一种猪脂肪细胞外基质的提取工艺的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于医学和生物材料技术领域，涉及一种猪的脂肪细胞外基质的提取方法。
【背景技术】
[0002]注射用填充材料在临床中可用于治疗面部凹陷、畸形，可用于改变患者的外形从而满足更高的审美要求，目前在临床中使用较多的注射用填充材料有透明质酸、胶原蛋白等，然而它们具有易于被吸收，生物活性差等缺陷。细胞外基质是由动物细胞合成并分泌到细胞外，分布在细胞表面或细胞间的大分子，主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。细胞外基质不仅为细胞提供了一个支持结构和附着位点，而且通过与细胞的粘附分子、生长调节因子、结合蛋白、蛋白水解酶以及酶抑制剂相互作用，而对细胞的粘附、迀移、增殖、分化以及基因表达的调控发挥重要的调节作用。由于细胞外基质具有以上生物活性作用，具有与天然组织器官相似的三维空间结构，其作为支架材料被广泛应用于组织工程中。目前已被成功提取细胞外基质的组织器官包括小肠粘膜、心脏瓣膜、血管、皮肤、神经、骨骼肌、胎盘、膀胱和肝脏。脂肪的来源广，可以从脂肪中提取到丰富的细胞外基质，研宄证明外基质作为生物材料能够促进多种组织再生。
[0003]目前被用作注射用填充材料的脂肪外基质主要是提取自抽脂患者的脂肪，冻干后的外基质被制备成粉末状，可以通过20ml注射器针头，从而达到注射用填充材料的效果。脂肪外基质粉末具有多孔样结构、表面积大、颗粒体积和形状具有高度的多样性，有利于细胞的粘附、增殖和迀移，在脂肪外基质和脂肪干细胞联合注射的实验中观察到，脂肪干细胞向脂肪细胞分化，同时周围组织血管和脂肪大量形成。目前文献报道(察鹏飞，高建华，陈阳等，人脂肪组织细胞外基质支架的构建，中华整形外科杂志，2012，28 (I)，55-60)的脂肪抽吸术获取的脂肪提取外基质的方法如下:收集同一患者脂肪组织约300ml，蒸馏水充分洗涤，将膨胀液及血液成分洗涤干净，低速离心机1000r/min离心3min，去除上层的游离脂滴及下层的水分，收集纯脂肪组织约100ml。共重复7次。向收集的脂肪组织中按脂肪:水分=2:1的比例加入50ml蒸馏水，转移至匀浆机，10000-12000r/min匀浆3min，将匀浆后的混合物3000r/min离心5min。去除上层的游离脂滴及中层的蒸馏水，底层乳白色沉淀物为ECM。加入同等体积的蒸馏水洗涤3-5次，将脂滴去除干净。收集ECMj^ 10ml，去除上层的水分。
[0004]目前技术存在的不足:(1)选用人的脂肪提取外基质，来源较少，不易批量生产，不易形成产业化；(2)运用人的脂肪外基质进行自体移植时，患者需要先进行抽脂手术，之后需要等待外基质的提取，再进行二次手术，增加了患者的痛苦和并发症发生的风险，并且体脂少或恶病质的患者抽脂手术不能顺利进行，无法获取足够的材料进行外基质的提取，从而限制了该技术的应用；(3)运用人的脂肪外基质进行异体移植时，涉及到了伦理问题，同样面临着脂肪来源少的问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的在于为克服上述现有技术的缺陷，采用猪脂肪作为原材料并提供一种新的细胞外基质提取工艺。
[0006]本发明采用以下技术方案实现上述目的:一种猪脂肪外基质提取方法，包括如下步骤:
[0007](I)将新鲜猪脂肪剪碎后用蒸馏水反复洗涤5-7次，直到洗去脂肪中混合的血液成分，将干净的脂肪碎块挤压成浆糊状，置入烧杯中称量体积；
[0008](2)将浆糊状的脂肪放入匀浆机中，并向匀浆机中加入等体积的蒸馏水，匀浆，匀浆机转速为12000rpm，在室温常压下匀浆5min ；
[0009](3)将匀浆后的组织悬液置于震荡摇床中震荡，可观察到白色脂肪与粘稠凝胶样物质逐渐分离，弃去上层脂肪与中层液体，加入等量蒸馏水，重复以上操作，直到全部脂肪分离出凝胶样物质；
[0010](4)将获取的凝胶样物质分装入50ml离心管中，向各个离心管中加入适量蒸馏水，置入离心机中离心，转速为lOOOrpm，在室温常压下离心3min，离心后弃上层液体，重复3次，最终获得的凝胶样沉淀即为猪的脂肪细胞外基质。
[0011]其中，所述的步骤(I)中，猪的脂肪取自皮下脂肪，品系不限。
[0012]所述的步骤(3)中，震荡摇床的转速为240rpm，震荡幅度为20mm，在常温常压下震荡 5min。
[0013]应用本发明确定的方法，可以成功提取猪脂肪外基质。本生产工艺与现有的人脂肪外基质提取工艺相比，采用了猪脂肪作为原料，其来源更为广泛，且不涉及伦理问题，可进行批量生产，克服了使用自体脂肪外基质的限制，对该材料进一步脱细胞处理后可生产为生物填充材料。
[0014]本发明工艺在脂肪匀浆之后，采取震荡法分离脂肪和脂肪外基质，文献报道(察鹏飞，高建华，陈阳等，人脂肪组织细胞外基质支架的构建，中华整形外科杂志，2012，28(1),55-60)使用300ml抽脂获取的人脂肪可以分离出1ml脂肪外基质，采用本发明分离方法60ml猪脂肪可以分离出5ml脂肪外基质，并且离心法需要使用离心管作为分离的容器，受到了容积的限制，降低了生产的效率，而震荡法分离可以采用大容积的烧杯或者烧瓶，使得产量大大提高。猪的脱细胞真皮在治疗烧伤患者的创伤中已经广泛应用，其具有排异反应低，组织相容性好的优点，本工艺同样采用猪作为提取脂肪的目标，因该生物的生物材料在临床中应用较广，同时该生物的脂肪含量高，获取更加容易。
[0015]本发明的主要优点在于:(1)猪的生物材料在临床中应用广泛，采用猪脂肪作为外基质来源，更加安全，来源更广且不涉及伦理问题，可以产业化批量生产，避免了原有方法中使用自体脂肪出现的材料不足以及获取困难的情况；(2)该工艺生产流程简单，生产材料简单，产率较原有方法有了很大提高，并且采用了全新的震荡法分离脂肪和脂肪外基质，突破了常规50ml离心管的容积限制，可以实现大规模生产。
【附图说明】
[0016]图1为:剪碎后的猪脂肪一匀浆前的猪脂肪一匀浆后的组织一震荡前的组织一震荡后的组织一离心后的组织一洗涤后的猪脂肪外基质各工序的示意图；
【具体实施方式】
[0017]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合【具体实施方式】，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。
[0018]实施例1
[0019](I)取新鲜猪肉的皮下脂肪，将猪脂肪剪碎后用蒸馏水反复洗涤5-7次，直至将脂肪中的血液成分洗去，将干净的脂肪碎块挤压成浆糊状，置入烧杯中称量体积为60ml ；
[0020](2)将浆糊状的脂肪置入匀浆机中，向匀浆机中加入60ml蒸馏水，匀浆，匀浆机转速为12000rpm，匀浆时间为5min，匀浆温度为室温，压力为大气压；
[0021](3)将匀浆后的组织悬液分装至大烧杯中，静置5分钟，烧杯中物质分层，烧杯上层为白色粘稠物质，下层为透明浑浊液体，将烧杯置于震荡摇床中震荡，震荡摇床的转速为240rpm，震荡幅度为20mm，震荡时间为5min，白色脂肪与粘稠凝胶样物质逐渐分离，弃去上层脂肪与中层液体，加入等量蒸馏水，重复以上操作，直到全部脂肪分离出凝胶样物质；
[0022](4)将获取的凝胶样物质分装入50ml离心管中，向各个离心管中加入适量蒸馏水，置入离心机中离心，转速为lOOOrpm，在室温常压下离心3min，离心后弃上层液体，重复3次，最终获得5ml凝胶样沉淀，即为猪的脂肪细胞外基质.
[0023]使用本发明的方法，成功从猪的脂肪中分离出的脂肪外基质，操作简便，提取效率高，值得使用和推广。
[0024]实施例2
[0025]为了说明本发明提取工艺的优势，我们选用猪作为脂肪来源，并采取常规的方法(察鹏飞，高建华，陈阳等，人脂肪组织细胞外基质支架的构建，中华整形外科杂志，2012，28(1)，55-60)进行脂肪外基质的提取。
[0026](I)由于抽脂手术获取的脂肪充满了肿胀液，呈液态，故第一步无法按照常规方法进行，第一步仍然按照本发明的方法制备浆糊状脂肪10ml ;
[0027](2)向收集的脂肪组织中按脂肪:水分=2:1的比例加入50ml蒸馏水，转移至匀楽机，12000r/min 勾楽 3min ；
[0028](3)将匀浆后的混合物分装入50ml离心管中离心，3000r/min，5min，混合物分为两层，上层为白色物质，下层为透明液体，并没有出现实施例1中的粘稠胶样物质。
[0029]该实施例的步骤(3)中，匀浆后的混合物呈白色团块状，向50ml离心管中转移的过程中十分麻烦，并且，按照常规方法离心后并没有分离出粘稠胶样物质。
[0030]尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。
【主权项】
1.一种猪的脂肪细胞外基质提取方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将新鲜猪脂肪剪碎后用蒸馏水反复洗涤5-7次，直到洗去脂肪中混合的血液成分，将干净的脂肪碎块挤压成浆糊状，置入烧杯中称量体积； (2)将浆糊状的脂肪放入匀浆机中，并向匀浆机中加入等体积的蒸馏水，匀浆，匀浆机转速为12000rpm，在室温常压下匀浆5min ； (3)将匀浆后的组织悬液置于震荡摇床中震荡，可观察到白色脂肪与粘稠凝胶样物质逐渐分离，弃去上层脂肪与中层液体，加入等量蒸馏水，重复以上操作，直到全部脂肪分离出凝胶样物质； (4)将获取的凝胶样物质分装入50ml离心管中，向各个离心管中加入适量蒸馏水，置入离心机中离心，转速为lOOOrpm，在室温常压下离心3min，离心后弃上层液体，重复3次，最终获得的凝胶样沉淀即为猪的脂肪细胞外基质。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述的步骤(I)中，猪的脂肪取自皮下脂肪，品系不限。
3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于:所述的步骤(3)中，震荡摇床的转速为240rpm，震荡幅度为20mm，在常温常压下震荡5min。
【专利摘要】本发明公开了一种猪的脂肪细胞外基质的提取方法，包括如下步骤：(1)将新鲜猪脂肪剪碎后用蒸馏水反复洗涤；(2)向洗涤后的脂肪中加入蒸馏水，将混合物放入匀浆机中匀浆；(3)将匀浆后的组织悬液置于震荡摇床中震荡，白色脂肪与粘稠凝胶样物质逐渐分离，弃去上层脂肪与中层液体，加入等量蒸馏水，重复以上操作，直到全部脂肪分离出凝胶样物质；(4)将获取的凝胶样物质置入离心机中离心，离心后弃上层液体，反复清洗，获得凝胶样沉淀即为猪的脂肪细胞外基质。本发明应用猪的脂肪细胞，生产工艺流程简洁，生产原材料易获取，生产耗时短，且提取产率高，可用作注射用填充材料的生产。
【IPC分类】C12N5-071, A61L27-36
【公开号】CN104877956
【申请号】CN201510354204
【发明人】刘天一, 卢勇舟, 毕波, 郭妤, 杨平, 朱晶晶, 周轶群, 陈亮, 杨清建, 贾传龙
【申请人】华东医院
【公开日】2015年9月2日
【申请日】2015年6月23日