扩大间质基质细胞生产的方法、组合物及其试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本公开涉及处理间质基质细胞以获得有活力和有潜能的干细胞组合物的方法。特 别地，本公开涉及用于获得高细胞产率的一致性、增加的活力、低HLA-DR和潜能的用于临 床和治疗应用的间质基质细胞的方法。进一步地，本公开还涉及首尾相接（end-to-end)的 生产方法以及在针对所述应用给药之前或过程中减少最终组合物的操作。
【背景技术】
[0002] 人类间质基质细胞（hMSC)作为较小群体的细胞存在于骨髓中（占0.001 %至 〇. 01%的有核细胞），但在培养中它们可以快速生长并且扩增而不损失它们的干细胞特性 (sternness)。具有它们的以下属性的hMSC具有在许多受损组织中增强修复的潜能：（1)容 易分离、（2)高扩增潜能、（3)遗传稳定性、（4)可重复特性以及（5)与组织工程原理的相容 性。
[0003] 现在，MSC和MSC类细胞已经从除了骨髓包括脂肪组织、羊水、骨膜（periostium) 和胎儿组织的各种组织中分离，并且示出了表型异质性。已经广泛研究了获得自人类来源 如骨髓（hBMSC)的间质基质细胞，这是因为它们的相对容易获得以及分化成骨形成、脂形 成和软骨形成谱系，以及其他种类的组织或细胞（包括肝细胞、心肌细胞和神经元）的分化 潜能。它们的多种分化潜能和自我更新已经增加了对于该干细胞作为具有在再生医学应用 中的自我更新的细胞来源的关注。此外，它们基于对于培养基质粘附的分离构成用于消除 非间质谱系的简单策略，降低对于依赖特定表面标记物的表达的复杂的细胞分离方法的依 赖性。
[0004] 进一步地，通常使用平面技术（烧瓶）生产用于治疗应用的粘附的间质干细胞。十 层堆叠（stack)或容器已经用于促进几种异源细胞治疗产品进入早期、中期至后期临床开 发。扩大来自实验室规模的基于传统烧瓶的培养过程通常涉及商业可获得的堆叠-板系统 如科宁细胞堆叠（CorningCellSTACKS)。这些多层容器已经用于大规模细胞培养。传统 的10层细胞堆叠已经用于制造加工并且正在用作用于治疗应用的异源间质基质细胞的良 好生产规范（GMP)生产的平台。
[0005] 尽管，使用间质基质/干细胞的细胞治疗示出了巨大希望，骨髓衍生的MSC的限制 是它们的较小数量，然而对于临床应用，需要大量的MSC。随着间质基质细胞（MSC)的研究 转换为商业产品，将细胞类产品带入市场的另一个主要阻碍是对于稳健并且可重复的生产 过程以及用于生物系统的冷冻保存介质和储存容器的质量的需要。
[0006] MSC是多潜能的并且能够分化成成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞。已经更广泛地使 用BM衍生的MSC并且存在更大量的与它们的临床安全性和实践有关的数据。为了满足临 床需求，需要快速并且稳健的MSC扩增方法用于均匀、现成产品的制造和大规模库存的储 存。在现有技术中，PCT申请号PCT/US2009/053891公开了包含具有降低的免疫原性的间质 干细胞的药用组合物以及使用离心过滤制造其的方法。该专利申请是关于利用离心过滤制 造一种或多种纯化的MSC药用组合物的方法，但没有公开细胞类产品的关键质量参数如细 胞产率和HLA-DR。进一步地，纯化的MSC组合物包含小于55ug/ml的残留BSA。然而，这没 有提供实现细胞产率、活力和质量参数如低HLA-DR和纯度的增加的见解。美国专利申请号 13/267, 363提供了具有重要治疗潜能、具有培养中稳定的结构和功能表型的间质干细胞的 制备，扩增MSC以生产临床规模的治疗制剂的方法及其医疗用途。另一个PCT申请号PCT/ US2011/022054集中于用于制造细胞治疗产品以及使用TFF(该技术用于降低随后过程中 的BSA含量），通过体积减小洗涤细胞治疗产品的方法和装置。然而，在TFF过程中，没有提 供关于细胞损失的数据，并且此外，BSA水平在约100ng/ml的范围内，这被认为不适合用于 治疗应用。因此，对于将确保生长因子（bFGF)对于用于均匀细胞分布和增殖的培养基的均 匀分布的方法，用于改善细胞产率、活力、一致性、减少的培养持续时间和细胞损失、没有杂 质的方法以及保存细胞产品以改善其保质期的方法，仍然存在需要。
[0007] 传统遵循的干细胞扩增和细胞类产品的最终递送的方法中看出的主要阻碍是：
[0008] ?缺乏短持续时间内获得较大细胞产率的一致生产；
[0009] ?洗涤和离心过程期间的高细胞损失，导致低细胞产率和活力；
[0010] ?昂贵的储存和运输；
[0011] ?在给予患者之前，要求一定量的冷冻保存的细胞的重新构成（复原， reconstitution);以及
[0012] ?在医院进一步操作冷冻保存的细胞，由此使得产品易受细胞损失或无菌度损失。
[0013] 因此，本公开提供了用于克服以上问题的方法和装置。因此，本公开尝试克服对于 综合生产过程以及最终产品的储存的开发的增加需要。因此，致力于方法改善和用于开发 即可使用的用于细胞治疗的异源间质基质/干细胞的策略，当今，异源间质基质/干细胞是 细胞治疗中最广泛使用的细胞类型。
【发明内容】
[0014] 本公开涉及用于培养间质基质细胞的方法，所述方法包括以下动作：在包括碱性 成纤维细胞生长因子（bFGF)的培养基存在下，允许培养直至第一预定传代的间质基质细 胞扩增至第二预定传代，其中，当所述细胞实现至少一个预定汇合时，通过使细胞与所述培 养基接触进行所述扩增；并且其中，当与第一预定传代的细胞数目相比时，所述方法使第二 预定传代结束时的细胞数目增加了 2000倍。
[0015] 本公开还涉及对于配制用于临床或治疗应用的预定剂量将BSA的量减少至低于 50ng/ml的水平的方法，所述剂量包括通过培养所述细胞获得的间质基质细胞，所述方法包 括将组合物进行离心和用磷酸盐缓冲盐水洗涤的组合以减少所述BSA的量的动作。
[0016] 本公开还涉及用于储存间质基质细胞的方法，所述方法包括以下步骤：在范围从 每ml的冷冻混合物约5百万个细胞至约0. 25亿个细胞的细胞密度下，使细胞经受冷冻混 合物，以及在范围从约-75°C至约_85°C的温度下或在范围从约_190°C至约_200°C的温度 下储存细胞。
【附图说明】
[0017] 为了可以容易地理解本公开并且付诸实践，现在将参考如参照附图示出的示例性 实施方式。根据本公开，附图连同以下详细描述并入说明书中并且形成说明书的一部分，并 且用于进一步示出实施方式并且说明各种原理和优点，其中：
[0018] 图1中的A:示出了传代4次（P4)每批次的间质基质细胞产率。
[0019] 图1中的B:示出了来自图1中的A的5个单独批次的平均细胞产率。
[0020] 图2 :示出了P5下来自不同批次的总细胞产率。
[0021] 图3A:示出了来自本公开的不同批次的P5收获的7AAD的活力百分数的图形表 不。
[0022] 图3B:示出了本公开的解冻后頂P的7AAD的活力百分数的图形表示，显示解冻后 的活力的显著的一致性。
[0023] 图3C:示出了图3B的5个单独生产批次的解冻后頂P的7AAD的活力百分数的平 均值。
[0024] 图4A:示出了本方法的不同生产批次中收获后HLA-DR表达的表示，其示出了 HLA-DR的显著较低的表达。
[0025] 图4B:示出了图4A的5个单独生产批次的收获后HLA-DR表达的平均值。
[0026] 图4C:示出了使用本公开的方法的不同生产批次中的解冻后HLA-DR表达的表示。
[0027] 图4D:示出了图4C的5个单独生产批次的解冻后HLA-DR表达的平均值。
[0028] 图5A:示出了bFGF母液混合物（mastermix)的制备。
[0029] 图5B:示出了种子母液混合物（seedmastermix)的制备。
[0030] 图6A:示出了实施bFGF和种子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 开的'新方法'）在不同生产批次中细胞产率的一致性。
[0031] 图6B:示出了实施bFGF和种子母液混合物之前（'先前已知的'）和之后（本公 开的'新方法'）在不同生产批次中HLA-DR表达的一致性。
[0032] 图7A⑴和图7A(2):示出了与其中根据天数进行培养的之前已知的方法（1) 相比，基于汇合的进料时间表对基于汇合的本方法的不同批次的单独10细胞堆叠（Cell STACK)的细胞产率的影响（2)。
[0033] 图7B⑴和图7B⑵：示出了与其中根据天数进行培养的之前已知的方法⑴相 比，基于汇合的本方法的不同生产批次的单独10细胞堆叠中HLA-DR表达（2)。
[0034] 图8A:示出了按照本公开中指出的洗涤步骤（即，用200ml的DPBS进行洗涤I并 且用90ml的DPBS进行洗涤ΙΙΠΜΡ中的BSA水平相对于按照先前已知的洗涤步骤（即，各 自用200ml的DPBS进行洗涤I和洗涤II)获得的頂P中的BSA水平的比较。
[0035] 图8B:示出了如按照本公开中指出的洗涤步骤（即，用200ml的DPBS进行洗涤I 并且用90ml的DPBS进行洗涤II)获得的本公开的最终产品中的细胞损失相对于按照先前 已知的洗涤步骤（即，各自用200ml的DPBS进行洗涤I和洗涤II)获得的最终产品的细胞 产率的比较。
[0036] 图8C:示出了当与先前已知的洗涤方法比较时，洗涤和离心对于来自本方法的最 终产品的解冻后的细胞恢复的影响。
[0037] 图9A:示出了遵循用CS5冷冻保存的BM-MSC的7AAD的解冻后的活力，在每mlCS5 存在5百万个细胞、0. 1亿个细胞、0. 125亿个细胞、0. 15亿个细胞和0. 25亿个细胞的五个 不同的冷冻浓度下，在一周、一个月、两个月、三个月和六个月的冷冻保存期（时间点）下， 评价细胞活力。
[0038] 图9B:示出了遵循用CS5冷冻保存的BM-MSC的解冻后的总细胞恢复（Totalcell recovery) (TCR)。在一周、一个月、两个月、三个月和六个月的冷冻保存期（时间点）下，通 过用锥虫蓝染色细胞评价TCR。全部活力和无活力的总和计为TCR。观察到了每mlCS5存 在5百万个细胞、0. 1亿个细胞、0. 125亿个细胞、0. 15亿个细胞和0. 25亿个细胞的五个不 同的冷冻浓度的TCR。
[0039] 图10A:示出了 25M剂量、50M剂量和75M剂量的不同剂量的每mlCS5冷冻混合物 25M细胞的7AAD在-196°C下储存6个月的活力。
[0040] 图10B:示出了 25M剂量、50M剂量和75M剂量的不同剂量的每mlCS5冷冻混合物 25M细胞在-196 °C下储存6个月的细胞恢复。
[0041] 图10C:示出了 1亿和2亿的不同剂量的每mlCS5冷冻混合物25M细胞的7AAD 在-196°C下储存12个月的活力。Y轴表示7AAD的活力％。
[0042] 图11A:通过抑制混合淋巴细胞反应（MLR)的能力示出了頂P的免疫抑制性能。数 据是六个单独批次的平均值。
[0043] 图11B:示出了来自頂P-MLR共培养物的上清液中的PGE-2的评价。数据是五个 单独批次的平均值。
[0044] 图11C:示出了生产的PGE-2的量和頂P的免疫抑制能力之间的相互关系。
[0045] 图12 :示出了当与通过先前已知的方法生产的细胞类产品相比时，在生产VEGF方 面頂P的血管生成潜能。
[0046] 图13 :示出了当与通过先前已知的方法生产的细胞类产品相比时，在生产sGAG方 面IMP的软骨细胞潜能。
[0047] 图14A:示出了直接稳定性和加速稳定性研究的第3个月时间点的7AAD的解冻后 活力。
[0048] 图14B:示出了 -80°C直接（右边）和加速稳定性（左边）研究3个月的解冻后增 殖。
[0049] 图14C:示出了 -80°C直接和加速（对照）稳定性研究的解冻后CFU-F。
[0050] 图14D:示出了 -80°C直接和加速稳定性研究的三谱系分化。
【具体实施方式】
[0051] 本公开涉及用于培养间质基质细胞（mesenchymalstromalcell)的方法，所述方 法包括以下动作：
[0052]a.在包括碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)的培养基的存在下，允许培养直至第 一预定传代的间质基质细胞扩增至第二预定传代；
[0053] 其中，当所述细胞实现至少一个预定汇合时，通过使细胞与所述培养基接触进行 所述扩增；并且其中，当与所述第一预定传代的细胞数目相比时，所述方法使第二预定传代 结束时的细胞数目增加了 2000倍。
[0054] 在本公开的一个实施方式中，细胞数目的增加发生在21天的最大期间中。
[0055] 在本公开的另一个实施方式中，通过连续传代，允许第一预定传代的细胞扩增至 第二预定传代；并且其中，第一预定传代范围从传代2次至传代9次；并且，第二预定传代 范围从传代5次至传代10次。
[0056] 在本公开的另一个实施方式中，第一预定传代是传代3次；并且，第二预定传代是 传代5次。
[0057] 在本公开的另一个实施方式中，用于所述扩增的接种的细胞的数目范围从约60 万至约70万个细胞；并且，在所述扩增之后获得的细胞的数目是至少约18亿个细胞；并且 其中，所述方法使细胞数目增加了至少2000倍。
[0058] 在本公开的另一个实施方式中，培养基的组分是浓度范围从约75 %至95%的 Dulbecco改良的Eagle培养基-KnockOut[DMEM-K0]、浓度范围从约5 %至15 %的胎牛血清 [卩85]、浓度范围从约0.5%至2%的谷氨酰胺、具有约501]/1111至约1001]/1111的浓度的青霉 素和约50μg/ml至约100μg/ml的浓度的链霉素的青链霉素、以及浓度范围从约0. 5ng/ml 至5ng/ml的碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)。
[0059] 在本公开的另一个实施方式中，以避免体积误差并且提供bFGF在培养基的多个 等分部分中均匀分布的方式，通过母液混合组分的方法制备培养基，所述方法包括以下动 作：
[0060] a.制备'X'升包括DMEM-K0、FBS、谷氨酰胺和青链霉素，缺乏bFGF的培养基，以及 分配在'X'个lLtr容器中并且将容器从1至'X'标记；
[0061] b.从容器1号取出'Z'ml的培养基，并且分配在标记号为'Χ+Γ的新无菌容器 中；
[0062] c.将预定量的bFGF添加至'X减㈠Z'ml的容器1号的培养基，并且充分地混合 以获得bFGF母液混合物；
[0063] d.从标记为2至'X'的容器的每个中单独取出等量的培养基，并且在容器'Χ+Γ 号中添加'Z'ml的培养基，从而使得容器'Χ+Γ号的总培养基体积为'B'ml;以及
[0064] e.单独取出第二预定量的在步骤（c)中获得的bFGF母液混合物，并且在容器2至 'X'中各自添加'B'ml培养基，从而使得每个所述容器中的体积相等，并且制备培养基的多 个等分部分。
[0065] 在本公开的另一个实施方式中，至少一个预定汇合选自包括约30%至约40%、约 40 %至约50%、以及约60 %至约70%、或它们的任何组合的汇合范围。
[0066] 在本公开的另一个实施方式中，通过使细胞与培养基接触的扩增包括以下动作：
[0067] a.通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种细胞 并且将培养基提供给接种的细胞，将培养的细胞扩增成连续传代；以及
[0068] b.允许细胞达到约40%至约50%的预定汇合，并且更换培养基以获得扩增的细 胞；
[0069] 其中，整个扩增中使用的培养基浓度范围从约0. 15ml/cm2至约0. 35ml/cm2。
[0070] 在本公开的另一个实施方式中，扩增使细胞数目增加了至少30倍。
[0071] 在本公开的另一个实施方式中，通过使细胞与培养基接触的扩增包括以下动作：
[0072] a.通过以范围从约1000个细胞/cm2至约7000个细胞/cm2的接种密度接种细胞 并且将培养基提供给接种的细胞，将培养的细胞扩增成连续传代；
[0073] b.