衍生自前胃胞外基质的组织支架的制作方法

衍生自前胃胞外基质的组织支架的制作方法
【专利摘要】本发明涉及开发源自反刍动物前胃的胞外基质(ECM)支架。此类基质可用于许多临床和治疗应用，包括伤口修复、组织再生和乳房重建。此外本发明的特征还在于从哺乳动物器官，包括但不限于反刍动物前胃分离ECM支架的方法。该方法包括在组织两侧产生透壁渗透流。本发明的特征还在于在各个ECM薄片之间设置含有聚合物的层叠ECM支架。该聚合物可任选含有生物活性分子以增强该支架的功能。
【专利说明】衍生自前胃胞外基质的组织支架
[0001]本发明专利申请是国际申请号为PCT/NZ2009/000152，国际申请日为2009年7月30日，进入中国国家阶段的申请号为200980130752.7，名称为“衍生自前胃胞外基质的组织支架”的发明专利申请的分案申请。
[0002]相关申请
[0003]本申请要求2008年7月30日提交的美国临时申请号61/137，367和2009年4月24日提交的美国临时申请号61/172，671的优先权。以上申请的全部内容通过引用纳入本文。
_4] 发明背景
[0005]胞外基质(ECM)在为组织生长和再生提供最佳化学和结构环境中起重要作用。传统上从去细胞化(decellularised)的人和动物真皮制备用于组织再生的ECM支架，而所述真皮从各种器官、各种动物粘膜下层和基底膜来源分离。这些支架促进组织再生，并且在免疫学上良好耐受。普通粘膜下层的组织移植组合物源自小肠、膀胱和简单的腺胃(参见，例如U.S.4，902，508、U.S.5，554，389和U.S.6，099，567，其全部内容通过引用纳入本文)。
[0006]虽然ECM支架的制备和应用中已取得进展，但尚未鉴定到理想的支架组合物。理想的支架是非过敏性、非致癌性、连续应激下在机械上稳定、多孔性足以毛细管化(capiIIarisation)、能促进和引导合适的细胞和血管内生长、与宿主组织有相似顺应性、耐感染、不形成血栓、廉价并能变成原组织的完全功能类似物。具有这些特性的ECM支架可用于各种临床应用，包括伤口修复和软组织再生。
[0007]发明概沭
`[0008]本发明提供源自反刍动物前胃的胞外基质(ECM)支架，在本文也称为“前胃基质”(FM)支架。本发明的FM支架提供优于现有组织支架的许多优点，可用于各种临床和治疗领域，包括伤口修复和组织再生。此外，本发明提供从哺乳动物器官，包括但不限于反刍动物前胃产生ECM支架的改进方法。在具体的实施方式中，本发明FM支架可源自属于山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)的反刍动物,例如山羊(Capraaegagrus hircus)、牛(Bos taurus)或绵羊(Ovis aries)。
[0009]因此，在第一方面，本发明的特征在于包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层(propria-submucosa)的ECM的组织支架(FM支架)。在具体的实施方式中，所述固有-粘膜下层来自前胃的瘤胃、网胃或重瓣胃。这些组织支架通常具有浮雕状内腔表面(contouredluminal surface)。本发明的ECM组织支架还可含有去细胞化的组织,包括上皮组织、基底膜或肌层和它们的组合。组织支架还可包含一种或多种纤丝蛋白，包括但不限于胶原1、胶原III或弹性蛋白和它们的组合。在其它实施方式中，组织支架可包含一种或多种生长因子，包括但不限于:FGF-2、TGFbl、TGFb2或VEGF和它们的组合。在还有其它实施方式中，所述组织支架可包含一种或多种糖胺聚糖，包括但不限于:透明质酸和硫酸乙酰肝素及它们的组合。在另一实施方式中，所述组织支架可包含一种或多种粘连蛋白，包括但不限于胶原IV或层粘连蛋白和它们的组合。
[0010]可将本发明FM支架制成各种形式，例如单一薄片或包含多层FM的层叠薄片。在某些实施方式中，所述FM支架包含2-15个层叠薄片。可通过缝线或缝合线将此类层叠薄片结合在一起。或者，可通过一个或多个薄片之间的聚合物将层叠薄片结合在一起。在一个实施方式中，通过缝线或缝合线连接各层叠薄片，并且在一个或多个薄片之间还含有聚合物。在另一实施方式中，层叠组织支架包含设置在各层叠薄片之间的聚合物。聚合物可以散布在薄片之间，或者可以聚合物层的形式均匀分散。本发明FM支架中可利用任何合适的聚合物，包括但不限于:胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。
[0011]在【具体实施方式】中，聚合物还包含生物活性分子，例如小分子或肽。生物活性分子可以非共价掺入聚合物，例如，作为混悬液、包封成颗粒、微粒或胶体，或作为它们的组合物。也可采用连接生物活性分子与聚合物的任何合适的化学方法将生物活性分子共价掺入聚合物。生物活性分子可以是任何治疗所需的分子，例如生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂或抗血管生成剂。在示范性实施方式中，聚合物包含FGF2、NGF、多西环素、阿莫西林和聚-L-赖氨酸中的一种或多种。
[0012]在另一【具体实施方式】中，FM支架的宽度为至少10cm。例如，所述支架的宽度为至少10cm，长度为至少10cm。因此，某些FM支架可具有IOOcm2以上，例如400cm2的表面积。在一个实施方式中，FM支架的单一或层叠薄片是穿孔的。在另一实施方式中，FM经流化或微粉化。
[0013]本发明FM支架的双轴强度通常高于其它胃肠或泌尿生殖来源的支架。因此，在具体的实施方式中，FM支架的平均双轴强度为至少80N或更高。
[0014]本发明的组织支架可用于多种领域，包括但不限于:覆盖组织缺陷(tissued e f i c i t)或加强软组织。在具体的实施方式中，所述组织缺陷或软组织的宽度为至少IOcm0在另一实施方式中，所述组织缺陷或软组织的宽度为至少10cm，长度为至少10cm。在还有另一实施方式中，所述组织缺陷或软组织的表面积为至少100cm2。
`[0015]因此，一方面，本发明的特征在于诱导受损组织修复的方法，包括使该受损组织接触本发明FM支架，例如，包含反刍动物固有-粘膜下层的ECM的支架。本发明的特征还在于刺激软组织再生的方法，包括使该软组织接触本发明FM支架。
[0016]当FM支架与组织接触时，该FM支架能增加位于该支架附近的细胞增殖。此外，FM支架可促进其所粘附的组织内的血管化。因此，在另一方面，本发明提供刺激组织中细胞增殖的方法，包括使该组织接触FM支架，从而刺激细胞增殖。本发明还提供诱导组织的血管化的方法，包括使该组织接触FM支架，从而在该组织内发生血管化。
[0017]一方面，本发明的特征在于支持患者的乳房组织的可植入组织支架器件，其中所述器件包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质。所述乳房组织可包含乳房假体，即乳房植入物。可将所述组织支架器件制成包含两层或多层胞外基质的层叠薄片。在具体的实施方式中，层叠薄片包含2-15层胞外基质。
[0018]所述组织支架器件可以是平的，或者其可具有一定凹度。在一个实施方式中，可通过缝线或缝合线将所述器件的各层胞外基质固定在一起。所述胞外基质可以穿孔或不穿孔。在一些实施方式中，所述器件具有月牙形形状。在其它实施方式中，所述器件具有椭圆形状。
[0019]在另一方面，本发明提供支持患者的乳房组织的方法，包括将前述组织支架器件安置在该患者中相对于乳房组织的支持位置。在一个实施方式中，所述乳房组织包含乳房假体。在另一实施方式中，所述乳房组织包含天然组织。在具体的实施方式中，安置组织支架包括覆盖乳房组织的下部和侧部。
[0020]在另一方面，本发明提供通过安置在各薄片间的聚合物层叠的包含两个或更多个胞外基质薄片的组织支架。所述支架可包含选自下组的组织的粘膜下层的胞外基质:小肠、胃、膀胱、心包和真皮。在具体的实施方式中，所述胞外基质包含胶原。所述聚合物可包含胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。
[0021]在以上方面的【具体实施方式】中，所述聚合物还包含生物活性分子。所述生物活性分子可以非共价或共价连接于聚合物。在一个实施方式中，所述生物活性分子可以是小分子或肽，例如生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂、抗血管生成剂或它们的组合。示范性生物活性分子包括FGF2、NGF、多西环素、聚-L-赖氨酸和它们的组合。
[0022]在还有另一方面，本发明提供了通过将组织整体或其一部分内的诸层分离和/或去细胞化而产生ECM组织支架的方法。所述方法包括在所述组织的两侧产生透壁渗透流，从而将组织整体或其一部分内的诸层分离和/或去细胞化。可将透壁渗透流从组织整体或其一部分的内腔引向外腔侧(abluminal side)。这可通过,例如将组织在高渗和低渗溶液之间分开而实现，从而将透壁渗透流从低渗溶液引向高渗溶液。该方法还包括除去组织层的整体或其一部分，所述组织层包括上皮组织、基底膜或肌层和它们的组合。
[0023]在具体的实施方式中，本发明方法包括将第一溶液包封在器官或组织(或其一部分)内，并将该器官或组织(或其一部分)浸入相对于第一溶液高渗的第二溶液内。该方法还包括从第二溶液中取出该器官或组织，并将该器官或组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是高渗的第三溶液中，以便例如使该组织进一步去细胞化。
[0024]在备选实施方式中，所述方法包括将第一溶液包封在器官或组织(或其一部分)内，并将该器官或组织(或其一部分)浸入相对于第一溶液低渗的第二溶液内，任选随后将该器官或组织或其一部分浸入`相对于第一溶液也是低渗的第三溶液中。
[0025]高渗和低渗溶液可包含，例如水和任选的至少一种缓冲液、洗涤剂或盐。高渗溶液含有的溶质浓度可高于低渗溶液。在具体的实施方式中，高渗溶液包含4M NaCl，低渗溶液包含0.028%Triton X-200和0.P/oEDTA。在另一【具体实施方式】中，低渗溶液包含0.1%SDS。在还有另一实施方式中，低渗溶液包含0.028%Triton X_200、0.1%EDTA和0.1%SDS。
[0026]可在低温，例如4 V或更低(例如，约2 °C -约4°C )实施本发明方法。还可在室温下或接近室温(例如，约18°C -约24°C )实施本发明方法。所述方法使组织层分离和去细胞化的时间还可能短于采用其它方法的时间。在【具体实施方式】中，在36个小时或更短、更优选在24个小时或更短时间内使组织层分离和去细胞化。在其它实施方式中，在6小时或更短时间内(例如，5小时或更短、4小时或更短或3小时或更短)使组织层分离和去细胞化。
[0027]本发明方法可用于任何合适的组织来源或器官。在具体的实施方式中，组织包含角化复层鳞状上皮。在其它具体的实施方式中，组织源自反刍动物，例如山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)动物的前胃。在还有其它实施方式中，组织源自前胃的瘤胃、网胃或重瓣胃。此类组织可任选膨胀以增加穿过组织层的透壁渗透流，从而进一步促进分离和去细胞化。[0028]附图简沭
[0029]图1是(A)前胃壁和⑶腺胃壁的示意性剖面图，均处于未处理状态和STOF处理后。
[0030]图2显示用于乳房增大、重塑或乳房固定术的FM支架的两个示范性形状。㈧描述了月牙形支架。(B)描述椭圆形支架。
[0031]图3显示通过产生穿过器官的透壁渗透流来处理该器官的一个实施方式。
[0032]图4描述了采用STOF处理组织以产生含断裂基底膜的去细胞化FM支架的示范性实施方式。
[0033]图5显示STOF处理前后组织的总核酸含量。
[0034]图6显示前胃组织的表面积与STOF处理后前胃总容积之间的线性关系。
[0035]图7显示透壁渗透流造成的组织重量改变。随着组织水合增加，流体穿过并进入组织造成重量增加。
[0036]图8显示STOF处理完成时STOF溶液中层粘连蛋白的蛋白质印迹分析检测。在图8中，泳道I表示Magic标记(InvitrogenTM);泳道2表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.028% Triton X-200溶液的样品；泳道3表示STOF方法完成后从前胃内侧取得的4Μ NaCl溶液的样品；泳道4表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.028% TritonX-200+0.1 % EDTA溶液的 样品；泳道5表示STOF方法完成后从前胃外侧取得的0.1% SDS溶液的样品；泳道6表示层粘连蛋白标准品。
[0037]图9显示球爆检验(Ball Burst test)的结果,显示了 FM的相对强度。
[0038]图10图示了多叠层绵羊FM产品的球爆强度。采用球爆检验测定单一或多叠层绵羊FM产品的双轴强度，该检验按照ASTM D3797-89“编织物破裂强度的标准检验方法:恒速穿越(CRT)球爆检验(Standard Test Method for Bursting Strength of Knitted Goods,Constant-Rate-of-Traverse (CRT) Bal 1-burst Test) ”，利用装有球爆压缩箱(ball-burstcompression cage)的Instron5800系列机电检测器，从而将25.4mm不镑钢球以305+/-13毫米/分钟的进料速度推向测试材料，直至衰坏。利用IkN测压仪记录衰坏时的最大压缩负载(N)。误差棒代表至少5份样品的标准误差。
[0039]图11比较了 4-叠层绵羊FM与市售可得移植物产品的标准化最大压缩负载。误差棒代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。
[0040]图12代表单轴检验的结果，显示了 FM的相对强度。
[0041]图13比较了绵羊FM单一和多叠层产物的强度。(A)衰坏时的最大负载(N)；⑶最大切线刚度(N/mm) ；(C)最大伸长(mm) ； (D)弹性模量(杨氏)(GPa) ； (E)屈服应力(MPa)；和(F)厚度。利用Instron5800系列机电检测器测定衰坏时单一和多叠层产物的最大负载。将各种材料切割成0.6cm宽的狗-骨形样品。夹住样品，量器长度为7.5cm,以25.4毫米/分钟的速度伸长直至衰坏。利用500N测压仪记录负载(N)。从负载(N)与伸长(mm)曲线的斜率计算刚度。利用从产物厚度计算的截面积将负载与伸长曲线转化为应力(N/m2)与应变曲线。后一曲线的斜率用于计算弹性模量或杨氏模量(GPa)。误差棒代表至少5份样品的标准误差。
[0042]图14比较了 1-和2-叠层绵羊FM产物与市售可得硬脑膜修复产品的屈服应力。误差代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。[0043]图15比较了多叠层绵羊FM产物的缝合保留强度(suture retention strength)。按照ANSI/AAMI VP20 - 1994牛顿检测心血管植入物血管假体的指南(Guidelines forCardiovascular Implants Vascular Prostheses Measured in Newton’s)来检验多叠层绵羊FM产物的缝合保留强度。利用2mm咬合深度(bite-depth)的缝线在4cm x2.5cm样品中进行缝合。利用装有IOON测压仪的InstrOn5800系列机电检测器记录衰坏时的负载，采用的前进速度是100毫米/分钟。将衰坏时的负载定义为观察到的负载有90%降低。样品的自由端维持在25_虎钳夹口中，而缝线通过不锈钩连接于相对的夹钳。误差棒代表至少6份样品的标准误差。
[0044]图16比较了绵羊FM产物和硬脑膜修复产品的标准化缝合保留强度。误差代表至少5份独立样品，或公布数据的标准误差。
[0045]图17比较了 4-叠层绵羊FM产物和市售可得植入物基质的标准化缝合保留强度。误差代表至少5份样品，或公布数据的标准误差。Surgisis?未有误差报道。采用IOmm的咬合深度检验Alloderm?和Strattice?,采用2mm的咬合深度检验4-叠层绵羊FM和Surgisis?。
[0046]图18显示在猪伤口愈合研究中，在猪背上作出的全厚度切口的示例性布局。
[0047]图19显示伤口愈合研究期间，组织活检中ECM支架的持久性。
[0048]图20图示了伤口愈合期间对细胞增殖的定量测定。用绵羊FM(1_叠层、2-叠层)、SIS处理受伤的组织，或不作处理，采用IHC和数字方法计算从再生真皮层获得的3个40x框中的Ki67-阳性细胞总数。#Ρ〈0.01采用单向AN0VA，相对于未处理对照的显著性。
[0049]图21图示了定量测定 用绵羊FM(1_叠层和2-叠层)、SIS处理的受伤组织，或不作处理的受伤组织中的血管。(A)描述了对各组织活检分析的每框中计算的平均血管总数。误差棒代表了在所示时间点对各处理组作分析的20次活检的标准误差。**Ρ〈0.01和*Ρ〈0.05采用单向AN0VA，相对于未处理对照的显著性。(B)描述了在所示时间点，血管(小的、中等的和大的)数与各次处理观察到的血管总数的比例。(C)描述了每框中计算的小血管(300 - 500 μ m2)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。(D)描述了每框中计算的中等血管(500 - 1500 μ m2)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。(E)描述了每框中计算的大血管(>1500 μ m2)的平均数。取所研究的5只动物分析的所有框的平均数。误差棒代表了在所示时间点各处理组的20个分析框的标准误差。
[0050]发明详沭
[0051]本发明涉及开发源自反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质(ECM)支架(FM支架)，本文称为“前胃基质”(FM)。FM支架的特征不同于源自包括腺胃在内的其它器官的ECM支架。这些特征使得FM支架尤其适用于涉及组织再生和修复的临床应用。本发明还涉及从哺乳动物器官(包括但不限于前胃)产生ECM支架的改进方法。
[0052]1.定义
[0053]为更易于理解本发明，首先定义某些术语。
[0054]本文所用的术语“前胃基质”(缩写为FM)指含有反刍动物前胃的固有-粘膜下层的ECM支架。[0055]本文所用的术语“固有-粘膜下层”指反刍动物前胃中的固有膜和粘膜下层组合形成的组织结构。
[0056]本文所用的术语“固有膜”指固有-粘膜下层的内腔部分，包括胞外基质的致密层。
[0057]本文所用的术语“反刍动物”指具有四室胃的哺乳动物。这些室包括前胃，由瘤胃、网胃或重瓣胃组成，以及称为皱胃的第四室。反刍动物的非限制性例子包括属于山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)或绵羊属(Ovis)的哺乳动物。
[0058]本文所用的术语“源自”指ECM的组织来源或起源。ECM可源自组织的整体或其一部分，从而它们保留该组织的至少一种组分，例如固有-粘膜下层。
[0059]本文所用的术语“固有-粘膜下层”指反刍动物前胃壁的一部分，由固有膜和粘膜下层构成。
[0060]本文所用的术语“封闭透壁渗透流”(STOF)指使组织或器官的各层去细胞化和/或分离的方法，其中穿过该组织或器官壁的整体或一部分产生透壁渗透流。
[0061]本文所用的术语“高渗”指溶质浓度高于另一溶液的溶液。
[0062]本文所用的术语“低渗”指溶质浓度低于另一溶液的溶液。
[0063]本文所用的术语“分层”指分开组织或器官内的各层。
[0064]本文所用的术语“去细胞化”指从组织或器官的一部分，例如ECM中去除细胞和它们相关的碎片。
[0065]本文所用的术语“乳房重建`”指打算改变患者乳房的大小、形状、位置或外观的任何方法。此类方法包括但不限于:乳房增大、乳房固定术(即，乳房提升)和乳房切除术后重建。
[0066]以下各个小章节进一步详细描述了本发明的各方面。除非另有限定，本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的意义。如有冲突，以本发明(包括定义)为准。虽然可采用与本文所述那些相似或等价的方法和材料来实施本发明，但以下描述了合适方法和材料的例子。本文所述材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。本文引述的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用全文纳入本文。
[0067]I1.解剖反刍动物的前胃
[0068]反刍动物(例如，牛、绵羊和山羊)具有复合式的胃，与其它哺乳动物的简单胃相比，区别在于该复合式胃实质上更大且分成4个部分:瘤胃、网胃、重瓣胃和皱胃。这些部分各自具有不同的物理和组织学结构。瘤胃、网胃和重瓣胃统称前胃。瘤胃和网胃的结构和功能密切相关，常称为瘤网胃(rumenoreticulum)。仅有该复合式胃的最后一室，即皱胃的结构类似于简单的腺胃。前胃和简单腺胃之间的解剖学差异反映出它们的功能差异。前胃的基本功能是储存、发酵和吸收，而简单腺胃执行分泌和消化功能。
[0069]因此，前胃的总体解剖学和组织学特征显著不同于腺胃。前胃的解剖学特征示于图1A，腺胃的示于图1B。重要的是，前胃不含有腺体粘膜，而是由非腺体角化复层鳞状上皮构成，其由角质层、颗粒层、棘层和基底层构成，在许多方面类似于皮肤的结构。上皮位于前胃的内腔侧，通过基底膜与其下的固有-粘膜下层分开。前胃的外腔侧含有称为肌层的肌肉层。[0070]上述胃粘膜下层组成源自腺胃壁，其含有以下各层:粘膜(包括上皮层，网状或细小蜂窝状组织构成的固有层和腺体层)、粘膜下层(有蜂窝状组织构成并缺乏腺体)、肌层(由三层肌肉组成)和浆膜(围绕肌肉层的松散结缔组织外的间皮层)。胃壁内存在腺体层是单胃哺乳动物的腺胃或简单胃的特征。反刍动物的复合式胃中仅有最后一室，即，皱胃含有该腺体层。前胃和腺胃的其它特征描述于表1。
[0071]表1.前胃和腺胃的特征
[0072]
【权利要求】
1.一种将组织整体或其一部分内的诸层分离或去细胞化的方法，包括在所述组织的两侧之间产生透壁渗透流，从而将组织整体或其一部分内的诸层分离或去细胞化。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，从所述组织的内腔到非内腔侧产生透壁渗透流。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，包括除去选自下组的组织层的整体或其一部分:上皮组织、基底膜、肌层和它们的组合。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织包含角化复层鳞状上皮。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:将第一溶液包封在组织或其一部分内，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液高渗的第二溶液内。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:从所述第二溶液中取出该组织或其一部分，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是高渗的第三溶液中。
7.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:将第一溶液包封在组织或其一部分内，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液低渗的第二溶液内。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤:从所述第二溶液中取出该组织或其一部分，并将该组织或其一部分浸入相对于第一溶液也是低渗的第三溶液中。
9.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含水，任选包含至少一种缓冲液、洗涤剂或盐。
10.如权利要求7或8所述的方法，其特征在于，所述第一溶液包含4MNaCl。
11.如权利要求10所述的`方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200和0.1%EDTA，所述第三溶液包含0.028%SDSo
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.1%SDS，所述第三溶液包含 0.028%Triton X-200 和 0.P/oEDTA。
13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在2°C-4°C的温度下进行不到36个小时。
14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法在4°C下进行。
15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法进行不到24小时。
16.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二溶液包含0.028%Triton X-200、0.1%EDTA 和 0.1%SDSο
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述方法在18°C_24°C的温度下进行。
18.如权利要求16或17所述的方法，其特征在于，所述方法进行不到6小时。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织或其一部分膨胀以增加所述透壁渗透流。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织是整个器官或其一部分。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织源自反刍动物的前田冃?
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述组织是瘤胃。
23.如权利要求21或22所述的方法，其特征在于，所述反刍动物属于选自下组的属:山羊属、牛属、鹿属和绵羊属。
24.如权利要求23所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是绵羊。
25.按照权利要求1-24中任一项所述方法产生的组织支架。
26.一种形成组织支架的方法，包括实施权利要求1-24中任一项所述的方法。
27.如权利要求26所述的方法，其特征在于，所述组织支架包含反刍动物前胃的固有-粘膜下层的胞外基质。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述固有-粘膜下层来自瘤胃。
29.如权利要求27或28所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的去细胞化组织:上皮、基底膜、肌层和它们的组合。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的纤丝蛋白:胶原1、胶原II1、弹性蛋白和它们的组合。
31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的生长因子:FGF-2、TGFbl、TGFb2、VEGF和它们的组合。
32.如权利要求27-31中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的糖胺聚糖:透明质酸、硫酸乙酰肝素及它们的组合。
33.如权利要求27-32中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架还包含选自下组的粘连蛋白:纤连蛋白、层粘连蛋白、胶原IV和它们的组合。
34.如权利要求27-33中任一项`所述的方法，其特征在于，所述组织支架具有浮雕状内腔表面。
35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架制成单一或层叠的薄片。
36.如权利要求27-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述组织支架包含2-12个层叠的薄片。
37.如权利要求36所述的方法，其特征在于，所述组织支架在两个或更多个层叠薄片之间还包含聚合物。
38.如权利要求37所述的方法，其特征在于，所述聚合物选自下组:胶原、壳聚糖、藻酸盐、聚乙烯醇、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和它们的组合。
39.如权利要求37或38所述的方法，其特征在于，所述聚合物还包含生物活性分子。
40.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子分散在整个聚合物层中。
41.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子非共价连接于所述聚合物。
42.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子共价连接于所述聚合物。
43.如权利要求39所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子是小分子或多肽。
44.如权利要求43所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子选自下组:生长因子、抗微生物剂、镇痛剂、止血剂、促血管生成剂、抗血管生成剂和它们的组合。
45.如权利要求44所述的方法，其特征在于，所述生物活性分子选自下组:FGF2、NGF、多西环素、聚-L-赖氨酸和它们的组合。
46.如权利要求36-45中任一项所述的方法，其特征在于，所述层叠的薄片通过缝线或缝合线固定在一起。
47.如权利要求27-46中任一项所述的方法，其特征在于，所述薄片的宽度是至少IOcm,长度是至少10cm。
48.如权利要求27-47中任一项所述的方法，其特征在于，所述薄片的平均破裂强度是至少80N。
49.如权利要求27-48中任一项所述的方法，其特征在于，所述反刍动物属于选自下组的属:山羊属(Capra)、牛属(Bos)、鹿属(Cervus)和绵羊属(Ovis)。
50.如权利要求27-4 9中任一项所述的方法，其特征在于，所述反刍动物是绵羊。
【文档编号】A61L27/36GK103751842SQ201310549035
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2009年7月30日 优先权日:2008年7月30日
【发明者】K·D·约翰逊, B·C·H·梅, B·R·沃德 申请人:米辛瑟斯有限公司