一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法与流程

本发明涉及一种脱细胞基质，特别涉及一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法。

背景技术：

心血管病在我国乃至全世界已成为发病率及死亡率最高的疾病之一，严重威胁人类健康。其中，终末期心脏病患病率的增加已成为心血管疾病中重要的医疗问题，而心脏的原位异体移植是当前针对其唯一有效的治疗手段。然而，心脏移植手术目前却面临着诸多挑战，如工体严重不足以及移植后免疫排斥等问题，极大限制了临床应用。

心脏全器官脱细胞机制处理的目的是在尽可能清楚细胞内物质成分的情况下而更多保留细胞外基质有效成分(包括胶原、糖胺聚糖、可溶性生长因子等)。在以往研究中，尽管不断有新的脱细胞方法出现，但是由于不同脱细胞方法对细胞外基质各组分影响不尽相同，迄今为止尚且没有一种理想的脱细胞方法能够完整保持细胞外基质有效成分。

物理洗脱即利用冷冻、直接冲洗、超声法和搅拌法等方法将细胞成分去除。对于较为坚韧的组织(如肌腱、韧带等)，快速冷冻法最为常用。快速冷冻可以使组织和细胞内部形成大量冰晶，从而达到迅速破坏细胞膜，使细胞溶解的目的。通过这种暴力的方法破坏细胞还不够，要彻底洗脱细胞成分，还需再利用冲洗法通过灌流液在器官脉管结构内不断地循环冲洗，方可达到目的。另外，超声和搅拌法通常会结合化学洗脱法一起进行。利用超声或搅拌首先使细胞物理破碎，再利用化学洗涤剂将破碎的细胞成分逐渐洗脱。而心脏是介于坚韧和柔软之间的器官，其脱细胞通常不会采用过于暴力的方法，以免破坏结构。

可用于洗脱的化学物质种类繁多，最常见的有酸碱洗脱法、高渗-低渗溶液洗脱法和洗涤剂洗脱法。酸碱洗脱的原理均是利用化学酸/碱性环境破坏分子结构，最终达到清除细胞的目的。其中，过氧乙酸是一种薄层组织常用的酸性洗脱剂，它能够在清除核酸成分的同时较好地保留细胞外基质成分。而醋酸则会溶解胶原成分，但对gag保留较为完整。另外，碱性洗剂(氢氧化钙、氢氧化钠、硫化钠等)作用强烈，对细胞和ecm破坏较大，多被用在真皮组织早期的毛发脱除上。高渗-低渗洗脱原理主要是利用高渗盐溶液溶解dna，而低渗液使细胞溶解，从而清除细胞成分。在实际应用中，经常将组织在高渗-低渗液中交替浸泡而达到洗脱目的。洗涤剂是指非离子、离子和两性离子洗涤剂，包括triton-x100、十二烷基磺酸钠(sodiumdodecylsulfonate，sds)等。其作用温和，易于操作，是目前针对心脏最常用的洗脱法。tritonx100是代表性非离子洗涤剂，它能有效地分离细胞膜-膜连接和膜-蛋白连接，而对蛋白-蛋白连接破坏较小。实验中应用triton-x100洗脱时间差异很大，从几个小时到几天不等，这主要是根据具体的器官组织和联合洗脱效果而定，如果洗脱时间过长，也会对层黏连蛋白和gag造成破坏。离子洗涤剂的代表是sds，它对细胞的破坏作用强于triton-x100，更适合洗脱较为坚韧的器官。但是使用sds洗脱必须要更加严格地控制时间及浓度，否则sds容易破坏ecm的超微结构并使生长因子大量流失。目前心脏脱细胞多联合应用sds和triton-x100。两性洗涤剂作用介于上述二者之间，常用的试剂有chaps、sb-10、sb16等，它们主要用于动脉和神经的脱细胞过程，并且常与triton-x100联合应用。

生物酶洗脱是利用酶解作用破坏细胞膜从而清除细胞成分的方法。常见的酶试剂有核酸酶、胰酶、胶原酶、dispase酶等。通常针对不同细胞成分使用对应的酶能够使其高效降解，另外还可以清除不需要的ecm组分。然而需要注意的是，残留的酶成分会降解ecm，甚至引起继发的免疫反应。核酸酶包括dna酶和rna酶，是对核苷酸序列的高效酶，主要用于组织溶解后核酸成分清除。胰酶是一种强效的丝氨酸蛋白酶，对于细胞和gag破坏效果小，但对胶原和弹力蛋白作用强烈，可用于洗脱的初始阶段，用来破坏组织超微结构，以利于其他洗脱剂的渗入，但要避免其对组织的过度破坏。胶原酶可破坏组织结构，只用于不需要保留组织结构的洗脱。

物理法脱细胞由于心脏属于比较柔软的组织器官，不适于暴力的脱细胞处理方法，其组织完整性、脉管结构及微构象易被破坏。单纯的tritonx100处理方式几乎无法对大鼠心脏进行脱细胞处理，细胞结构保存相对良好。利用胰蛋白酶方法制备的脱细胞基质，脉管结构很大程度上被破坏，不利于组织再生。尽管脱细胞领域不断取得新的进展，但是仍旧没有适用于心脏全器官脱细胞的方法，以求尽可能去除器官内驻留细胞的情况下，减少对细胞外各种基质成分的影响，从而获得具有组织特异性、三维超微结构、脉管结构和一定生物活性的良好支架材料。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法和应用。

一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)首先获取动物心脏，并置于含有肝素pbs溶液的玻璃器皿内，-70℃冷冻处理24h备用；

(2)将上述动物心脏放入4℃冰箱中缓慢解冻完全后，将16g规格的钝性针头插入主动脉，用线绳于心脏根部结扎系住；

(3)将心脏接入脱细胞灌流装置中，首先利用肝素pbs灌流5-15min，之后灌流1％sds溶液10-15h，去离子水冲洗30min后，1％ttiton灌流15-30min，之后利用pbs冲洗，每天换液4-5次，共清洗72-128h，上述灌流速度3ml/min；

(4)灌流后经过钴6o照射灭菌处理。

所述动物为鼠，人，羊，马，牛，骆驼或猪。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明设计合理的心脏全器官脱细胞体系，并对现有的心脏全器官脱细胞方法进行改进和优化，结合sds洗涤剂、tritonx100等按照不同洗脱顺序和时间配比进行脱细胞处理，以提高灌流液在心脏器官中的洗脱效果，为后期脱细胞基质的评价以及组织工程再造中的应用奠定基础。由本方法制备而成的心脏全器官脱细胞基质可以在去除心脏组织原有驻留细胞的条件下，保留了心脏原有的二级、三级脉管结构，超微构象以及细胞外基质组分。

附图说明

图1是大鼠心脏灌流脱细胞过程变化图。

图2是心脏全器官脱细胞基质与天然心脏对比电镜图。

图3是本发明心脏全器官脱细胞基质的细胞外基质检测图。

具体实施方式

下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

一种心脏全器官脱细胞基质的制备方法，按照如下步骤进行：

(1)首先获取大鼠心脏，置于含肝素pbs溶液的玻璃器皿内，-70℃冷冻处理24h备用；

(2)将上述大鼠心脏放入4℃冰箱中缓慢解冻完全后，将16g规格的钝性针头插入主动脉，用线绳于心脏根部结扎系住；

(3)将心脏接入脱细胞灌流装置中，首先利用肝素pbs灌流5min，之后灌流1％sds溶液10h，去离子水冲洗30min后，1％ttiton灌流15min，之后利用pbs冲洗，每天换液4-5次，共清洗72h，灌流速度3ml/min；

(4)灌流后经过钴6o照射灭菌处理。(辐射强度10kgy，1-10min)。

不同灌流阶段的大鼠心脏如图1-3所示，经过1％sds溶液灌流，1％ttiton灌流，pbs冲洗的处理步骤，心脏全器官脱细胞基质可以在去除心脏组织原有驻留细胞的条件下，保留心脏原有的二级、三级脉管结构，以及细胞外基质(组分胶原、可溶性生长因子、糖胺聚糖等)。

以上公开的仅为本发明的具体实施例，但是，本发明并非局限于此，任何本领域的技术人员能思之的变化都应落入本发明的保护范围。