专利名称：鉴定矿化刺激因子的基质蛋白单克隆抗体及鉴定方法
技术领域：
本发明涉及一种用于鉴定合浦珠母贝矿化剌激因子的抗体，具体涉及一种鉴定矿
化剌激因子的基质蛋白单克隆抗体，本发明还涉及利用该单克隆抗体对矿化剌激因子进行 鉴定的方法。
背景技术：
生物矿化是自然界中普遍存在的通过生物体生命活动将矿物离子转变为矿物沉 积的过程。生物矿物大多数起着支撑、防御和保护生物体的功能，并具有感光器官、重力感 受、磁导航和离子储存等功能，对于生物体的生存有着至关重要的意义。研究表明，贝类的 生物矿化过程受基质蛋白(nacrein)的调控，基质蛋白与合浦珠母贝的矿化过程密切相 关。但是，由于缺乏相应的研究模型和方法，以珍珠贝类为对象，从细胞和蛋白调控角度研 究生物矿化机理的进展缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种鉴定矿化剌激因子的基质蛋白单克隆抗体，用于鉴定与 贝类矿化过程相关的基质蛋白中的剌激因子，从细胞角度揭示基质蛋白调控生物矿化的机理。 本发明的另一目的是提供一种利用上述基质蛋白单克隆抗体鉴定矿化剌激因子 的方法。 本发明所采用的一个技术方案是，鉴定矿化剌激因子的基质蛋白单克隆抗体，专 一性识别合浦珠母贝基质蛋白。 本发明所采用的另一技术方案是，一种基质蛋白单克隆抗体鉴定与矿化相关的基 质蛋白剌激因子的方法，按以下步骤进行 步骤1 :取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2 天 4天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再 培养2天 4天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基； 步骤2 :取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞 融合，然后，采用酶联免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进 行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射 到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；
步骤3 :取新西兰兔，用基质蛋白进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；
步骤4 :分别取20mM碳酸钠缓冲液和步骤3取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸 钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2 ii g/ml 10 ii g/ml、 pH值为 9. 2 9. 4的多克隆抗体稀释液，然后，分别取该多克隆抗体稀释液和96孔酶标板，在该96 孔酶标板的每孔中分别加入100 iU 150 iU多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件下， 孵育1小时 2小时，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；
步骤5 :按重量比，分别取羊血清3% 5%、牛血清白蛋白3% 5%和纯水 90% 94%，混合形成封闭液，各组份总量100% ; 步骤6 :分别取步骤4洗涤后的96孔酶标板和步骤5制得的封闭液，在96孔酶标 板每孔中分别加入lOOiU 150 iil封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭1小时 2小时；
步骤7 :分别取普通培养基、步骤1得到的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和 步骤6封闭完成的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各 250 ii 1分别加入96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37°C的条件下，孵 育小时 2小时，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体结合后的96孔酶标板洗涤 4次； 步骤8 :分别取碳酸钠缓冲液和步骤2制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM 碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为2 ii g/ml 10 ii g/ml、 pH值为9. 2 9. 4的单克隆抗体稀 释液，将该单克隆抗体稀释液加入步骤7洗涤后的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔 内分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于 37t:的温度下，孵育l小时 2小时，然后，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板 用磷酸缓冲液洗涤4次； 步骤9:按体积比1 : 1500，分别取辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶 标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲 合素稀释溶液； 步骤10 :分别取步骤9制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和步骤8洗涤 后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150 ii 1辣根过氧化物酶标记亲合素稀 释溶液，然后，置于37t:的温度下孵育1小时 2小时，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷 酸缓冲液洗涤4次； 步骤11 :分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液 中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在 该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 ii 1双氧水的比例，将双氧水加入混合液中， 制得邻苯二胺底物溶液； 步骤12 :分别取步骤11制得的邻苯二胺底物溶液和步骤10洗涤后的96孔酶标 板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150 ii 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色10分 钟 30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04溶液30 y 1，终止反应，然 后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度； 步骤13 :根据步骤12中测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的 培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化，鉴定该剌激因子是否促 进基质蛋白的分泌。 本发明基质蛋白单克隆抗体能够在添加不同剌激因子的情况下，特异而灵敏的检 测原代培养的合浦珠母贝外套膜细胞基质蛋白分泌变化，广泛用于鉴定与合浦珠母贝基质 蛋白分泌相关的剌激因子，为研究矿化相关基质蛋白的调控提供了物质基础，从而为矿化 模型的研究奠定了基础。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
对本发明进行详细说明。 为从细胞角度探究基质蛋白在生物矿化中的机理和矿化模型，本发明提供了一种 用于鉴定合浦珠母贝矿化过程中，与矿化剌激因子相关的基质蛋白单克隆抗体，该单克隆 抗体为专一性识别合浦珠母贝基质蛋白(nacrein)的单克隆抗体，通过杂交瘤技术建立细 胞系产生得到。 本发明还提供了一种利用上述基质蛋白单克隆抗体鉴定与矿化相关的基质蛋白 剌激因子的方法，该方法具体按以下步骤进行 步骤1 :取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2 4天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养 2 4天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基； 步骤2 :取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融 合，然后，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤 细胞进行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细 胞注射到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；
步骤3 :取新西兰兔，用基质蛋白(nacrein)进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆 抗体； 步骤4 :分别取20mM碳酸钠缓冲液和步骤3取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸 钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2 10 ii g/ml、pH值为9. 2 9. 4 的多克隆抗体稀释液，然后，分别取该多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标 板，在该96孔酶标板的每孔中分别加入100 150iU多克隆抗体稀释液，置于fC的温度 条件下，孵育1 2小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标 板用磷酸缓冲液(PBST)洗涤4次； 步骤5:按重量比，分别取羊血清3 5%、牛血清白蛋白(BSA)3 5X和纯水 90 94%，混合形成封闭液，各组份总量100% ; 步骤6 :分别取步骤4洗涤后的96孔酶标板和步骤5制得的封闭液，在96孔酶标 板每孔中分别加入lOOiU 150 iil封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭1 2小时，使 96孔酶标板每孔内多克隆抗体与96孔酶标板孔壁未结合的位点封闭；
步骤7 :分别取普通培养基、步骤1得到的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和 原代培养的培养基和步骤6封闭完成的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基 质蛋白的培养基各250 iU分别加入96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后， 在37t:的条件下，孵育1 2小时，使96孔酶标板的孔内培养基中的基质蛋白与多克隆抗 体结合，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体结合后的96孔酶标板洗涤4次；
步骤8 :分别取碳酸钠缓冲液和步骤2制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM 碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为2 10ii g/ml、pH值为9. 2 9. 4的单克隆抗体稀释液，将 该单克隆抗体稀释液加入步骤7洗涤后的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别 加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37°C的 温度下，孵育l 2h，使单克隆抗体与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96 孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；
步骤9 :按体积比1 : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲合素 (HRP-Avidin)和辣根过氧化物酶标记亲合素(HRP-Avidin)稀释液，对辣根过氧化物酶标 记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液； 步骤10 :分别取步骤9制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和步骤8洗涤 后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150 1辣根过氧化物酶标记亲合素稀 释溶液，然后，置于37°C的温度下孵育1 2小时，使96孔酶标板每孔内的单克隆抗体与辣 根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；
步骤11 :分别取邻苯二胺(OPD)和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸 缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混 合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 1双氧水的比例，将双氧水加入混 合液中，制得邻苯二胺底物溶液； 步骤12 :分别取步骤11制得的邻苯二胺底物溶液和步骤10洗涤后的96孔酶标 板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色10 30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04溶液30 y 1，终止反应，然后，采 用酶标仪在490nm波长下测定吸光度(0D49Qnm值)； 步骤13 :根据步骤12中测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的 培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化(吸光度高，表示基质蛋 白浓度高)，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。 本发明鉴定方法采用专一识别性的基质蛋白单克隆抗体，并利用该基质蛋白建立 了高特异性和灵敏性的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法。基质蛋白单克隆抗体的高特 异性和灵敏度，酶标二抗的放大作用使得在不同剌激因子作用下基质蛋白浓度变化的测量 更精确，且操作步骤简单。该方法可以广泛应用于测定各种剌激因子对基质蛋白分泌的影 响，从而鉴定出调控生物矿化过程的基质蛋白分泌的促进因子，为研究矿化相关基质蛋白 的调控提供新方法，为矿化机理和模型的研究奠定了基础，具有广泛的应用价值。
实施例1 取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2天，然后， 根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养2天，得到含 有外套膜分泌的基质蛋白的培养基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与 骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法筛选出阳性杂交瘤细胞， 将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该 单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获 得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白(nacrein)进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗 体；分别取20mM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋 白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2ii g/ml、 pH值为9. 2的多克隆抗体稀释液，分别取该 多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标板，在该96孔酶标板的每孔中分别加 入lOOiU多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件下，孵育1小时，使多克隆抗体与96孔 酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液(PBST)洗涤4次；按重量比，分 别取羊血清3%、牛血清白蛋白(BSA)3X和纯水94X，混合形成封闭液；分别取多克隆抗体 孵育后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板每孔中分别加入100 1封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭l小时，使96孔酶标板每孔内多克隆抗体与96孔酶 标板孔壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套膜分泌的基质蛋白的培 养基和完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各 250 ii 1分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37°C的条件下， 孵育1小时，使96孔酶标板的孔内培养基中的基质蛋白与多克隆抗体结合，之后，用磷酸缓 冲液将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4次；分别取碳酸钠缓冲液和 制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为2iig/ml、pH值 为9. 2的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与多克隆抗体结合后并 经洗涤的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液， 之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37t:的温度下，孵育lh，使单克隆抗体 与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次； 按体积比l : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物 酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记 亲合素稀释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和单克隆抗体与基质 蛋白结合后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150iU辣根过氧化 物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37t:的温度下孵育1小时，使96孔酶标板每孔内的 单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲 液洗涤4次；分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液中加入 10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在该混合 液使用前，按每10ml该混合液中加入18 ii 1双氧水的比例，将双氧水加入该混合液中，制得 邻苯二胺底物溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记 亲合素结合并经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150iU邻苯二胺 底物溶液，进行避光显色，显色10分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04 溶液30 ii 1，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度；根据测得的490nm波 长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基 质蛋白浓度变化(吸光度高，表示基质蛋白浓度高)，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的 分泌。 实施例2 取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养4天，然后， 根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养4天，得到含 有外套膜分泌的基质蛋白的培养基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与 骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法筛选出阳性杂交瘤细胞， 将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该 单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获 得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白(nacrein)进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗 体；分别取20mM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋 白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为10y g/ml、pH值为9.4的多克隆抗体稀释液，分别取该 多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标板，在该96孔酶标板的每孔中分别加入 150 ii 1多克隆抗体稀释液，置于4°C的温度条件下，孵育2小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液(PBST)洗涤4次；按重量比，分别取 羊血清5%、牛血清白蛋白(BSA)5X和纯水90X，混合形成封闭液；分别取多克隆抗体孵育 后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板每孔中分别加入150 Pi封闭 液，然后，在37t:的温度下，封闭2小时，使96孔酶标板每孔内多克隆抗体与96孔酶标板孔 壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和 完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各250 iU 分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37t:的条件下，孵育2 小时，使96孔酶标板孔内的培养基中的基质蛋白与多克隆抗体结合，之后，用磷酸缓冲液 将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4次；分别取碳酸钠缓冲液和制 得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为10i! g/ml、pH值为9. 4 的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与多克隆抗体结合后并经洗涤 的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将 加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37°C的温度下，孵育2h，使单克隆抗体与基质蛋 白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；按体积比 1 : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶标记亲 合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲合素稀 释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和单克隆抗体与基质蛋白结合 后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150 ii 1辣根过氧化物酶标记 亲合素稀释溶液，然后，置于37°C的温度下孵育2小时，使96孔酶标板每孔内的单克隆抗体 与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次； 分别取邻苯二胺和PH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二 胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在该混合液使用前，按 每10ml该混合液中加入18 iU双氧水的比例，将双氧水加入混合液中，制得邻苯二胺底物 溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合并 经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150 ii 1邻苯二胺底物溶液，进 行避光显色，显色30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04溶液30 iU，终 止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度；根据测得的490nm波长下的吸光度， 通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化 (吸光度高，表示基质蛋白浓度高)，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。
实施例3 取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养3天，然后， 根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养3天，得到含 有外套膜分泌的基质蛋白的培养基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与 骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)的方法筛选出阳性杂交瘤细胞， 将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该 单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获 得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白(nacrein)进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗 体；分别取20mM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋 白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为6ii g/ml、 pH值为9. 3的多克隆抗体稀释液，分别取该多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标板，在该96孔酶标板的每孔中分别加入125 1多克隆抗体稀释液，置于4°C的温度条件下，孵育1. 5小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液(PBST)洗涤4次；按重量比，分别取羊血清4%、牛血清白蛋白(BSA)4X和纯水92X，混合形成封闭液；分别取多克隆抗体孵育后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板每孔中分别加入125 1封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭1. 5小时，使96孔酶标板每孔内多克隆抗体与96孔酶标板孔壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各250 1分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37°C的条件下，孵育1. 5小时，使96孔酶标板孔内的培养基中的基质蛋白与多克隆抗体结合，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4次；分别取碳酸钠缓冲液和制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用碳酸钠缓冲液稀释，制成浓度为6ii g/ml、 pH值为9. 3的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与多克隆抗体结合后并经洗涤的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37t:的温度下，孵育1. 5h，使单克隆抗体与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；按体积比l : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和单克隆抗体与基质蛋白结合后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150iU辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37°C的温度下孵育1. 5小时，使96孔酶标板每孔内的单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 ii 1双氧水的比例，将双氧水加入混合液中，制得邻苯二胺底物溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合并经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别加入150 ii 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色20分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04溶液30 ii 1，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度；根据测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化(吸光度高，表示基质蛋白浓度高)，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。
权利要求
一种鉴定矿化刺激因子的基质蛋白单克隆抗体，其特征在于，专一性识别合浦珠母贝基质蛋白。
2. —种利用权利要求1所述基质蛋白单克隆抗体鉴定与矿化相关的基质蛋白剌激因 子的方法，其特征在于，该鉴定方法具体按以下步骤进行步骤1 :取合浦珠母贝的外套膜细胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2天 4天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养2 天 4天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基；步骤2 :取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合， 然后，采用酶联免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进行克 隆，并筛选出特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射到正 常BALB/c小鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；步骤3 :取新西兰兔，用基质蛋白进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；步骤4 :分别取20mM碳酸钠缓冲液和步骤3取得的基质蛋白多克隆抗体，用碳酸钠缓 冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2ii g/ml 10ii g/ml、 pH值为9. 2 9. 4的多克隆抗体稀释液，然后，分别取该多克隆抗体稀释液和96孔酶标板，在该96孔酶标 板的每孔中分别加入100 iU 150 iU多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件下，孵育1 小时 2小时，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；步骤5 :按重量比，分别取羊血清3% 5%、牛血清白蛋白3% 5%和纯水90% 94%，混合形成封闭液，各组份总量100% ;步骤6 :分别取步骤4洗涤后的96孔酶标板和步骤5制得的封闭液，在96孔酶标板每 孔中分别加入lOOiU 150 iil封闭液，然后，在37"的温度下，封闭1小时 2小时；步骤7:分别取普通培养基、步骤1得到的含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基和步骤 6封闭完成的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质蛋白的培养基各250 ii 1 分别加入96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后，在37t:的条件下，孵育小 时 2小时，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体结合后的96孔酶标板洗涤4次；步骤8 :分别取碳酸钠缓冲液和步骤2制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM碳 酸钠缓冲液稀释，制成浓度为2 ii g/ml 10 ii g/ml、 pH值为9. 2 9. 4的单克隆抗体稀释 液，将该单克隆抗体稀释液加入步骤7洗涤后的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内 分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于 37t:的温度下，孵育1小时 2小时，然后，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板 用磷酸缓冲液洗涤4次；步骤9:按体积比1 : 1500，分别取辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶标记 亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣根过氧化物酶标记亲合素 稀释溶液；步骤10 :分别取步骤9制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和步骤8洗涤后的 96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入150 ii 1辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶 液，然后，置于37t:的温度下孵育1小时 2小时，之后，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓 冲液洗涤4次；步骤11 :分别取邻苯二胺和PH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得到混合液，在该混 合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 1双氧水的比例，将双氧水加入混合液中，制得 邻苯二胺底物溶液；步骤12 :分别取步骤11制得的邻苯二胺底物溶液和步骤10洗涤后的96孔酶标板，在 该96孔酶标板每孔中分别加入150 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色10分钟 30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别加入浓度1M的H2S04溶液30 y 1，终止反应，然后，采 用酶标仪在490nm波长下测定吸光度；步骤13 :根据步骤12中测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养 基和空白对照组培养基的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化，鉴定该剌激因子是否促进基 质蛋白的分泌。
3. 按照权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤4中采用Costar公司生产 的96孔酶标板。
4. 按照权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述步骤9中采用Sigma公司生产的 辣根过氧化物酶标记亲合素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液。
5. 按照权利要求l所述的鉴定方法，其特征在于，该方法为取合浦珠母贝的外套膜细 胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养2天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将 不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养2天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养 基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶联 免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特 异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠 体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白进 行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；分别取20mM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多克 隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为2ii g/ml、 pH值为 9. 2的多克隆抗体稀释液，分别取该多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标板， 在该96孔酶标板的每孔中分别加入100 多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件下，孵 育1小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓冲液 洗涤4次；按重量比，分别取羊血清3%、牛血清白蛋白3%和纯水94%，混合形成封闭液； 分别取多克隆抗体孵育后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板每孔 中分别加入100 1封闭液，然后，在37°C的温度下，封闭1小时，使96孔酶标板每孔内多克 隆抗体与96孔酶标板孔壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套膜分泌 的基质蛋白的培养基和完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌的基质 蛋白的培养基各250 ii 1分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照，然后， 在37t:的条件下，孵育l小时，使96孔酶标板的孔内培养基中的基质蛋白与多克隆抗体结 合，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4次；分别 取碳酸钠缓冲液和制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用20mM碳酸钠缓冲液稀释，制成浓 度为2ii g/ml、pH值为9. 2的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与多 克隆抗体结合后并经洗涤的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g单 克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37t:的温度下，孵育 lh，使单克隆抗体与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；按体积比1 : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲合 素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到辣 根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液和 单克隆抗体与基质蛋白结合后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加入 150 辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37t:的温度下孵育1小时，使96 孔酶标板每孔内的单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96孔 酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml柠 檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀，得 到混合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 ii 1双氧水的比例，将双氧水加 入该混合液中，制得邻苯二胺底物溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与 辣根过氧化物酶标记亲合素结合并经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别 加入150 ii 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色10分钟后，在96孔酶标板每孔中分别 加入浓度1M的H2S04溶液30 ii 1，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度； 根据测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基 的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。
6.按照权利要求l所述的鉴定方法，其特征在于，该方法为取合浦珠母贝的外套膜细 胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养4天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将 不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养4天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养 基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶 联免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出 特异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小 鼠体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白 进行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；分别取20mM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多 克隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为10yg/ml、pH 值为9. 4的多克隆抗体稀释液，分别取该多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶 标板，在该96孔酶标板的每孔中分别加入150 iU多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件 下，孵育2小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸 缓冲液洗涤4次；按重量比，分别取羊血清5%、牛血清白蛋白5%和纯水90%，混合形成封 闭液；分别取多克隆抗体孵育后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板 每孔中分别加入150 iU封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭2小时，使96孔酶标板每孔 内多克隆抗体与96孔酶标板孔壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套 膜分泌的基质蛋白的培养基和完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌 的基质蛋白的培养基各250 ii 1分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照， 然后，在37t:的条件下，孵育2小时，使96孔酶标板孔内的培养基中的基质蛋白与多克隆抗 体结合，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4次； 分别取碳酸钠缓冲液和制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用碳酸钠缓冲液稀释，制成浓 度为10ii g/ml、 pH值为9. 4的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与 多克隆抗体结合后并经洗涤的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g 单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37t:的温度下，孵育2h，使单克隆抗体与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用磷 酸缓冲液洗涤4次；按体积比1 : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲 合素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到 辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液 和单克隆抗体与基质蛋白结合后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加 入150iU辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37t:的温度下孵育2小时，使 96孔酶标板每孔内的单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96 孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml 柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀， 得到混合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 1双氧水的比例，将双氧水 加入混合液中，制得邻苯二胺底物溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与 辣根过氧化物酶标记亲合素结合并经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别 加入150iU邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色30分钟后，在96孔酶标板每孔中分别 加入浓度1M的H2S04溶液30 1，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度； 根据测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基 的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。
7.按照权利要求l所述的鉴定方法，其特征在于，该方法为取合浦珠母贝的外套膜细 胞，利用普通培养基采用组织块法原代培养3天，然后，根据需鉴定的剌激因子的种类，将 不同剌激因子分别加入该培养基中，再培养3天，得到含有外套膜分泌的基质蛋白的培养 基；取BALB/c小鼠进行4次免疫，将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤SP2/0细胞融合，采用酶联 免疫吸附试验的方法筛选出阳性杂交瘤细胞，将该阳性杂交瘤细胞进行克隆，并筛选出特 异性识别基质蛋白的单克隆杂交瘤细胞，将该单克隆杂交瘤细胞注射到正常BALB/c小鼠 体内，获取该小鼠的腹水，将该腹水亲和纯化获得单克隆抗体；取新西兰兔，用基质蛋白进 行4次免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；分别取20rnM碳酸钠缓冲液和取得的基质蛋白多克 隆抗体，用碳酸钠缓冲液对该基质蛋白多克隆抗体进行稀释，制成浓度为6ii g/ml、 pH值为 9. 3的多克隆抗体稀释液，分别取该多克隆抗体稀释液和Costar公司生产的96孔酶标板， 在该96孔酶标板的每孔中分别加入125 iU多克隆抗体稀释液，置于4t:的温度条件下，孵 育1. 5小时，使多克隆抗体与96孔酶标板的孔壁结合，将孵育后的96孔酶标板用磷酸缓 冲液洗涤4次；按重量比，分别取羊血清4%、牛血清白蛋白4%和纯水92%，混合形成封闭 液；分别取多克隆抗体孵育后并经洗涤的96孔酶标板和制得的封闭液，在该96孔酶标板每 孔中分别加入125 iU封闭液，然后，在37t:的温度下，封闭1. 5小时，使96孔酶标板每孔 内多克隆抗体与96孔酶标板孔壁未结合的位点封闭；分别取普通培养基、制得的含有外套 膜分泌的基质蛋白的培养基和完成封闭的96孔酶标板，将普通培养基和含有外套膜分泌 的基质蛋白的培养基各250 ii 1分别加入该96孔酶标板的孔内，每个样品设4个平行对照， 然后，在37t:的条件下，孵育1.5小时，使96孔酶标板孔内的培养基中的基质蛋白与多克隆 抗体结合，之后，用磷酸缓冲液将基质蛋白与多克隆抗体充分结合后的96孔酶标板洗涤4 次；分别取碳酸钠缓冲液和制得的单克隆抗体，将该单克隆抗体用碳酸钠缓冲液稀释，制成 浓度为6ii g/ml、pH值为9. 3的单克隆抗体稀释液，将该单克隆抗体稀释液加入基质蛋白与 多克隆抗体结合后并经洗涤的96孔酶标板孔内，控制96孔酶标板每孔内分别加入100 ii g单克隆抗体稀释液，之后，将加入单克隆抗体稀释液的96孔酶标板置于37t:的温度下，孵 育1. 5h，使单克隆抗体与基质蛋白结合，将单克隆抗体与基质蛋白结合后的96孔酶标板用 磷酸缓冲液洗涤4次；按体积比1 : 1500，分别取Sigma公司生产的辣根过氧化物酶标记亲 合素和辣根过氧化物酶标记亲合素稀释液，对辣根过氧化物酶标记亲合素进行稀释，得到 辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液；分别取制得的辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液 和单克隆抗体与基质蛋白结合后并经洗涤的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔内分别加 入150 iU辣根过氧化物酶标记亲合素稀释溶液，然后，置于37°C的温度下孵育1. 5小时，使 96孔酶标板每孔内的单克隆抗体与辣根过氧化物酶标记亲合素结合，之后，将孵育后的96 孔酶标板用磷酸缓冲液洗涤4次；分别取邻苯二胺和pH值为5. 0的柠檬酸缓冲液，按10ml 柠檬酸缓冲液中加入10mg邻苯二胺的比例，将邻苯二胺加入柠檬酸缓冲液中，混合均匀， 得到混合液，在该混合液使用前，按每10ml该混合液中加入18 ii 1双氧水的比例，将双氧水 加入混合液中，制得邻苯二胺底物溶液；分别取制得的邻苯二胺底物溶液和单克隆抗体与 辣根过氧化物酶标记亲合素结合并经洗涤后的96孔酶标板，在该96孔酶标板每孔中分别 加入150 ii 1邻苯二胺底物溶液，进行避光显色，显色20分钟后，在96孔酶标板每孔中分别 加入浓度1M的H2S04溶液30 ii 1，终止反应，然后，采用酶标仪在490nm波长下测定吸光度； 根据测得的490nm波长下的吸光度，通过对比加入剌激因子的培养基和空白对照组培养基 的吸光度值，比较基质蛋白浓度变化，鉴定该剌激因子是否促进基质蛋白的分泌。
全文摘要
鉴定矿化刺激因子的基质蛋白单克隆抗体及鉴定方法，该单克隆抗体专一性识别合浦珠母贝基质蛋白；其鉴定方法为将合浦珠母贝的外套膜细胞培养得到原代培养的培养基，将需鉴定的刺激因子，分别加入该培养基中，再培养得到细胞培养基；采用杂交瘤法获得小鼠单克隆抗体；用基质蛋白对新西兰兔进行免疫，取得基质蛋白多克隆抗体；用该单克隆抗体建立高特异性和灵敏性的检测方法；同时，在不同刺激因子的存在下，检测原代培养的合浦珠母贝外套膜细胞基质蛋白分泌变化。本发明为研究矿化相关基质蛋白的调控提供了新方法，从而为矿化模型的研究奠定了基础。
文档编号C07K16/18GK101709090SQ20091021929
公开日2010年5月19日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者上官俊龙, 刘晓军, 周玉娟, 张荣庆, 李琪, 谢莉萍 申请人:清华大学