一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株。
【背景技术】
[0002] 决定皮肤颜色最重要的因子是一种被称为黑色素的色素性物质。黑色素的形成是 由存在于表皮基底层的黑色素细胞产生的。如果这个黑色素的产生出现异常被抑制，或者 黑色素细胞消失，就会形成一种后天性色素脱失症，俗称为白癜风。现阶段，针对白癜风的 治疗方法包括留族化合物治疗法以及光化学疗法。但是，这些治疗方法的预后不是很理想， 都需要接受持续性的治疗。
[0003] 除上述治疗方法外，也有从其他部位取皮或毛囊进行移植的治疗方法。但是，这种 疗法会造成与治疗部位同等面积的皮肤缺损，因此当治疗部位面积相对大时就不能进行此 类治疗了。另外，也有从自体采取黑色素细胞，经过体外培养后再注射移植的治疗方法。此 疗法与自体取皮相比，可以进行相对大面积的治疗，但是在注射部位造成色素分布不均，大 面积治疗时要达到色素的均匀分布是非常困难的。
[0004] 另一方面，以创伤治愈以及烧伤治愈为目的的表皮培养方案也被提出。皮肤培养 不仅可以实现大范围的治疗而且非常有效果。但是，目前的表皮培养都不含有黑色素细胞， 就算有黑色素细胞也无法有效地使黑色素形态正常形成。虽然在细胞培养时，促进黑色素 产生的方法有很多种，例如：用紫外线照射进行物理刺激，添加黑色素细胞活性因子等。但 是，即使使用了这类的处理方法也无法有效且稳定地形成正常的色素形态。另外，当黑色素 细胞和其他皮肤细胞共同培养的时候，如果进行这些处理，会影响到黑色素细胞以外细胞 的成长，所以在运用上还是相当困难的。
[0005] 针对上述问题，本发明提供了一种新的促进黑色素细胞色素形成的细胞株。出人 意料的是，在该细胞株的存在下，含有黑色素细胞的表皮组织培养物形成完全的片状形状， 在美容和医疗应用时能够实现大面积的色素均匀分布。
【发明内容】
[0006] 本发明的发明者经过大量研究发现，通过对提取的黑色素细胞和表皮细胞进行共 培养，可以很好的促进黑色素细胞色素的产生，实现本发明的技术效果。本发明的细胞株能 够促进黑色素细胞的色素产生，因而能够很好的还原皮肤色素。所以，适用于治疗白癜风以 及进行美白药物的筛选等领域的研究。
[0007] 因此，在本发明的一方面，提供了一种促进黑色素细胞色素产生的细胞株，细胞株 名称为小鼠胚胎细胞RMD9,保藏在中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号 为：CCTCC NO :C201408。保藏日期为2014年1月17日。
[0008] 在本发明的另一方面，提供了一种细胞培养物，该细胞培养物包含本发明的细胞 株小鼠胚胎细胞RMD9以及黑色素细胞。本发明所述细胞培养物中黑色素细胞的生物来源 可以是任意来源，例如生物来源选自：小鼠、大鼠、猪、牛、猴子和人。在一个实施方式中，本 发明所述细胞培养物中小鼠胚胎细胞RMD9与黑色素细胞共培养。在一个优选的实施方式 中，小鼠胚胎细胞RMD9作为滋养层细胞与黑色素共培养，促进黑色素细胞的色素产生。
[0009] 在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，所述培养悬液包含本发明的细胞株 小鼠胚胎细胞RMD9。
[0010] 在本发明的另一方面，提供了一种培养悬液，所述培养悬液包含本发明的细胞株 小鼠胚胎细胞RMD9的提取物。
[0011] 在本发明的另一方面，提供了本发明细胞株小鼠胚胎细胞RMD9的制备方法，所述 方法包括以下步骤：
[0012] a.取小鼠皮肤片，进行细胞株的克隆过程；
[0013] b.将上述克隆的细胞株与黑色素细胞共培养的培养过程；
[0014] c.评价黑色素细胞的色素生产能力，选定能够促进黑色素细胞色素产生的细胞 株。
[0015] 在本发明的另一方面，提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养 物在进行皮肤美容产品筛选中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细 胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选美白产品中的应用。在一些实施方式中，本发明 提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选白癜风治疗产品中的应 用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物 在筛选痤疮治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9 和黑色素细胞的细胞培养物在筛选烧伤治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提 供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选大面积黑痣治疗产品中的 应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞RMD9和黑色素细胞的细胞培 养物在筛选纹身治疗产品中的应用。在一些实施方式中，本发明提供了包含小鼠胚胎细胞 RMD9和黑色素细胞的细胞培养物在筛选过度晒伤治疗产品中的应用。
[0016] 发明详述
[0017] 本发明的细胞株能够促进黑色素细胞色素的产生。黑色素细胞是一种皮肤里的特 殊的细胞，它产生黑色素，传递给周围的角质形成细胞。在本发明中，对于黑色素细胞的采 集部位没有具体限制，可以从表皮基底层或毛囊基底部充分获取。由于表皮角质细胞是构 成表皮的上皮细胞，所以也可以从表皮基底部或毛囊基底部获取。
[0018] 黑色素细胞是分裂次数有限的正常细胞。比如分裂50~80次后细胞寿命就结束 了。本发明对于黑色素细胞的生物种类来源没有特别的规定，优选使用小鼠、大鼠、猪、牛等 哺乳类，或者是人、猴子等灵长类，最优选使用人来源的细胞。例如，黑色素细胞可以是已经 建立的市售黑色素细胞，也可以是从患者自身提取的黑色素细胞。
[0019] 细胞株化使得黑色素细胞即使超过了分裂次数，也可以继续传代培养。这类的细 胞株通过传代，即使细胞正常死亡或超过传代数，也可以通过选择可以增殖的细胞来达到 继续培养。
[0020] 另外，导入了遗传因子的细胞或者使用遗传因子导入技术制作出来动物类的株化 细胞也是可以继续增殖的。被导入的遗传因子没有限定，比如SV40病毒的大抗原遗传因 子，ras遗传因子，c-myc遗传因子等。将遗传因子导入细胞的方法包括显微注射法，电脉冲 法，脂质体法等，这些都是大家熟知的技术。
[0021] 制备本发明细胞株的细胞的生物种类来源没有特别限制，可以包括大鼠，小鼠， 猪，牛，人，猴子等哺乳类，优选使用大鼠、小鼠等啮齿类，最优选使用大鼠来源的细胞进行 细胞株化。
[0022] 本发明的细胞株能够促进黑色素细胞的色素产生。细胞株促进黑色素细胞的色素 产生作用分为两种。第一种：促进每个黑色素细胞的色素产生，提高黑色素细胞的黑色度。 另一种：增加黑色素细胞的细胞数量。不论是那种作用，结果就是通过目测就能确认含有黑 色素细胞细胞培养组合物的黑色的程度有显著的提高。本发明所述促进黑色素细胞的色素 产生作用可能是上述中的某一种，也可能两个作用都包含。
[0023] 本发明的细胞株作为促进黑色素细胞的色素产生的条件，例如，可以和黑色素细 胞共培养，可以将本发明细胞株的培养悬液供给黑色素细胞培养物，可以将本发明细胞株 的提取物供给黑色素细胞培养物等，其中比较好的是和黑色素细胞共同培养。共培养的条 件也没有限制，例如包括本发明的细胞株和黑色素细胞混合培养的方法，或者本发明的细 胞株作为滋养层细胞对黑色素细胞进行培养的方法等。在一个优选的实施方式中，将本发 明的细胞株作为滋养层细胞对黑色素细胞进行培养。
[0024] 这里的滋养层细胞是指能够诱导其他细胞(本发明是黑色素细胞）的细胞。另外， 所谓滋养层细胞指的是在培养容器中细胞已一体化或准一体化的皮状形态。所谓的一体化 或准一体化指的是通过光学显微镜看到培养皿的基底的70~100%的面积都被细胞所占有 的状态。另外，所谓的皮状的培养物是指细胞形成了 1~5层，可以平面展开的培养物。另 外滋养层细胞培养物即使使用丝裂霉素 C，X照射来抑制细胞的增殖也是没有问题的。
[0025] 下面将描述本发明细胞株的具体制备过程：
[0026] ( 1)本发明细胞株的克隆过程
[0027] 所谓的细胞株克隆过程，就是取得完全相同的遗传背景的细胞株集合的过程。从 原代到传代培养所建立的细胞株，一般会有好几种遗传背景。所以想要维持稳定平衡是很 困难的。所以在这里必须以一个细胞为起源来建立细胞集合，得到同质量的具有稳定特性 的细胞集合。作为操作方法，例如可以将细胞株的分散液稀释到临界点，也存在单一的细胞 分离方法。作为克隆的细胞株，可以是由原代细胞形成的细胞株，也可以是由已细胞株化的 STO细胞或3T3细胞派生出来的细胞株。
[0028] (2)培养含有细胞株和黑色素细胞的细胞培养组合物的过程
[0029] 所谓的培养含有细胞株和黑色素细胞一起的细胞培养组合物的过程是指将本发 明细胞株克隆过程（1)中取得的单一遗传背景的细胞株和黑色素细胞一起培养的过程。这 里所谓的细胞培养组合物指的是含有本发明细胞株和黑色素细胞的细胞培养物。相关的细 胞培养组合物既可以是由细胞株以及黑色素细胞构成，也可以包含其他细胞。所谓的其他 细胞，包括例如表皮角质细胞，成纤维细胞等。通过细胞株和黑色素细胞共培养，可以观察 被单独分离的细胞株对黑色素细胞会产生什么影响。共培养的方法包括例如：将含有细胞 株和黑色素细胞的细胞悬液接种到培养容器；或者让单独分离的细胞株形成滋养层细胞培 养物，然后在这个上面接种含有黑色素细胞的细胞悬浊液；以及类似的方法。具体的操作方 式，例如单独分离的细胞株形成滋养层细胞培养物后，在这个上面接种含有黑色素细胞的 皮肤片经过消化酶处理的细胞悬液，但这并不是唯一的方法。
[0030] (3)对黑色素细胞的色素产生能力的评价过程
[0031] 所谓黑色素细胞的色素产生能力的评价过程是对于过程（2)共培养后的细胞培养 组合物中黑色素细胞的色素成型状态的评价。黑色素细胞的色素成型状态的评价方法包 括：目测观察黑色化状态，使用光学显微镜对黑色化的黑色素细胞的细胞数进行计数，或对 酪氨酸酶等和色素形成相关的酶的活性，遗传因子发现量进行评价的方法等。黑色素细胞 的色素产生能力的评价在过程（2)之后进行，细胞株对于黑色素细胞的影响是在充分时间 培养之后进行评价。培养的时间没有特别规定，一般为1~60天，理想状态为3~40天后 进行黑色素细胞的色素生产能力的评价。具体操作包括：将含有黑色素细胞的皮肤片的消 化悬液接种到单独分离的细胞株作为滋养层细胞上，经过10~50天的培养后，培养物做 DOPA染色，然后用光学显微镜观察黑色素细胞的细胞数，这只是一种方法，但不局限于这种 方法。
[0032] 通过过程（3)的操作，将黑色