材料范围的水平存在;和/或以约6mg或更低，或约4mg或更低，或约3mg或更低，例如，在约I至6mg或约I至4mg的范围中的总剂量存在。含有这样水平和/或总剂量的rhBMP-2或其他BMP的组合物可以用于人患者中。可以以不可流动的固体植入物形式或可流动的(例如，可注射的)形式来提供组合物，并且在这样的可流动形式中，可以包括胞外基质组织颗粒材料和/或胶原性胞外基质凝胶，其包括源组织天然的溶解的胞外基质组分的混合物。在某些方面中，组合物还可以包括其他生物活性或基质材料，例如，矿物质支架材料，如含钙化合物。
[0011]在某些方面中，提供了包括胶原性胞外基质组织材料、骨形态生成蛋白和促红细胞生成素(EPO)的成骨组合物。提供优选的组合形式，其中胶原性胞外基质组织材料是固体基质，并且其中骨形态生成蛋白由所述固体基质来携带。胶原性胞外基质组织材料可以保留来自用于胶原性胞外基质组织材料的源组织的天然肝素、硫酸乙酰肝素和/或其他天然成分，并且骨形态生成蛋白的至少一部分可以结合天然肝素、硫酸乙酰肝素和/或其他天然成分。骨形态生成蛋白可以是或包括任一种人骨形态生成蛋白，优选:BMP-2、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和/或BMP-9，甚至更优选BMP-2。在一些形式中，骨形态生成蛋白包括重组人骨形态生成蛋白，例如，BMP-2 ( “rhBMP-2” )。可以以组合物中相对低的载量来提供BMP-2和/或其他骨形态生成蛋白，例如，以约0.1yg至约3yg/克，或约0.1yg至约1.5yg/克胶原性胞外基质组织材料范围的水平存在;和/或以约6mg或更低，或约4mg或更低，或约3mg或更低，例如，在约I至6mg或约I至4mg的范围中的总剂量存在。含有这样水平和/或总剂量的rhBMP-2或其他BMP的组合物可以用于人患者中。在一些形式中，EPO包括重组促红细胞生成素(rEPO)，在某些实施方案中，rEP0包括重组人促红细胞生成素(rhEPO)。可以以不可流动的固体植入物性质或可流动的(例如，可注射的)形式来提供组合物，并且在这样的可流动形式中，包括胞外基质组织颗粒材料和/或包括源组织天然的溶解胞外基质组分混合物的胶原性胞外基质凝胶。在某些方面中，组合物还可以包括其他生物活性或基质材料，例如，矿物质支架材料，如含钙化合物。
[0012]以下讨论中提供了关于成骨组合物的组分的其他特征，包括但不限于其性质、水平、比例和组合或掺入成骨组合物中的方式。将明白这些其他特征，单独的或组合的，可以结合以上段落或本文中别处所描述的特征，以形成本文中所公开的另外的实施方案。
[0013]本文中所公开的更多实施方案涉及如本文中公开的成骨组合物的使用方法。这些方法可以用于形成硬的组织，如骨，其可以用于治疗患病或受损骨的目的(例如，用于治疗性或预防性处理)。
[0014]本文中所公开的再进一步的实施方案涉及如本文中公开的成骨组合物的制备方法。
[0015]在阅读以下描述时，另外的实施方案，及其特征和优点，对本领域技术人员而言是显而易见的。
[0016]附图简述
[0017]图1显示了给右大腿肌肉注射含有5ygrhBMP-2的可流动ECM(图1，A)或单独的可流动ECM(图1，B)后2周，N0D/SCID小鼠的X-射线数字图像和微CT图像，以下实施例2中有进一步的描述。接受含有5yg rhBMP-2的可流动ECM注射的小鼠显示出在大腿肌肉内大量的、从头开始的骨形成(图1，A)。注射单独的可流动ECM的动物显示出在注射后2周时没有可检测的异位骨形成(图1，B)。
[0018]登述
[0019]—将参考某些实施方案，并且将使用特定的语言来描述这些实施方案。然而将明白没有打算由此限定本发明的范围。如同通常被本发明所涉及领域的技术人员想到的，考虑了所述实施方案的任何改变和更多变化以及如本文中所述的本发明原理的任何进一步的应用。
[0020]如以上所公开的，本发明的某些方面涉及包括骨形态生成蛋白、促红细胞生成素和胞外基质组织材料的成骨组合物，以及所述组合物的制备或使用方法。
[0021]各种成骨骨形态生成蛋白是已知的并且可以以单独或组合的骨形态生成蛋白用于本文中的实施方案中。优选重组人骨形态生成蛋白(rhBMP)。更优选，骨形态生成蛋白是rhBMP-2、rhBMP-4，或其杂二聚体。rhBMP-2和rhBMP-7是商业上可购得的并且这样的商业形式可以用于本文中。骨形态生成蛋白可以是或包括任何骨形态生成蛋白，优选:BMP-2、BMP-
4、BMP-5、BMP-6、BMP-7和/或BMP-9，甚至更优选BMP-2。在一些形式中，骨形态生成蛋白包括重组人骨形态生成蛋白，例如BMP-2( “rhBMP-2” )。这些或其他rhBMP也可以使用本领域技术人员已知的材料和方法来制备，例如，如美国专利N0.5，187，076; 5，366，875; 5，108，922; 5，116，738;5，013，649;6，352，972和国际卩(:1'申请￥093/00432;￥094/26893;￥094/26892中所述的。可以作为冻干粉来提供骨形态生成蛋白，其可以在产品制造过程中或在手术内在注射用无菌水或另一种用于施用的液体载体中重建，或另外作为本文中组合物制造的一部分。
[0022]促红细胞生成素(EPO)是通过肾脏和肝脏响应缺氧而产生的激素。EPO结合EPO受体(EpoR)来提高红细胞产生，提高VEGF表达和刺激血管生成。还已经证明了EPO通过间质干细胞和/或骨髓基质细胞的直接刺激(例如，通过提高成骨)诱导骨重塑响应。EPO可以通过提高造血祖细胞的数量(例如，提高破骨细胞生成)进一步地间接诱导骨重塑响应。此外，EPO还显示出诱导造血干细胞的BMP产生。用于本发明中的EPO可以是天然的或人EPO的重组形式(rhEPO)。
[0023]因此，在某些方面中，本发明公开内容的组合物包括ECM、BMP和EPOJPO可以有效地刺激新的血管形成和/或刺激间质干细胞(MSC)募集至植入部位，并且BMP可以有效地促进从间质干细胞发育成成骨细胞。
[0024]本文中使用的胶原性胞外基质(ECM)材料可以是去细胞的包括ECM组织的动物组织层。在这点上，本文中使用的“去细胞的”是指其中ECM组织天然的全部或基本上全部的细胞已经被除去的ECM组织的状态；因此，其他(非天然)细胞可以存在于ECM组织上或其中，仍然将其称为去细胞的。ECM组织层可以获自温血椎骨动物，如绵羊、牛或猪动物的源组织。源组织层优选是未矿化的(即，软组织)源组织。例如，合适的ECM组织包括包含粘膜下层、肾囊膜、真皮胶原、硬脑脊膜、心包膜、羊膜、阔筋膜、浆膜、腹膜或基底膜层的那些，包括肝基底膜。用于这些目的的合适粘膜下层材料包括，例如，肠粘膜下层，包括小肠粘膜下层，胃粘膜下层，膀胱粘膜下层和子宫粘膜下层。可以通过采集这样的组织来源并且从平滑肌层、粘膜层和/或组织源中出现的其他层中分出含有粘膜下层的基质来获得本发明中有用的包含粘膜下层(可能连同其他相关组织一起)的ECM组织。猪组织源是优选的来源，从其采集ECM组织，包括含有粘膜下层的ECM组织。
[0025]本发明中使用的ECM组织优选的是去细胞的并且是高度纯化的，例如，如Cook等的美国专利N0.6 ,206 ,931或2008年11月20日公开的美国专利申请公开N0.US2008286268，2008年7月23日提交的公开美国专利申请系列N0.12/178,321中所述的，由此将其全部以其整体按引用并入本文中。优选的ECM组织材料将呈现出低于约12内毒素单位(EU)/克，更优选低于约5EU/克，并且最优选低于约IEU/克的内毒素水平。作为另外的优选，粘膜下层或其他ECM材料可以具有低于约I集落形成单位(CFU)/克的微生物量(b1burden)，更优选低于约0.5CFU/克。真菌水平理想地是相似地低，例如，低于约ICFU/克，更优选低于约0.5CFU/克。核酸水平优选地低于约Syg/mg，更优选地低于约2yg/mg，并且病毒水平优选地低于约50空斑形成单位