专利名称：人黑色素瘤抗原mage-a3 b细胞表位及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药及诊断领域，更具体地，本发明涉及来自于人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白上的三个B细胞表位及其编码核酸，其制备方法及其在预防、治疗和诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤中的应用。
背景技术：
人黑色素瘤抗原(melanoma antigen genes,MAGE)基因首先在人黑色素瘤细胞系中发现，是一个大家族包括A、B、C、D、E和F六个亚家族。其中，MAGE-A3编码的肿瘤抗原是一分子量为48KDa的胞浆蛋白，由314个氨基酸残基组成。MAGE-A3基因不仅表达于以黑色素瘤为主的恶性肿瘤组织中，还以较大比例表达于多种组织类型的各种肿瘤，如肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤和卵巢肿瘤等，尤其消化道肿瘤如胃癌、食道癌、结肠直肠癌可呈高表达(参见Tahara K, Mori M, Sadanaga N, Sakamoto Y,Kitano SiMakuuchi M. Expression of the MAGE gene family in human hepatocellula·rcarcinoma. Cancer,1999,85(6) :1234-1240 ；Fischer C，Gudat F，Stulz P，Noppen C，Schaefer C， Zajac P， Trutmann M， Kocher T， Zuber M， Harder F， Heberer M， SpagnoliGC. High expression of MAGE-3 protein in squamous cell lung carcinoma. Int JCancer 1997,71 (6) :1119-1121 ； Inoue H，Mori M，Honda M，Li J，Shibuta K，Mimori K，Ueo H， Akiyoshi T.The expression of tumor-rejection antigen " MAGE" genes inhuman gastric carcinoma. Gastroenterology. 1995 ；109 (5) :1522-5.) DMGE-A3 抗原在除睾丸和胎盘组织外的正常组织细胞不表达，但由于睾丸和胎盘组织的固有生理屏障可以避免由MAGE-A3被识别产生的自身免疫损伤，因此，MAGE-A3为肿瘤特异性的肿瘤共同抗原。同时也证明了其具有良好的免疫原性，因而认为MAGE-A3是肿瘤特异性免疫诊断和治疗的理想祀抗原。(参见Van den Eynde，B. J.，and P. van der Bruggen. T cell defined tumorantigens. Curr. Opin. Immunol. 1997，9 :684-693 ;Marturano，J.，R. Longhi，V. Russo, andM. P.Protti. Endosomal proteases influence the repertoire of MAGE—A3 epitopesrecognized in vivo by CD4 T cells. Cancer Res. 2008,68 1555-1562 ;Manici，S.，T. Sturniolo，M. A. Imro, J. Hammer，F. Sinigaglia，C. Noppen，G. Spagnoli，B. Mazzi,M. Bellone, P.Dellabona, and M. P.Protti. Melanoma cells presenta MAGE-3 epitopetoCD4 cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigenDRll. J. Exp. Med. 1999，189 :871-876.)目前，肿瘤是我国的多发病和常见病，已严重威胁人类健康，采取有效的治疗和控制措施已迫在眉睫。虽然，以手术和放疗、化疗为主的肿瘤的治疗有了长足的进步，但疗效尚不能令人满意。近年来，大量实验研究表明，基于肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)发展起来的肿瘤治疗性疫苗，能有效激活免疫系统、杀伤肿瘤细胞，因而寻求基于肿瘤抗原的有效疫苗是防治肿瘤的主要途径之一。目前，肿瘤疫苗的研究有①肿瘤细胞疫苗用逆转录病毒、腺病毒载体将外源基因导入肿瘤细胞内以提高肿瘤细胞的免疫原性，实验证明在体内外能诱导特异性的CTL反应。但自体肿瘤细胞疫苗易致耐受，而异体肿瘤疫苗又易被机体清除。②合成多肽疫苗随着分子模拟技术和计算机技术对各种肿瘤抗原表位筛选的应用，越来越多肿瘤抗原Th和CTL表位的被发现、鉴定，TAA或TSA的特异性CTL表位肽，可产生特异性的抗肿瘤免疫。合成多肽疫苗已进入临床II期试验，但免疫原性弱是其一大缺点。③DNA疫苗选用TAA或TSA基因克隆到质粒载体后作为疫苗，可在体内外有效地刺激机体产生特异性的抗肿瘤CTL免疫效应。。④肿瘤抗原负载的树突状细胞(DC)疫苗将TAA或TSA的CTL表位多肽诱导DC作为疫苗，可诱导机体产生特异性免疫保护效应，用MAGE-3CTL多肽处理的DC，观察到7位进展期胃癌肿瘤患者中的3位发生了肿瘤消退。⑤肿瘤抗原嵌合多表位的研究我国研究者报道，对3个前列腺肿瘤特异性抗原的多个T细胞表位进行预测、筛选、鉴定，并通过分子克隆技术构建了嵌合DNA疫苗，并将趋化因子和免疫球蛋白的Fe段基因共同克隆在真核载体上，制备了趋化肿瘤抗原基因疫苗，在小鼠体内产生了有效的抗肿瘤免疫效应。总之，以表位为基础的疫苗研究显示了其治疗和预防肿瘤的诱人前景。
表位是抗原分子中可与CTL、Th和B细胞表面受体结合，并诱导特异性细胞免疫和体液免疫反应，从而产生免疫保护作用的一段氨基酸序列。表位疫苗(Epitope vaccine)是新近发展起来，具有独特设计思路，以抗原表位为基础制备的疫苗。由于表位疫苗设计的独特性，与减毒活疫苗、灭活苗及其他几种新型的疫苗相比，表位疫苗具有①安全、无毒、稳定，可以直接刺激机体产生特异性免疫反应，其分子结构小而简单，不会引起自身免疫反应或免疫抑制；②可对抗原表位进行精确的定位，并可对T、B细胞抗原表位进行不同组合，制成针对多种病原体的疫苗。因而，通过筛选富含多个CTL、Th和B细胞优势表位的氨基酸序列为抗原，可达到既能诱导免疫应答又可减少免疫病理反应的目的；能够有效增强表位提呈的效率；同时可保持B细胞表位的天然构象等。
发明内容
本发明的目的在于提供MAGE-A3蛋白上三种B细胞表位的重组蛋白，其编码核酸、其制备方法及其应用。在本发明的第一方面，提供三种分离的B细胞表位蛋白，所述蛋白的氨基酸序列分别为(a)MAGE-A3蛋白上第5_23位氨基酸序列；和(b)MAGE-A3蛋白上第112-131位氨基酸序列；和(c) MAGE-A3蛋白上第232-246位氨基酸序列。在一个优选例中，所述的蛋白不包括全长的MAGE-A3蛋白(SEQ ID NO :7)。在另一优选例中，所述的蛋白具有SEQ ID NO :I、NO :2和NO :3所不的氣基酸序列。在另一优选例中，所述的蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID N0:1N0:2和N0:3所
/Jn ο在本发明的第二方面，提供三种分离的MAGE-A3蛋白B细胞表位的核酸，所述核酸编码所述的蛋白。在另一优选例中，所述的核酸的核苷酸序列选自(I) SEQ IDNO 4所示的核苷酸序列；和
(2) SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；和(3) SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。在本发明的第三方面，提供一种重组载体，所述载体包含所述的核酸。在本发明的第四方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞⑴含有所述的载体；或(ii)基因组中整合有所述的核酸。在本发明的第五方面，提供一种制备所述的蛋白的方法，所述方法包括培养所述的细胞，使所述细胞产生所述的蛋白。在本发明的第六方面，提供所述的蛋白、所述的核酸、所述的重组载体或所述的宿 主细胞在制备用于预防、治疗或诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤的组合物中的用途。在一个优选例中，所述的MAGE-A3表达阳性肿瘤包括(但不限于):黑色素瘤、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、乳腺癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤、卵巢肿瘤、消化道肿瘤(如胃癌、食道癌、结肠直肠癌等)。在本发明的第七方面，提供一种组合物，其包含有效量的所述的蛋白和药学上或免疫学上可接受的载体或佐剂。在一个优选例中，所述的组合物是疫苗。在本发明的第八方面，提供一种药盒，所述的药盒中包含至少一个容器，所述容器中含有所述的蛋白或所述的组合物；或者所述的药盒中含有一固相载体，所述的固相载体上包被有所述的蛋白。另一方面，提供一种制备检测MAGE-A3表达阳性肿瘤的药盒(试剂盒)的方法，所述方法包括(I)将所述的B细胞表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板),获得包被了所述的表位重组蛋白的固相载体；和(2)将⑴获得的包被了所述的B细胞表位重组蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测MAGE-A3表达阳性肿瘤的药盒。另一方面，提供一种检测MAGE-A3表达阳性肿瘤的方法，所述方法包括(I)将所述的B细胞表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板),获得包被了所述的细胞表位重组蛋白的固相载体；和(2)将待测样本(如血清)加样于⑴获得的包被了所述的细胞表位重组蛋白的固相载体上；从而使固相载体中的细胞表位重组蛋白与待测样本中的特异性IgG或IgA结合，形成带有“B细胞表位重组蛋白-IgG或IgA” 二元复合物的固相载体；(3)将抗特异性IgG或IgA的抗体加样于(2)获得的固相载体，从而形成带有“抗特异性IgG或IgA的抗体-特异性IgG或IgA-B细胞表位重组蛋白”三元复合物的固相载体；且所述的抗特异性IgG或IgA的抗体携带一可检测信号(标记物)；(4)检测(3)获得的三元复合物中的可检测信号，从而确定待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在的量。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图I.各种不同参数对MAGE-A3的B细胞表位预测结果A.亲水性参数；B.极性参数；C.柔韧性参数；D.表面可能性；E.抗原性图2. pET32a (+) /MAGE-A3 B细胞表位重组质粒PCR电泳鉴定。I :BL21 ;2 :pET32a(+)空载体；3 :pET32a (+)/MAGE-A3 表位 I (5_23aa) ;4 :pET32a(+)/MAGE-A3 表位 2(112_131aa) ；5 pET32a(+)/MAGE-A3 表位 3 (232_246aa) ；6 ADNA/Hindlll DNA Marker。 图3. pET32a (+) /MAGE-A3B细胞表位重组质粒测序鉴定三个B细胞表位氨基酸序列经测序鉴定完全正确。 图4. MAGE-A3B细胞表位重组蛋白的SDS-PAGE⑷和Western blot⑶分析。I :蛋白分子标准物；2 pET32a(+)载体蛋白(Trx-His) 3 :pET32a(+)/MAGE-A3 表位 l(5-23aa)蛋白；4 :pET32a (+)/MAGE-A3 表位 2 (112_131aa)蛋白；5 pET32a (+) /MAGE-A3表位 3 (232-246aa)蛋白；图5. MAGE-A3B细胞表位重组蛋白纯化后的SDS-PAGE分析。I :标准分子量蛋白Marker ;2 :纯化Trx-His蛋白；3 :纯化MAGE-A3表位
I(5-23aa)蛋白蛋白；4 :纯化MAGE-A3表位2 (112_131aa)蛋白；5 :纯化MAGE-A3表位3 (232-246aa)蛋白图6. ELISA检测免疫小鼠血清中各B细胞表位特异性IgG抗体水平的时间变化趋势。A MAGE-A3 表位 I (5_23aa)蛋白；B :MAGE_A3 表位 2 (112_131aa)蛋白；C :MAGE_A3表位 3 (232-246aa)蛋白。图7.胃癌患者血清为一抗MAGE-A3各B细胞表位蛋白的Western blot分析I pET32a(+)载体蛋白(Trx-His) 2 :pET32a (+)/MAGE-A3 表位 I (5_23aa)蛋白；3 :pET32a(+)/MAGE-A3 表位 2(112-131aa)蛋白；4 :pET32a (+)/MAGE-A3 表位 3 (232_246aa)蛋白；图8.胃癌、乳腺癌、胃炎及健康人血清中各B细胞表位蛋白特异性IgG抗体的ELISA检测。胃癌和乳腺癌组患者血清与胃炎患者和健康对照组血清相比，P < O. 05。图9. MAGE-A3各B细胞表位蛋白检测胃癌、乳腺癌、胃炎及健康人血清的阳性率。胃癌和乳腺癌组患者血清与胃炎患者和健康对照组阳性率相比P < O. 05。
具体实施例方式本发明人经过深入的研究，以全长的MAGE-A3蛋白为基础，采用生物软件及网络资源预测并筛选了 MAGE-A3中含B细胞表位氨基酸序列，同时兼顾CTL、Th表位，获得本发明的B细胞表位重组蛋白，所述重组蛋白具有很强的免疫原性和抗原性。术语如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。如本文所用，“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的疫苗诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所述的“免疫优势表位”或“优势表位”是指富含CTL、Th和B细胞表位的氨基酸序列的重组蛋白；该蛋白或含有该蛋白的组合物可引发哺乳动物免疫应答。如本文所用，“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们可以抑制或防止肿瘤；或防止或抑制表达MAGE-A3的肿瘤。如本文所用，“对象”、“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。如本文所用，“核酸”和“核酸序列”指聚合形式的任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)。它包括(但不限于)单链、双链的DNA或RNA，基因组DNA和cDNA。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂或稀释剂。如本文所用，“有效量”或“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。如本文所用，“待测样本(样品)”包括但不限于血液、血清、唾液。如本文所用，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由......构
成”、“基本上由......构成”、和“由......构成”；“主要由......构成”、“基本上
由......构成”和“由......构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。如本文所用，除非另外说明，所述的“本发明的B细胞表位重组蛋白”、“表位重组蛋白”、“MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白”、“MAGE-A3表位”、“MAGE-A3表位蛋白”、“表位重组蛋白”；“5-23aa”与“表位I”或“MAGE-A3 B细胞表位I”可互换使用；“ 112_131aa”与“表位2”或“MAGE-A3表位2”可互换使用；“232_246aa”与“表位3”或“MAGE-A3表位3”可互换使用。B细胞表位重组蛋白及其编码基因目前现有技术中，针对MAGE-A3的疫苗尚未成功上市。因此，本发明人以全长的MAGE-A3蛋白为基础，预测并筛选三段富含T、B细胞免疫优势表位的氨基酸序列，经过反复研究比较，从而获得了本发明的B细胞表位重组蛋白。所述蛋白的氨基酸序列分别为(a)MAGE-A3上第5-23aa位氨基酸序列；和(b)MAGE_A3上第112-131位氨基酸序列；和(c)MAGE-A3上第232-246aa位氨基酸序列。所述的表位重组蛋白可诱导产生高效价的抗体，且可长期保持高的抗体效价。作为本发明的优选方式，所述的表位重组蛋白具有6-20个氨基酸，较佳地具有6-14个氨基酸，更佳地具有6-10个氨基酸。本发明人通过免疫小鼠来检测所述的联合细胞表位重组蛋白的免疫原性，即通过ELISA方法检测小鼠血清IgG抗体滴度及维持时间进行评价。通过基于MAGE-A3 B细胞表位的ELISA方法检测肿瘤患者血清特异性抗体,及利用该特异性血清抗体进行Western blot检测，进一步利用联合细胞表位重组蛋白免疫后小鼠血清抗体，以评价MAGE-A3B细胞表位蛋白的抗原性。结果证实，本发明的B细胞表位重组蛋白具有较强的免疫原性和抗原性，既能刺激机体产生较强的特异性体液免疫效应,又能作为ELISA抗原检测肿瘤患者的血清特异性抗体，且以胃癌患者血清作为所述的B细胞表位重组蛋白为一抗,经Western blot检测筛选的三个B细胞表位均可出现特异性目的条带。因此，所述的B细胞表位重组蛋白可应用于防治表达MAGE-A3抗原肿瘤的表位疫苗研究，也可应用于表达MAGE-A3抗原肿瘤患者特异性血清抗体检测诊断试剂的研究。本发明还提供了编码所述的B细胞表位重组蛋白的分离的核酸，也可以是其互补链。任何编码所述的B细胞表位重组蛋白的核酸都适用于本发明，碱基密码子的简并性是本领域人员所了解的。下文实例中提及的序列都适用于本发明的方法。优选地，所述的核酸具有SEQ ID NO :7中第5-23位、第112-131位以及第232-246位所示的核苷酸序列，能够有效表达所述的B细胞表位重组蛋白，并且表达获得的蛋白免 疫原性和抗原性强。本发明B细胞表位重组蛋白的编码核酸序列，可以全序列人工合成，也可用PCR弓丨物(单链核苷酸片段)直接退火的方法分别获得SEQ ID NO :4、N0 :5及NO 6中第5_23位、第112-131位以及第232-246位所示的核苷酸序列，形成编码本发明联合细胞表位重组蛋白的核苷酸序列。载体及宿主细胞在获得了编码本发明的核酸序列之后，可将其连接入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。本发明中，术语“载体”与“重组载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。本发明中可使用选自下组的载体真核表达载体或原核表达载体，优选细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、或哺乳动物细胞病毒，更优选 pcDNA3. I (+)、pSIREN-NEO、pET32a (+)、pQE30、pGEX_4T_l 或 pPICZA。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞、动物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。在本发明中，优选采用E. coli细胞、C0S-7细胞、C0S-1细胞、GS115细胞。本发明还提供了利用所述重组载体和宿主细胞来制备所述的B细胞表位重组蛋白的方法，所述方法包括培养所述的宿主细胞，使所述细胞产生所述的蛋白。一种优选的方法是将本发明的B细胞表位重组蛋白的编码序列克隆至pET32a(+)质粒中，构建重组表达质粒pET32a(+)/MAGE-A3 B细胞表位，并转化E. coli BL21菌株中表达所述的B细胞表位重组蛋白，经镍螯合亲和层析胶体纯化获得纯化的蛋白。含有编码所述的联合优势表位重组蛋白的核酸序列的重组载体也可作为一种DNA疫苗，可将其免疫个体以产生免疫应答。含有所述的重组载体的宿主细胞也可作为一种细胞疫苗，可将其免疫个体以产生免疫应答。
组合物本发明还提供了包含本发明的B细胞表位重组蛋白的各种组合物，特别是药物组合物，所述的组合物也包括疫苗。该组合物可用于预防或治疗表达MAGE-A3抗原相关疾病，所述疾病包括(但不限于)黑色素瘤、肺癌、头颈部鳞状细胞癌、肝细胞癌、骨肉瘤、白血病、膀胱癌、脑瘤、卵巢肿瘤、消化道肿瘤(如胃癌、食道癌、结肠直肠癌等)和乳腺癌等。包含本发明的B细胞表位重组蛋白的各种组合物可以包含按B细胞表位重组蛋白的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择合适的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington，s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第 19 版(1995) Mack Publishing Co·)。可将本发明的组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬 浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别 的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适PH值的各种缓冲剂和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。当用作疫苗时，所述的疫苗可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。另外，本发明的疫苗的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi 佐剂(Ribi Tmmuno Chem Research In. ,Hamilton,MT) ；Montanide ISA佐剂(Seppic, Paris, France) ;Hunter，s TiterMax 佐剂(CytRx Corp.，Norcross, GA) ；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany)等。另外,在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分(IL-12、CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)等)。当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的B细胞表位重组蛋白施用于对象。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。给予本发明组合物的常规和药学上可接受的途径包括鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。应以“有效量”给予本发明的B细胞表位重组蛋白，即B细胞表位重组蛋白的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使宿主产生抗肿瘤免疫。在各疫苗剂份中所选用的B细胞表位重组蛋白的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，给予约O. 01 μ g-10mg B细胞表位重组蛋白/kg体重，优选O. I μ g-lmg B细胞表位重组蛋白/kg体重,更优选O. I μ g-100 UgB细胞表位重组蛋白/kg体重。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的B细胞表位重组蛋白的免疫应答。药盒或试剂盒本发明还提供了一种防治MAGE-A3抗原表达阳性肿瘤的药盒，其中含有本发明的B细胞表位重组蛋白或含有该蛋白的组合物。此外，为了方便给药，所述的药盒中还可含有注射用的针，和/或药学上可接受的载体，和/或使用说明书。本发明还提供了一种检测MAGE-A3抗原表达阳性肿瘤的药盒(试剂盒)，所述的药盒中含有一固相载体，所述的固相载体上包被有所述的B细胞表位重组蛋白。所述的药盒(试剂盒)的制备方法包括(I)将所述的B细胞表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的B细胞表位重组蛋白的固相载体；和⑵将⑴获得的包被了所述的B细胞表位重组蛋白的固相载体置于试剂盒中，从而获得检测MAGE-A3抗原 表达阳性肿瘤的药盒。所述药盒中还可包括装在适当容器中的、用于检测抗原-抗体反应的试剂(如酶联免疫试剂)，或用于基因扩增的试剂(如PCR试剂)，和/或还包括使用说明(书)。检测用途本发明所述B细胞表位重组蛋白，可用于制备检测MAGE-A3抗原表达阳性肿瘤疾病的血清抗体或粘膜分泌物抗体的ELISA检测试剂。因此，本发明还提供一种检测MAGE-A3抗原表达阳性肿瘤的方法，所述方法包括(I)将所述的B细胞表位重组蛋白包被于固相载体(如ELISA反应板)，获得包被了所述的B细胞表位重组蛋白的固相载体；(2)将待测样本(如血清或粘膜分泌物)加样于(I)获得的包被了所述的B细胞表位重组蛋白的固相载体上；从而使固相载体中的B细胞表位重组蛋白与待测样本中的特异性IgG或IgA结合，形成带有“B细胞表位重组蛋白-IgG或IgA”二元复合物的固相载体；⑶将抗特异性IgG或IgA的抗体加样于(2)获得的固相载体，从而形成带有“抗特异性IgG的抗体-特异性IgG或IgA-B细胞表位重组蛋白”三元复合物的固相载体；且所述的抗特异性IgG或IgA的抗体携带一可检测信号(标记物)；(4)检测
(3)获得的三元复合物中的可检测信号，从而确定待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在的量。在确定了所采用的包被抗原和检测抗体后，可以采用本领域常规可用的各种标记物。本发明对所采用的标记物没有特别的限制，只要是能够与所述的检测抗体结合，且在适当处理后能够准确地指示待测样本中特异性IgG或IgA的存在与否以及存在量的标记物均是可用的。例如，所述的标记物可以选自(但不限于)辣根过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、葡萄糖氧化酶、β -D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化氢酶、或葡萄糖淀粉酶。当采用如上所示的一些酶标记物时，还需要采用一些与相应的酶结合的底物，从而可通过显色等方式来报导标记物的存在情况或者存在量。所述的底物例如(但不限于)用于辣根过氧化物酶的邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)、ABTS ;用于碱性磷酸酯酶的对硝基苯憐酸酯(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)。本发明的主要优点在于
(I)本发明的MAGE-A3 B细胞表位蛋白具有很强的免疫原性和抗原性，为MAGE-A3细胞表位的深入研究和应用奠定基础，具有重要的科研价值。(2)本发明人对所述B细胞表位重组蛋白具较强的免疫原性，且对动物无毒副作用，具有广阔的应用前景。(3)本发明的MAGE-A3B细胞表位蛋白作为检测试剂，在检测MAGE-A3表达阳性肿瘤的诊断方面具有重要的应用价值，其检测方法简单易行、成本低廉，而且具有较强的特异性和较高的敏感性。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如 Sambrook 等人,分子克隆实验室指南(New York Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意·义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1、MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白的制备与鉴定I. MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白基因的设计从网络资源数据库(Genbank，Swiss-Prot)获取MAGE-A3蛋白基因序列和氨基酸序列；利用在线网络资源(EXPASY)及生物软件DNASTAR对MAGE-A3氨基酸序列的抗原性、表面可及性、柔韧性及跨膜区等参数进行分析(图I)，同时辅以MAGE-A3蛋白质二级结构的分析结果，分析比较各参数综合评判MAGE-A3的B细胞优势表位。同时，利用SYFPEITHI等软件对MAGE-3进行HLA-A2等CTL表位及HLA-DR的Th表位进行预测。对候选表位分别计算其多项式系数进行分析，最终确定候选抗原的特异性的T表位。经过上述表位预测，结合本发明人的反复试验和选择，结果获得了来源于MAGE-A3蛋白的三段氨基酸序列，它们为潜在的B细胞优势表位及其高分值的HLA-A2、A24限制性的CTL表位及HLA-DRB限制性的Th表位，分别位于MAGE-A3蛋白氨基酸序列的5aa_23aa、112aa-131aa、232aa_246aa 处，长度分别为 19、20、15 个氨基酸。根据上述的表位信息，得到MAGE-A3蛋白免疫优势表位蛋白氨基酸序列表如SEQID NO UN0 :2和NO 3 ;将上述三段氨基酸序列经原核密码子优化后，获得相对应的SEQ IDNO :4、NO :5和NO 6的MAGE-A3B细胞表位目的基因。2. MAGE-A3 B细胞表位基因的合成及重组表达质粒的构建和鉴定由北京三博远志生物技术有限公司合成具有所述序列的MAGE-A3免疫优势表位的单链核苷酸(SEQ ID NO :4、NO :5和NO :6)，经退火并克隆到pET32a (+)(Novagen)中BamH I/Xho I位点。以重组质粒为模板，用pET32a(+)的T7启动子序列(5 ‘taatacgactcactataggg 3’)和目的下游引物进行PCR反应，在650bp位置左右出现DNA条带(图2)，进一步测序鉴定证实(图3)，成功构建了 pET32a(+)/MAGE-A3B细胞表位重组质粒。3. MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白的原核表达、纯化和鉴定将pET32a(+)/MAGE-A3 B细胞表位重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，经37°C震荡培养过夜。取过夜菌I : 100稀释后接种于3ml含Amp的LB培养液中，37°C震荡培养至A600 = 0 . 6时，加入IPTG (终浓度为lmmol/L)37°C诱导4小时，离心收集细菌，经PBS洗涤、离心、超声破菌，进行SDS-PAGE分析B细胞表位蛋白的分子量大小，见图4A。进一步以小鼠His抗体(购自MBI公司)为一抗，HRP标记山羊抗小鼠IgG(H+L)(购自MBI公司)作为二抗，用Western blot方法检测B细胞表位蛋白的特异性，见图4B。同时诱导后细菌经超声裂解后收集上清，并经镍螯合亲和层析胶体纯化，进行SDS-PAGE蛋白电泳分析(图5)，结果成功制备了 MAGE-A3B细胞表位重组蛋白，并在原核表达系统中得到成功表达。实施例2、MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白的免疫原性研究选择6 8周龄雌性BALB/c小鼠随机分为5组，每组9只第1_3组分别为MAGE-A3B细胞表位蛋白免疫组，第4组为载体蛋白Trx-His对照组及PBS空白对照组。B细胞表位蛋白与弗氏佐剂(FCA)I 1(W/W)充分乳化均匀，分别于0、2、4周，每只小鼠SOygB细胞表位蛋白或空载体蛋白，背部皮下多点免疫小鼠。对免疫小鼠进行体液免疫效应的检测，即特异性的血清IgG的效价和维持时间。
在0、3、5、7、12周每组小鼠通过断尾取血用ELISA方法检测血清IgG抗体的水平。I.免疫小鼠血清特异性IgG抗体的测定结果分别以纯化的MAGE-A3的三个B细胞表位蛋白包被ELISA反应板，加入I 100稀释的血清样品，二抗为山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP(购自MBI公司)，底物是邻苯二胺(OPD)，反应结果置酶标仪测0D490值。结果显示，表位蛋白组分别产生了高水平的分别针对MAGE-A3的B细胞表位蛋白特异性IgG抗体(图6A，B, C)，至第7周达到高峰，表位免疫组动物血清 OD 值(O. 954±O. 082 ；0. 999 ±O. 098 和 O. 706 ±O. 162)显著高于 pET32a (+)(O. 338±0· 064 ；0. 298±0· 028 ；0. 326±0· 033) (P < O. 05)。以MAGE-A3B细胞表位诱导小鼠血清抗体，其滴度随免疫时间的增加而升高，自第3周起，至少可以维持到第12周。实施例3、MAGE-A3 B细胞表位重组蛋白的抗原性研究I. Western blot 检测将纯化的MAGE-A3各B细胞表位重组蛋白进行SDS-PAGE蛋白电泳，同时以纯化的His-Trx蛋白作为阴性对照，转膜后，以I : 100稀释的胃癌患者血清(获自温州医学院附属第一医院，均经临床诊断和组织病理学检查证实为胃癌的患者)为一抗，HRP标记抗人IgG(H+L)(购自eBioscience)作为二抗,用Western blot方法检测联合细胞表位蛋白的抗原特异性。结果显示(图7)，MAGE-A3的三个B细胞表位蛋白均可与胃癌患者血清发生特异性的结合，在分子量约20KD出现一条特异性条带，而阴性对照则无。 2.肿瘤患者血清特异性MAGE-A3抗体的ELISA检测(I)以纯化的MAGE-A3 B细胞表位蛋白为抗原，检测临床胃癌和乳腺癌肿瘤患者特异性IgG血清分别以5 μ g/ml的MAGE-A3B细胞表位蛋白包被ELISA反应板，加入按照I : 100稀释的待测者血清标本，包括210例胃癌患者、108例乳腺癌患者、56例慢性胃炎患者及116例健康对照者。每个标本重复三个复孔。二抗为HRP标记抗人IgG(H+L)(购自eBioscience)，反应结果置酶标仪测0D490值。
以MAGE-A3B细胞表位蛋白为抗原检测各组患者血清特异性IgG(图8)，结果显示，胃癌和乳腺癌患者组血清与慢性胃炎组和健康人对照组(MAGE-A3表位I特异性IgG均值分另Ij 为0. 802±0. 149，O. 498±0. 181，0. 216±0. 103，O. 274±0· 081 ；MAGE-A3 表位
2特异性 IgG 均值分另Ij 为0. 810±0. 185，O. 495±0. 161，O. 251 ±0. 104，O. 200±0· 084 ；MAGE-A3 表位 3 特异性 IgG 均值分别为0. 628±0. 118，O. 481 ±0. 183，O. 231 ±0. 102，0.276±0.081)相比，胃癌和乳腺癌患者组与胃炎组和健康人对照组均有显著性差异(P< O. 05)，而胃炎组与健康人对照组比较则无显著性差异(P > O. 05)。(2) ELISA检测肿瘤患者血清抗体的阳性率分析目前，临床上通常采用RT-PCR方法检测肿瘤组织中的MAGE-A3基因(mRNA)作为MAGE-A3抗原表达阳性的筛查和辅助诊断并指导治疗的主要生物学方法。以纯化的MAGE-3B细胞表位蛋白作诊断抗原，用间接ELISA法检胃癌患者(210例)、乳腺癌患者患者(108例)、慢性胃炎患者(56例)及健康对照者(116例)血清特异性抗体IgG。以分析 MAGE-A3B细胞表位-IgG血清抗体检测用于检测胃癌及乳腺癌等肿瘤患者的阳性率。根据健康对照组血清平均A值计算出阳性判定值(即Cut off值=健康对照组血清抗体平均A值+3S)，以此评估胃癌患者及乳腺癌患者的血清抗体阳性检出率及ELISA方法诊断胃癌及乳腺癌的敏感度和特异度。血清抗体阳性临界值(cut off)计算参见文献 Heim k 等；Serum IgG, IgM, and IgA reactivity to human papillomavirus types
11and 6 virus-like particles indifferent gynecologic patient groups. J InfectDise, 1995,172 :395-402 ;Carter JJ 等；Use of human papillomavirus type 6 capsidsto detect antibodies in people with genital warts. J Infec Dise,1995,172 :11-18 ;Marais DJ 等；Seroresponses to human papillomavirus types 16,18,31,33, and 45virus-like particles in South African women with cervical cancer and cervicalintraepithelial neoplasia. J Med Virol, 2000,60 :403-430,即为健康对照的平均 OD 值+3SD。据此，MAGE-A3 B细胞表位-IgG用于诊断乳腺癌和胃癌的cut off值分别为分别为0. 517,0. 620,0. 519 (即以MAGE-A3的表位I、表位2和表位3为ELISA包被抗原时，患者血清OD值分别大于彡0.517、0. 620、0. 519判断为阳性，否则为阴性)，判断胃癌组、乳腺癌组、慢性胃炎组和健康对照组抗体阳性率显示MAGE-A3B表位I蛋白的阳性率分别为65. 71%
(138/210)、27· 78^(30/108)、7· if 4/56) 0/116) ； MAGE-A3 B 表位 2 蛋白的阳性率分别为 47. 6於ΙΟΟ/·} ,21. 29^23/108) ,1. 7^1/56) ^0/116) ；MAGE-A3 B 表位 3 蛋白的阳性
率分别为 35. 72,75/210)、24. 0026/108)、3. 502/56)、(^0/116)，各组间阳性率有统计学意
义(P < 0. 05)，而胃炎与健康组比较则无统计学意义(P > 0. 05)。(图9)。综上，本发明基于现有技术的研究基础(I)预测和筛选了 MAGE-A3 B细胞表位基因、构建了 MAGE-A3 B细胞表位重组质粒pET32a(+)/MAGE-A3 B细胞表位和纯化并制备了 MAGE-A3 B细胞表位蛋白。(2)通过动物实验充分地证实了本发明的MAGE-A3 B细胞表位蛋白具有较强的免疫原性，能诱导机体产生特异的体液免疫。小鼠经背部皮下注射的方式免疫，能够有效激发体液免疫，具有免疫过程简单、接种安全、效果明显、可重复性强等优点。(3)通过ELISA检测胃癌和乳腺癌肿瘤患者的血清特异性抗体及Western blot检测，证实本发明的B细胞表位蛋白具有较强的抗原性，即MAGE-A3B细胞表位蛋白作为ELISA抗原，检测MAGE-A3表达阳性肿瘤患者的血清特异性抗体水平，并以胃癌患者特异性抗体血清作为一抗，经Westernblot检测可出现MAGE-A3 B细胞表位蛋白特异性条带。以MAGE-A3 B细胞表位蛋白作为ELISA诊断抗原，在检测MAGE-A3表达阳性肿瘤，尤其胃癌和乳腺癌的诊断方面具有重要的应用价值，该检测方法不仅简单易行、成本低廉，而且具有较强的特异性和较高的敏感性等特点。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后 ，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
权利要求
1.来自人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白的三个分别含多个T和B细胞表位(免疫优势表位)的氨基酸序列分别为 (a)MAGE-A3蛋白上第5_23位氨基酸序列；和 (b)MAGE-A3蛋白上第112-131位氨基酸序列；和 (c)MAGE-A3蛋白上第232-246位氨基酸序列。
2.如权利要求I所述的蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列分别如SEQIDNO :1、N0 2 和 NO 3 所示。
3.来自MAGE-A3蛋白的三个B细胞表位的核酸，所述核酸编码权利要求I所述的蛋白。
4.如权利要求3所述的核酸，其特征还在于，所述的核酸的核苷酸序列分别选自 (1)SEQID NO :4所示的核苷酸序列；和 (2)SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列；和 (3)SEQ ID NO :6所示的核苷酸序列。
5.一种重组载体，所述载体包含权利要求3或4所述的核酸。
6.—种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞 (i)含有权利要求5所述的载体；或 ( )基因组中整合有权利要求3或4所述的核酸。
7.一种制备权利要求I所述的蛋白的方法，所述方法包括培养权利要求6所述的细胞，使所述细胞产生所述的蛋白。
8.如权利要求I所述的蛋白、权利要求3或4所述的核酸、权利要求5所述的重组载体或权利要求6所述的宿主细胞在制备用于预防、治疗或诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤的组合物中的用途。
9.一种组合物，其包含有效量的权利要求I所述的蛋白和药学上或免疫学上可接受的载体或佐剂。
10.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中包含至少一个容器，所述容器中含有权利要求I所述的蛋白或权利要求9所述的组合物；或者所述的药盒中含有一固相载体，所述的固相载体上包被有权利要求I所述的蛋白。
全文摘要
本发明涉及人黑色素瘤抗原MAGE-A3蛋白B细胞表位重组蛋白的制备及应用。本发明公开了一种以全长的MAGE-A3蛋白为基础筛选获得的3个含B细胞表位的多肽。本发明还公开了所述B细胞表位多肽的编码氨基酸和核苷酸序列。本发明还公开了所述B细胞表位多肽在预防、治疗和诊断MAGE-A3表达阳性肿瘤中的用途。本发明所述的MAGE-A3蛋白B细胞表位重组蛋白具有很强的免疫原性和抗原性，应用前景良好。
文档编号C12P21/02GK102863515SQ20111018839
公开日2013年1月9日 申请日期2011年7月5日 优先权日2011年7月5日
发明者朱冠保, 张丽芳, 程骏, 朱珊丽, 刘纳新, 薛向阳, 沈贤, 陈俊 申请人:温州医学院