25]⑤U-AWM保留有支配血管，有机会再生出新的大直径供应血管来支配新生子宫壁，赋予新生子宫壁全功能(Full funct1n)的可能。平静状态下子宫壁的血流量远远低于附有胎盘组织时子宫壁内的血流量能，故新生子宫壁恢复良好功能需要大直径的支配血管。
[0026]⑥U-AWM具备天然子宫的体积，可直接用于填充修复子宫壁缺损，使用方便；
[0027]⑦U-AWM保留有天然子宫壁的机械强度、弹性等生物力学特征。
[0028]⑧U-AWM脱细胞彻底，植入后无排斥反应，可异种异体移植。
[0029]有益效果
[0030](I)本发明完整的保留了天然子宫细胞外基质复杂的三维排列、内横外纵的平滑肌膜超微结构，保留了完整、无渗漏的血管基质网络，保留了大量生长因子、透明质酸、氨基葡聚糖、层连蛋白等生物活性成分，高度亲和子宫内膜干细胞，具有与天然子宫相近的生物力学强度和韧性，脱细胞彻底、无明显免疫排斥，无伦理道德问题。
[0031](2)所制备的犬子宫全器官脱细胞基质，以及其各种衍生出的医疗产品，可用作体外构建再生子宫多细胞培养体系，提供子宫内膜相关疾病病理生理研宄模型，体内适用于修复子宫内膜和子宫壁全层大范围缺损，具有良好的应用前景。
【附图说明】
[0032]图1为原始犬子宫以及制备的⑶-AWM大体观示意图；
[0033]图2为⑶-AWM横断面、沿长轴面的扫描电镜图，显示结构完整，脱细胞彻底；
[0034]图3为⑶-AWM保留完整血管网络示例图；
[0035]图4为天然犬子宫和⑶-AWM横断面的HE染色、IV型胶原蛋白、弹性纤维、层粘连蛋白、纤连蛋白免疫组化染色图，显示⑶-AWM保留糖胺聚糖、生长因子等生物活性成分；
[0036]图5为⑶-AWM脱细胞彻底的组织学图；
[0037]图6为⑶-AWM无细胞内蛋白质残留组织学图；
[0038]图7为⑶-AWM无长链DNA残留的凝胶电泳图；
[0039]图8为CU-AWM体外降解产物与细胞培养液对子宫内膜干细胞迀移的影响示例图；
[0040]图9为⑶-AWM经二次处理获得的子宫内膜ACM图。
【具体实施方式】
[0041]下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0042]实施例1
[0043]原材料(犬子宫)的获取和前置处理:供体为12-18月龄未生育雌性比格犬，体重9-llkg，无下丘脑-垂体-卵巢轴功能障碍性疾病；生殖器发育正常；近半年未使用过激素类药物。取材时间应为发情早期，取材时间应于供体死亡后30分钟内。预先经外周静脉全身肝素化(5000U/只)，采用腹正中切口，暴露腹膜后结构，游离双侧子宫角、输卵管、卵巢，沿子宫动脉主干追溯找到髂内动脉。切开髂内动脉，经其置入20G套管至子宫动脉，灌注泵驱动注入肝素化(l_5U/ml)的生理盐水，保持动脉内压力在活体正常血压水平(100-120mmHg)。充分灌注5分钟直至子宫颜色变白。于子宫颈-阴道连接处离断。一般获取的犬双角子宫呈“Y”型，分为子宫角、子宫体和子宫颈。子宫角细长，内径均匀，没有弯曲，长约12到15厘米，两侧子宫角呈“V”型；子宫体短小，只有子宫角的1/6?1/4，约2到3厘米；子宫颈很短，有一层厚的肌层。剪除双侧卵巢。
[0044]脱细胞处理:获取的全子宫置于灌注反应器中，灌注时注意标本须同时浸没于与灌注液同样的液体中。同时经双侧套管灌注脱细胞液体，顺序如下①0.02%Trypsin/0.05% EGTA(2h)，②去离子水、2X PBS 交替 2 次，各 0.5h，③ 0.01 % SDS(12h)，@0.5% Triton X-100 (16h)，⑤去离子水(24h)，⑥ 0.1 % PAA/4% ET0H(2h)，⑦去离子水(2h)，⑧DNase/ α -半乳糖苷酶(0.5h)，⑨去离子水(72h)。
[0045]消毒和保存:自0.1 % PAA/4% EtOH灌注后，所有灌注的液体，包括去离子水，均为已灭菌液体。最终获得⑶-AWM保存于组织保存液中，γ射线辐射灭菌。保存液成分:乳糖醛酸lOOmmol，磷酸氢钾25mmol，硫酸镁5mmol，氢氧化钠(5mmol/L) 5ml，氢氧化钾(5mmol/L)20ml，蔗糖 60mmol，pH 7.45±0.10，渗透压(310± 10)m0sm/Lo
[0046]CU-AWM的超微结构:扫描电镜证实CU-AWM保留了天然子宫细胞外基质三维排列、内横外纵的平滑肌膜超微结构、未见任何细胞成分(图2)。
[0047]脱细胞彻底性鉴定:已完全去除细胞等引起免疫排斥成分，仅剩下透明的、无排斥反应的细胞外基质CU-AWM (图1)，组织学和扫描电镜检查均未见任何细胞结构和成分(图2,5), DAPI染色阴性；平滑肌收缩蛋白、肌动蛋白染色进一步证实子宫壁中能引起排斥反应的异种细胞蛋白成分被清除(图6)。完全冷冻干燥的CU-AWM中DNA含量低于50ng/mg，据此计算天然子宫中99.5%的DNA已被清除；残留DNA均为短链DNA(200_500bp);异体异种移植均不会发生排斥反应(图7)。
[0048]血管完整性鉴定AU-AWM保留有主干血管(图3上半)，组织结构完整，内部的血管基质网络能耐受经支配血管灌注的300mmHg高压液体而仅有远切端少许渗漏。扫描电镜可见⑶-AWM内部保留完好的终末血管(图3下半)。
[0049]生物活性鉴定:经ELISA法测定，完全冷冻干燥的⑶-AWM中GAGs含量是425±64ng/mg，VEGF 含量是 127±31ng/mg，bFGF 含量是 1044± 158ng/mg，TGF-β 含量是313±78ng/mg ;免疫组化染色证实⑶-AWM保留有子宫ECM主要成分如IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白，含有丰富的弹性纤维(图4)。
[0050]生物力学指标检测:CU-AWM保留有原始子宫同样的生物力学强度并具备更佳的弹性模量。天然犬子宫的抗张强度27.56±6.48N、伸展率48.4+10.55%, CU-AWM的抗张强度 25.41 ±5.37N，伸展率 68.4±14.22%。
[0051]促干细胞迀移能力鉴定:CU-AWM体外降解产物高效促进子宫内膜干细胞、平滑肌细胞的迀移和增殖但抑制成纤维细胞的增殖(图8)。
[0052]子宫内膜的分离:⑶-AWM经二次处理可制成子宫内膜ACM，作为补片修复内膜缺损(图9)。CU-AWM还可制成多种形式衍生物，包括微粒、流体化组合物、凝胶和活性肽。
【主权项】
1.一种犬子宫全器官脱细胞基质，其特征在于:所述脱细胞基质通过选取原料、前置处理、脱细胞、消毒保存制备而得。
2.一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，包括: 选取供体预先全身肝素化的犬子宫作为原材料，将插管血管接入生物反应器，经支配血管分别灌注酶处理液、化学药物处理液进行脱细胞，随后进行消毒，于组织保存液中保存即得犬子宫全器官脱细胞基质。
3.根据权利要求2所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述犬子宫留有主干血管和终末血管。
4.根据权利要求2所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述酶为胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、α -半乳糖苷酶中的一种或几种。
5.根据权利要求4所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述胰蛋白酶的终浓度为0.0l?0.25% ;脱氧核糖核酸酶的终浓度为30-50U/ml ; α -半乳糖苷酶的终浓度为10-25U/ml。
6.根据权利要求2所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述化学药物为乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸中的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述乙二胺四乙酸或乙二醇双四乙酸的终浓度为0.02?0.5% ;十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01?0.1% ;聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.1?1% ;脱氧胆酸的终浓度为0.5?
8.根据权利要求2所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述消毒具体为将支配血管灌注过氧乙酸和乙醇混合液或进行γ射线辐射灭菌。
9.根据权利要求8所述的一种犬子宫全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于:所述过氧乙酸和乙醇混合液中过氧乙酸的终浓度为0.1-0.5%，乙醇的终浓度为2-10%，过氧乙酸/乙醇混合液的作用时间为2-3小时。
10.一种如权利要求1所述的犬子宫全器官脱细胞基质的应用，其特征在于:所述脱细胞基质应用于制备微粒、流体化组合物、凝胶或活性肽。
【专利摘要】本发明涉及一种犬子宫全器官脱细胞基质及其制备方法和应用，通过选取原料、前置处理、脱细胞、消毒保存制备而得。可应用于制备微粒、流体化组合物、凝胶或活性肽。本发明完整的保留了天然子宫细胞外基质复杂的三维排列、内横外纵的平滑肌膜超微结构，保留了完整、无渗漏的血管基质网络，保留了大量生长因子、透明质酸、氨基葡聚糖、层连蛋白等生物活性成分，高度亲和子宫内膜干细胞，具有与天然子宫相近的生物力学强度和韧性，脱细胞彻底、无明显免疫排斥，无伦理道德问题。
【IPC分类】A61L27-50, A61L27-54, A61L27-36
【公开号】CN104740684
【申请号】CN201510095182
【发明人】张剑, 王强, 王伟民, 程文悦
【申请人】上海市闸北区中心医院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2015年3月3日