一种犬子宫全器官脱细胞基质及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于全器官脱细胞基质领域，特别涉及一种犬子宫全器官脱细胞基质及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]重度子宫内膜修复障碍或子宫缺如所致的子宫性不孕(Uterine factorinfertility, UFI)至今仍是临床难题。已有的治疗方案有代孕和子宫移植等，代孕面临诸多社会伦理问题且被大多数国家被禁止，子宫移植虽已有成功应用于临床且恢复妊娠功能的报道，但仍存在供体子宫来源不足、手术难度大、血管吻合不畅、子宫支撑结构难以重建和免疫排斥反应等问题。当前UFI治疗的一个研宄趋势是利用组织工程和再生医学技术实现子宫壁部分或全层的和功能重建，如胶原蛋白膜单纯植入或预接种干细胞、接枝生长因子修复子宫内膜缺损等，已取得一定疗效并实现转化临床应用，显示了再生医学技术治疗UFI良好的前景，值得进一步深入研宄。
[0003]现有的子宫壁修复和诱导再生技术仍存在不足。以支架材料植入子宫内膜损伤部位，辅助组织修复是当前诱导子宫壁再生修复的趋势。Amer等以羊膜移植物覆盖球囊，治疗重度宫腔粘连分离术后患者。Taveau等将猪小肠粘膜下层置换兔子宫节段，术后可见完整的子宫三层结构。Lin等将碱性成纤维细胞生长因子锚定于胶原支架，修复大鼠单侧子宫1/2-2/3全层切除模型可明显观察到修复部位新血管生成、细胞增殖和肌层再生。此外，借助骨髓间充质干细胞、子宫内膜细胞等填充辅助支架材料可加快组织再生速度，取得较好的修复效果。Ding等将骨髓间充质干细胞植入胶原支架中，直接缝合至大鼠部分全层切除的子宫壁，移植后胶原支架逐渐与周围组织融合，可观察到新血管和再生平滑肌细胞再生。目前，研宄者已经这项研宄推向临床试验阶段，已有成功修复且实现妊娠二例。此项技术的不足也是显而易见的，包括①再生组织仅有毛细血供，难以保证子宫妊娠时所需的营养代谢修复范围受限尚未能实现子宫壁全层结构，特别是基底膜和平滑肌层内横外中的特异性和功能性再生，故子宫全层缺损修复区收缩和扩张不佳。故当前再生医学技术临床应用只有内膜修复的报道，但即使如此仍有可能因子宫内膜供血不足而影响胚胎着床。关键原因之一就是已有的各种支架材料未能精确模拟子宫内部复杂的超微结构，故而难以构建多细胞体系。
[0004]子宫全器官脱细胞基质是最适合于子宫壁诱导再生的材料，其反应了特定组织ECM独特的成分和结构，但其制备仍存在难点。以器官为组织来源、经脱细胞处理获得的新型支架材料一全器官脱细胞基质(Acellular who I e-organ matrix, AWM)可完整的保留该器官细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的三维超微结构、各种物理和生物学特性以及完整的血供网络等，带有丰富的生物信号构成组织内微环境维持细胞的生长、增殖和分化，调控机体进行自我修复，即ECM拥有该器官再生所需的特异微环境，这是目前国际上实质性器官再生研宄的前沿热点。由于子宫结构组成和功能精细复杂并呈现周期性变化、周围动脉为螺旋状，至今一直未见大动物或人体U-AWM制备成功的报道。既往2013年Yong等运用组织浸泡的方法将分离的人和大鼠子宫肌层经酒精、胰酶和蒸馏水处理，制备出大致保持肌层结构的小体积子宫肌层脱细胞基质。Santoso等分别借助液体静压力、离子去垢剂和非离子去垢剂处理子宫壁薄片获得脱细胞基质。该项方法存在一定的问题:①子宫肌层结构致密，肌纤维横纵交错，阻碍脱细胞介质进入组织内部，限制了脱细胞材料的厚度和面积，故制备的肌层脱细胞基质仅1X0.5cm大小；②脱细胞不彻底，组织切片经Masson染色后可观察到平滑肌细胞组分残留，植入体内将引起强烈免疫排斥反应；③不能良好的保存肌层的生理结构，弹性蛋白和胶原纤维含量明显降低，生物力学参数发生改变，缺乏临床应用价值。2014年Hellstrom等和Miyazaki等分别报道的以大鼠子宫为模型，灌注法成功制备鼠子宫全器官脱细胞基质(RU-AWM)，并比较多种子宫全器官脱细胞方法的优劣；体外接种子宫细胞和大鼠BM-MSCs后能形成子宫内膜样组织，体内修复大鼠1/2-2/3环周的子宫全层缺损能够实现子宫组织的结构性再生，再生子宫能够实现受孕。但此项研宄存在问题尚未解决，主要是选用的大鼠模型尺寸较小，其内的血管网络无法在植入的同时与受体主循环连接恢复血液循环，移植物仅依靠新生毛细血管对组织供血，故仅能修复半周的全层缺损而无法实现全周缺损修复，其再生效果逊于报道的心肝肾等实质性脏器，且其子宫内膜厚度、妊娠实验结果等修复指标甚至未能优于胶原支架。总之，鼠模型研宄得到的数据与子宫壁缺损修复临床现状仍相距甚远，需要更深入的研宄。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种犬子宫全器官脱细胞基质及其制备方法和应用，该犬子宫全器官脱细胞基质完整的保留了天然子宫细胞外基质复杂的三维排列、内横外纵的平滑肌膜超微结构，保留了完整、无渗漏的血管基质网络，保留了大量生长因子、透明质酸、氨基葡聚糖、层连蛋白等生物活性成分，高度亲和子宫内膜干细胞，具有与天然子宫相近的生物力学强度和韧性，脱细胞彻底、无明显免疫排斥，无伦理道德问题。
[0006]本发明的一种犬子宫全器官脱细胞基质，所述脱细胞基质通过选取原料、前置处理、脱细胞、消毒保存制备而得。
[0007]本发明的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，包括:
[0008]选取供体预先全身肝素化的犬子宫作为原材料，将插管血管接入生物反应器，经支配血管分别灌注酶处理液、化学药物处理液进行脱细胞，随后进行消毒，于组织保存液中保存即得犬子宫全器官脱细胞基质。
[0009]所述犬子宫留有主干血管和终末血管。⑶-AWM起始原料是犬子宫，取材范围优选的包括子宫支配血管的上级血管，以期相应血管脱细胞后能方便用于外科缝合。供体的年龄以年轻未孕犬为佳，取材时间应为发情早期，因为年轻供体子宫的细胞外基质中各种促干细胞粘附成分、生长因子等较丰富，发情早期供体子宫内膜较厚，便于分离。取材时间应于供体死亡后30分钟内，优选方案是在犬子宫仍具备有效血液循环时取材。
[0010]原材料准备指子宫在获取时应有较好的保存液灌注，优选的是供体有预先全身肝素化，最佳的是供体预先全身肝素化联合局部保存液充分灌注，充分灌注的标准是经支配动脉灌入保存液，支配动脉伴行的静脉中无粘稠血性液流出。经充分灌注后，原材料可反复冷冻、复温。
[0011]所述酶为胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶(Deoxyribonuclease, DNase)、α -半乳糖苷酶中的一种或几种。
[0012]所述胰蛋白酶的终浓度为0.01?0.25% ;脱氧核糖核酸酶的终浓度为30-50U/ml ; α -半乳糖苷酶的终浓度为10-25U/ml。
[0013]所述化学药物为乙二胺四乙酸(Ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)、乙二醇双四乙酸(Ethylene glycol tetraacetic acid, EGTA)、十二烧基硫酸钠(Sodiumdodecyl sulfate, SDS)、聚乙二醇辛基苯基酿(Triton-X)、脱氧胆酸(Deoxycholic acid)中的一种或几种。
[0014]所述乙二胺四乙酸或乙二醇双四乙酸的终浓度为0.02?0.5% ;十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01?0.1聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.1?I脱氧胆酸的终浓度为0.5?
[0015]所述消毒具体为将支配血管灌注过氧乙酸(Peroxyacetic acid, PAA)和乙醇混合液或进行γ射线辐射灭菌。
[0016]所述过氧乙酸和乙醇混合液中过氧乙酸的终浓度(V/V)为0.1-0.5%，乙醇的终浓度(V/V)为2-10%，过氧乙酸/乙醇混合液的作用时间为2-3小时。
[0017]制备的骨骼肌WOACM可选择水化保存，或经真空冷冻干燥形成干燥体保存。
[0018]一种犬子宫全器官脱细胞基质的应用，所述脱细胞基质应用于制备微粒、流体化组合物、凝胶或活性肽。
[0019]微粒产品为将⑶-AWM真空冷冻干燥后的干燥体经高速旋转粉碎所得，包括多个产品等级((38 μm，38-100 μm，100-250 μπι)，可用作子宫内膜创面覆盖、内膜缺损充填材料等。流体化组合物为将CU-AWM微粒在酸性环境中使用胃蛋白酶消化所得。凝胶产品为均匀流体化组合物再浓缩、中性化处理所得，包括不同浓度等级，可用作子宫内膜创面覆盖、注射充填子宫内膜缺损、治疗子宫内膜厚度不足等。制备上述衍生产品的技术均是本领域技术人员所熟知的。CU-AWM活性肽的制备:将CU-AWM流体化组合物经超高速离心(彡13000rpm)后，上清液真空冷冻干燥，所得干燥体即为⑶-AWM的活性肽，体外测试证实其促子宫内膜细胞趋化、增殖和分化的能力远较CU-AWM流体化组合物更高效。
[0020]从理论上说，与智能生物材料胶原纤维支架和小动物U-AWM相比，大动物U-AWM具有如下优势:
[0021]①U-AWM保留了子宫具有启动功能的内膜腺泡/基底膜/内横外纵的平滑肌膜等特异性的三维构架，植入后可自动吸引特定细胞迀移至相应特定位置。
[0022]②U-AWM保留了子宫的组织极性，内部局部微环境差异可能诱导或强化干细胞的特异分化。
[0023]③U-AWM具有丰富的细胞因子、糖胺聚糖等生物活性成分，如IV型胶原、聚集蛋白、层连蛋白、氨基葡聚糖、硫酸类肝素、bFGF、TGF- β K VEGF, IGF等各种生长因子。
[0024]④U-AWM保留有完整的毛细血管网络，体外可方便的系统性接种干细胞体外灌注立体培养、体内可连通受体的循环系统为其中的细胞持续提供营养。细胞只有距离毛细血管150-200 μ m之内才能存活，而U-AWM用于系统性接种干细胞可确保干细胞均匀分布到整个基质并且所有接种的细胞在血管周围150-200 μπι内。
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