专利名称：：显示mcsp的表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法
技术领域：
：本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，具体涉及肿瘤细胞的细胞毒性的介导；最具体地涉及使用癌性疾病调节抗体(CDMAB),可选地与一种或多种化疗剂组合，作为手段来引发细胞毒性反应。本发明进一步涉及〗吏用本发明的CDMAB的结合测定。
背景技术：
：黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MSCP)是由开发了针对人类转移黑色素瘤细胞系的单克隆抗体的数位研究者各自独立地鉴定的。有数种抗体被发现与黑色素瘤细胞表面相关的特定抗体反应。由于这些抗体是相互独立地开发的，造成目标抗原的名称多种多样，后来所有这些名称都被确定为MCSP。因此，MCSP又被称为高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA),人黑色素瘤蛋白聚糖(HMP)，黑色素瘤-相关蛋白聚糖抗体(MPG)和黑色素瘤硫酸软骨素蛋白聚糖(mel-CSPG)，而且还被鉴定为多种特异性抗体的抗原，这些抗体中的一些已在下文中列出。还发现MCSP与大鼠蛋白聚糖NG2有超过80%的同源性，因此也被称作该名字。MCSP是糖蛋白-蛋白聚糖复合物，由250kDa的N-联糖蛋白和>450kDa的蛋白聚糖组分构成。核心糖蛋白存在于黑色素瘤细胞表面，或者作为游离的糖蛋白，或者作为附加了硫酸软骨素的修饰的糖蛋白。通过MSCP的分子克隆鉴定了数种结构特征。存在3个胞外域，其总共含有10个半胱氨酸(5个可能的二硫桥)，15个可能的N-联糖基化位点，和U个可能的硫酸软骨素附着位点。跨膜片段具有一个单独的半胱氨酸，但该残基功能上的重要性还没有得到证明。胞质域具有3个苏氨酸残基，它们可能充当蛋白激酶C的磷酸化位点，尽管目前尚未显示MCSP是磷酸化的。已经证实MCSP在大多数黑色素瘤癌中表达，而且原本认为其在正常细胞和其他种类的肿瘤中的分布非常有限。导致这一结论的一项早期的研究对用曱醛或曱醇固定的组织进行免疫组化(IHC)以确定MCSP的分布，其使用了抗MCSP抗体B5。在这项研究中，发现抗体B5与22种被测试的黑色素瘤中的17种反应，与2种星细胞瘤中的2种反应，而不与23种癌中的任何一种反应。在22种被测试的正常组织中，发现B5只与皮肤角质形成细胞、肺泡上皮和毛细血管内皮结合。另外一项研究考察了MSCP的组织分布，其是使用冷冻组织切片由抗MCSP抗体9.2.27来确定的。仍然，在所有被测试的黑色素瘤组织和细胞系中都发现了反应性，但6种不同癌中的任一种中都没有发现反应性。在被测试的7种胎儿组织中，只有皮肤中观察到反应性，主动脉中观察到微弱的反应性，而在成人组织中，在被测的13种组织中只有3种观察到了反应性。接下来的一项研究使用抗MCSP抗体B5,9.2.27，225.28S和A0122考察了MCSP的分布，所有这些抗体都识别MCSP的独特表位。这项研究是对冷冻组织进行的。发现所有的抗MCSP抗体都有相似的染色图案，它们与正常的和恶性的、来源于神经、间质和上皮的肿瘤发生反应，这些肿瘤先前被认为是MSCP阴性的。具体地，抗体B5与24种被测器官中的多种上皮、结締、神经和肌肉组织发生反应，并且与34种不同的肿瘤中的28种发生反应。作者解释说，他们的发现与先前的报道的不同，是由于使用了改良的、稳定性更好的IHC技术；并指出固定剂的选择是重要的，可能导致这样的结论，即MSCP抗原的一个重要特征是其对IHC中所涉及的处理步骤的敏感性。进行了一项进一步的研究以在超微结构水平上定位MCSP。使用电子显孩i术的免疫定位显示，MSCP几乎专一地定位于孩i端丝(microspikes)，这是黑色素瘤细胞表面的一个微域，可能在细胞-细胞接触和细胞-基质粘附(cell-substratumadhesion)中起作用。1996年MCSP的分子克隆使得利用MCSPcDNA探针对肿瘤细胞系和正常人类组织的MCSP表达进行Northern印迹分析成为可能。在被测试的8种不同的肿瘤细胞系中，只有在黑色素瘤细胞系中观察到了MCSP表达。在被测试的16种正常成人组织和4种正常胎儿组织中，没有任何一种观察到MCSP表达。不同的MCSP组织定位研究中发现的不一致之处，提示可能需要进一步的研究，来阐明这种抗原的真实表达模式或者解释这些已报道的不同。由于已知蛋白聚糖调节细胞-细胞和细胞-细胞外基质(ECM)相互作用，考察了MCSP在这些过程中的作用。已经证实MCSP刺激04/3r整联蛋白介导的粘附和黑色素瘤细胞的扩散，而且还有人提出通过MCSP核心蛋白的信号传导诱导pl30eas的募集和酪氨酸磷酸化，其可以调节细胞粘附和运动性，对肿瘤的侵入(invasion)和转移作贡献。这些结果一起提示，MCSP可能促进黑色素瘤细胞的粘附通过激活整联蛋白并且激活导致细胞骨架重排(cytoskeletalrearrangement)的途径。MCSP还被发现与膜-类型3基质金属蛋白酶(MT3-MMP)相联系，可能是通过MCSP的硫酸软骨素组分。有人提出体内黑色素瘤中MT3-MMP的表达可以促进生长着的肿瘤附近的ECM蛋白的降解，提供肿瘤以扩张的空间。因此，MT3-MMP和MCSP之间的联系可能是一个激活步骤，以促进黑色素瘤的侵入。已经利用抗MCSP抗体进行了数个体外测试来考察MCSP在肿瘤侵入和转移相关联的过程中所起的作用。利用抗体9.2.27测试了MCSP在非贴壁依赖的生长(anchorage-independentgrowth)中的作用。在含有9.2.27的软琼脂中培养的黑色素瘤细胞在其集落形成中显示出67-74%的特异性下降。这些发现提示，MCSP可能参与细胞-细胞相互作用，并对非贴壁依赖的生长有贡献。同一作者还在测量M14黑色素瘤细胞在牛主动脉内皮(BAE)细胞基底膜上的粘附的测试中，考察了用9.2.27阻断MCSP的效果。将9.2.27处理的效果与用对照单克隆抗体W6/32(针对所有I类组织相容性抗原)的处理相比较。M14对照细胞和抗体预处理过的M14细胞一皮铺到BAE细胞的基底膜上。在9.2.27处理的细胞中观察到了达27%的显著的细胞粘附抑制，而在W6/32处理的细胞中没有观察到显著的效果。用9.2.27预处理细胞造成的一个更引人注意的效果是细胞扩散的抑制，这是使用扫描电子显微术在超微结构水平证实的。许多针对黑色素瘤开发的、并且被确定为特异地识别MCSP的抗体已经接受了体内和体外测试，以确定它们的抗癌效果。单克隆抗体9.2.27识别MCSP的核心糖蛋白组分，而且是最早被研究其抑肿瘤性质的抗体之一。Bumol等研究了9.2.27及9.2.27的白喉毒素A交联物用于在棵鼠中生长的黑色素瘤肿瘤的免疫治疗。首先进行了体外的细胞毒性测试，测量9.2.27和9.2.27-DTA交联物对M21人类黑色素瘤细胞中蛋白质合成的影响，由蛋白质中["S]曱硫氨酸的掺入来指示。9.2.27-DTA交联物显著地抑制M21黑色素瘤细胞中的蛋白质合成，尽管用未交联的DNA产生的作用更强。单独使用9.2.27时仅取得了最低的效果。在负荷人类黑色素瘤的棵鼠中考察了9.2.27和9.2.27-DTA交联物的抗肿瘤作用。对小鼠皮下种植M21肿瘤，并寸吏成瘤生长3天，然后在第三天，及从此以后每隔三天，用9.2.27或9.2.27-DTA交联物处理小鼠。将接受处理的小鼠的肿瘤体积与未备处理的对照小鼠进行比较。与未处理的对照比较，在第18天(数据报道的最后一天)，用9.2.27处理的小鼠显示64%的肿瘤生长抑制，而用9.2.27-DTA处理的小鼠显示52%的肿瘤生长抑制。在这个初步实验中，作者作出结论9.2.27和9.2.27-DTA交联物抑制棵鼠中M21黑色素瘤生长的效果大致相等。该初步研究报道了9.2.27处理体内抑制肿瘤生长，但后来的一些研究，包括相同作者进行的研究，显示棵露的9.2.27在体内没有显示任何抗肿瘤效果。总结起来，如下所列，考察使用9.2.27处理人类肺瘤的有用性的实验已经显示，尽管9.2.27靶向癌细胞，但用此净果露抗体处理并没有产生抗癌活性。进行了一项I期临床试验，其设计为施用大剂量的9.2.27,以备使用9.2.27免疫交联物(immunoconjugates)进行后续治疗研究。根据流式细胞术和/或免疫过氧化物酶染色，8名恶性黑色素瘤患者的肺瘤与9.2.27反应，这8名患者通过静脉注射接受单次剂量的抗体，每周两次，剂量按1,10,50,100和200mg阶段性升高。尽管这些患者中没有人经受了显著的毒性，而且9.2.27定位到了转移的黑色素瘤结节(metastaticmelanomanodules),但没有观察到临床反应。在后来的一项研究中，将9.2.27与化疗剂多柔比星(doxorubicin,DXR)交联，并考察该交联物在体内和体外的黑色素瘤生长抑制作用。用DXR-9.2.27交联物处理的M21细胞的生长抑制通过[311]胸腺嘧啶核苷掺入分析来测量。该交联物对M21靶细胞显示特异性的剂量依赖的生长抑制作用，而对MCSP阴性对照细胞系不显示作用。没有进行考察单独的9.2.27的作用的体外测试。为了在体内考察DXR-9.2.27交联物，皮下注射M21细胞，使其经过8-10天成瘤。在第IO天及此后每隔三天进行静脉注射。只有在用DXR-9.2.27交联物处理的小鼠中观察到了显著的肿瘤生长抑制作用。单独的DXR处理和单独的9.2.27处理都未能抑制肿瘤生长；9.2.27和DXR的混合物也显示相似的阴性结果。进行另外一项研究考察一种9.2.27交联物的效果。Schrappe等将化疗剂4-去乙酰长春碱-S-羧基酰肼(DAVLBHY)与9.2.27交联，并测试其对人胶质瘤的作用。用U87MG(—种人胶质瘤细胞系)细胞皮下注射棵鼠，在第2，5,7，9天处理这些动物。9.2.27-DAVLBHY交联物最有效地缩小了胂瘤体积。用PBS或单纯的9.2.27处理的对照组产生了快速生长的肿瘤，而且用9.2.27处理的小鼠与用PBS处理的小鼠相比肺瘤体积没有减小。抗体225.28S是针对人M21黑色素瘤细胞系的，其最初被描述为与一种高分子量的黑色素瘤相关抗原反应。这种分子后来被证明就是MCSP。一项早先的研究测试了225.28S对于一种人黑色素瘤细胞系的细胞溶解能力，并将其与另外一种抗MCSP抗体克隆653.40S比较，225.28S是一种IgG2a,而653.40S是一种IgGi。225.28S和653.40S被确定为识别MCSP上相同的或空间上相接近的抗原决定簇。人们发现两种抗体在体外试验中都不能与补体结合裂解黑色素瘤细胞。两种抗体在抗体依赖性细胞介导性细胞毒性测试(ADCC)中都可以介导靶黑色素瘤细胞的裂解，其中225.28S显示出比653.40S更高的裂解活性。但是，只有使用比其他人已报道的高得多的效应物/靶细胞比例的裂解，其中，已报道的是使用抗黑色素瘤抗原的抗体。实验作者结论说，这些抗体的与人类补体结合裂解细胞的活性的缺乏，以及ADCC中发生细胞裂解所需要的较高的效应物/靶细胞比例，提示将单克隆抗体注射到黑色素瘤患者体内不可能造成肿瘤细胞的破坏。作者提出，这些抗体在免疫治疗中的用途应当只限于作为放射性同位素、化疗剂或毒剂的载体。在一项I期临床试验中考察了棵露抗体225.28S的治疗潜力，在该试验中，该抗体以10mg的剂量静脉投药于2名早期黑色素瘤患者。尽管没有提到可能因为该抗体的施用而导致的临床不良作用或严重的毒性作用，但也没有阳性的治疗反应。将抗体225.28S与蝶呤辟u素(purothionin)交联，然后测试该交联物对人黑色素瘤细胞系Colo38的体外毒性；蝶呤硫素是一种低分子量多肽，其对分裂中的细胞是特别有毒的。发现Colo38细胞与225.28S-蝶呤疏素交联物培养24小时的培养物抑制了3H-胸腺嘧啶核苷的摄取。此外，在与所述交联物共孵育7天的培养物中Colo38细胞的生存力(viability)显著下降。尽管观察到了体内毒性，仍然有一部分黑色素瘤细胞经受了225.28S-蝶呤硫素处理而生存下来。作者提出恶性疾病(malignantdiseases)的免疫治疗可能需要依赖多种单克隆抗体的鸡尾酒(cocktail),由这些针对独特的肺瘤相关抗原的多克隆抗体充当毒剂的载体，暗示单独的225.8S交联物不足以治疗癌症。评价了225.28S-蝶呤硫素交联物处理对于棵鼠中人黑色素瘤的生长的作用。在棵鼠中皮下或腹膜内植入Colo38细胞。对于腹膜内植入的小鼠在第1、3、5天进行处理，对皮下植入的小鼠在第1,3，5和20天进行处理，检测所有小鼠的存活情况。只有在用225.28S-蝶呤硫素交联物处理的腹膜内植入的小鼠中观察到统计学上显著的生存时间的延长。单独的225.28S，单独的蝶呤硫素，或者225.28S与蝶呤硫素的混合物都没有延长腹膜内植入或皮下植入的小鼠的生存。还记录了皮下植入小鼠的肿瘤体积，发现只有225.28S-蝶呤硫素交联物处理显著地缩小了肿瘤体积。单独-使用225.28S处理没有造成肿瘤体积的减小。此外还把225.28S与化疗剂曱氨蝶呤(methotrexate,MTX)交联，并在体内考察其对肿瘤生长的作用。棵鼠用Ml人黑色素瘤细胞皮下接种，并在第1，4,7，10和14天接受处理。只有MTX-225.28S交联物处理抑制了肿瘤生长。单独用225.28S、单独用MTX或用225.28S和MTX的混合物都没有抑制肿瘤生长。225.28S被用于一项考察施用具有异种性质的试剂导致的对人体的潜在毒性作用的研究。85位患有转移性表皮黑色素瘤的患者被施以用1231,1231，min，或"Tc标记的完整的225.28S或者F(ab，)2片段。注射的抗体的量为14到750/ig。没有患者观察到临床上可检测的副作用。没有临床反应被报道，尽管这不一定被预计到的结果，因为该项研究是被设计用于毒理学目的的。225.28S被用来产生鼠抗独特型单克隆抗体，包括抗体MF11-30，其带有MCSP的镜像(mirrorimage)。MF11-30已被证明在同种和异种系统中都可诱导抗MCSP抗体的发生。在两个临床试验中以逐渐升高的剂量测试MF1-30，这两个试验被设计来测试晚期恶性黑色素瘤患者中的毒性和反应。两个试验中都几乎没有由于该抗体的施用而导致的副作用，且治疗得到良好地耐受。在第二个试验中，7位患者产生了抗-抗-独特型抗体，其效价为至少1:8，并没有显示出明显的血清MCSP水平变化，这些患者的平均生存期为55周(范围为16-95周)，显著长于其他12位患者(这些患者产生了效价为l:4或更少的抗-抗-独特型抗体，并且显示出血清MCSP水平的升高)，他们的生存期为19周(范围为8-57)。还生成了抗体763.74，其抗黑色素瘤细胞并识别MCSP。还没有任何关于抗体763.74体外或体内抗癌作用的报道，但这种抗体也被用来生成鼠抗独特型单克隆抗体。这些抗体中的一种，MK2-23,带有抗MCSP抗体763.74所决定的抗原决定簇的内影像(internalimage)。在临床前实验中，证明在同种宿主(BALB/c小鼠)和异种宿主(家兔)中用MK2-23免疫都诱导了抗-MCSP抗体的产生。当MK2-23与载体蛋白钥孑L虫戚血蓝蛋白(keyholelimpethemocyanin,KLH)交联被与佐剂共同施用时，其免疫原性显著增强。进行了一项临床实验来对黑色素瘤患者中MK2-23诱导的体液应答进行定性。对25名第IV期的黑色素瘤患者在第0，7和28天通过皮下注射2mg的MK2-23/KLH交联物与卡介苗(BCG)的混合物进行免疫。如果抗-抗-独特型抗体的效价较低则给与额外的注射。用MK2-23免疫的患者中约有60产生了抗MCSP抗体，尽管这些抗MCSP抗体的水平和亲和性都较低。发现在MK2-23免疫后产生了抗-MCSP抗体的患者比没有产生该抗体的患者生存期要显著的长。产生了抗MCSP抗体的患者的生存期的中值为52周(范围为19-93)，而9名血清中没有可检测的抗-MCSP抗体的患者的生存期的中值是19周(范围是9到45)。3名产生了抗MCSP抗体的患者经历了疾病的部分緩解。尽管在这项研究中获得了有希望的结果，MK2-23免疫的患者中仍有40%没有产生可检测的抗MCSP抗体的反应。同样，3名实现了病情部分緩解的病人最终都复发了。一项尝试是试图通过用小剂量的环磷酰胺(cyclophosphamide,CTX)对患者进行预处理来提高MK2-23的免疫原性，环磷酰胺据报道可通过选择性地使某些抑制细胞群失活来提高针对肿瘤相关抗原的细胞和体液应答。但是，没有^r测到CTX预处理对MK2-23免疫原性的作用。单克隆抗体48.7是被开发为针对人转移性黑色素瘤细胞系M1733的，该抗体据报道可与一种分子反应，该分子后来^皮确定为MCSP。在一项I期临床试验中，48.7被与小鼠单克隆抗体96.5组合施用，抗体96.5是针对人黑色素瘤上存在的类转铁蛋白(transferrin-like)细胞表面糖蛋白p97的。5名患者在第1天分别接受单抗96.5和48.7各2mg,第2天分别接受10mg,第3天到第10天每天接受各25mg。处理被良好地耐受；但对处理没有临床反应而且在所有的患者中都发生了疾病进展。在另一个临床试验中也考察了这两种抗体，其中用这两种抗体中任一个的放射性标记的Fab片段处理3名黑色素瘤转移到中枢神经系统的患者。两名患者接受了5mg剂量的碘标记的48.7Fab片段，结合血脑屏障(BBB)的渗透压开放(osmoticopening)以促进该抗体进入脑中的胂瘤。渗透压血脑屏障调节增加了Fab向含瘤半球和脊髓液的运输，但没有显示该抗体清楚地、持续地定位于肿瘤。该作者假设说定位的缺乏可能是由于抗体剂量不足。Melimmune是两种鼠抗独特型抗体Melimmune-l(I-Mel-1)和Melimmune-2(I-Mel誦2)的二元制剂(dualpreparation)，这两种抗体冲莫拟MCSP的不同表位。I-Mel-1是抗独特型抗体MF11-30的一种亚克隆，MF11-30针对抗MCSP抗体225.28(如前所述)。I-Mel-1被证明在家兔中诱导抗MCSP反应。I-Mel-2是针对抗MCSP抗体MEM136的抗独特型抗体，MEM136与和225.28不同的MCSP表位反应。I-Mel-1也被证明在家兔中诱导抗MCSP反应。在一项I期临床试验中测试了含有1:1组成的I-Mel-1和I-Mel-2的Melimmune制剂，该试验在21名黑色素瘤切除并没有显示转移的患者中进行。报道了这些收治于同一机构的患者中12人的详细的免疫反应分析结果。在两个治疗方案中的一个中，患者接受了0.2-4.0mg剂量的Melimmune(I-Mel-1和I-Mel-2各0.1-2,0mg),所有的病人都产生了抗I-Mel-1和抗I-Mel-2抗体，其中12个患者中有IO人针对I-Mel-2的抗体峰值响应(peakantibodyresponse)大于针对I-Mel-1抗体峰值响应。^f旦是该项研究无法显示针对MCSP的特异性抗体的诱导，因为这些患者的血清都不能抑制放射性标记的225.28与表达MCSP的Mel-21细胞的结合，或者;改射性标记的MEM136与Mel-21细胞的结合。还使用了直4妄的细胞结合测试来测定病人血清中抗MCSP抗体的存在；但是在流式细胞术(FACS)分析中没有显示免疫前和免疫后的血清结合M21细胞的区别。在另一项临床试验中测试了I-Mel-2,其中26名转移性黑色素瘤患者接受2mgI-Mel-2和100或250/xgSAF-m佐剂的处理，通过肌肉注射投药，每两周一次投药4周，然后每两月一次直到病情发展。在26名患者中有5人通过抑制放射免疫测定(inhibitionradioimmunoassay)检测到了抗MCSP抗体。在具有可检测的抗MCSP抗体的5名患者中，有l人经历了完全的緩解，l人病情稳定，其他3人病情进展。病情完全緩解的患者具有最高的抗MCSP抗体效价(1:1500)。现有专利US5270202(及其相关专利W09216646A1,EP0576570A1)教导了一种抗独特型抗体IMelpg2(又称IM32)，其针对MEM136,—种针对人黑色素瘤相关蛋白聚糖(又称"HMW-MAA")的抗体。IMelpg2抗体^皮证明特异性地针对MEM136，并且有人提出其可用于"^断和治疗细胞表达MPG表位的疾病。尽管体外测试确定IMelpg2对肿瘤细胞侵入有作用，但是其在被测试的抗体中并不是最有效的，也没有迹象显示其有体内抗肿瘤作用，虽然其显示Ab3反应。EP0380607B1教导了针对单抗225.28的抗独特型抗体，225.28对于一个未确定的HMW-MAA表位有特异性。这些抗体都可用于黑色素瘤的积极免疫治疗(activeimmunotherapy)。MF11-30和IMelpgl,以及针对225.28的多克隆抗独特型抗体已经被报道并且在动物试-验中评估，MF1l-30正在黑色素瘤患者中接受临床试验，虽然还没有支持性的数据。MF11-30可诱导225.28独特型抗体。通过用BMCycline处理MF11-30细胞系并检测无支原体污染而获得了IMelpgl细胞系。尽管抗IMelpgl可以在家兔血清中被诱导，并且证明可结合Colo38黑色素瘤细胞，但是其没有显示杀胂瘤(tumorcidal)活性，不管是在体内还是体外。US4879225教导了由不溶性免疫复合物制备抗体。这里，通过将9.2.27固定在蛋白A-Sepharose上用作抗原，生成了HMW-MAA特异性单抗9.2.27的大鼠抗独特型抗体。使用与Sepharose交联的多种细胞或细胞裂解物复合物制备了抗黑色素瘤抗体。将结合黑色素瘤细胞但不结合正常T细胞或B细胞的鼠单抗与9.2.27比较。下面这些与9.2.27具有相似性质的鼠单抗被选择用于进一步定性分析NR-ML-02，NR-ML-03,NR-ML-04，NR-ML-05，NR-ML-06。上述抗体中的每一个在使用9.2.27作为捕捉抗体和溶解的SKMEL-28黑色素瘤细胞膜作为抗原来源的夹心ELISA分析中都为阳性。进一步地，这些抗体被确定为识别黑色素瘤细胞，而且也与平滑肌和内皮细胞反应。还制备了61种抗蛋白聚斗唐抗体，其中10种与NR-ML-02/NR-ML-04识别相同的决定簇，3种与NR-ML-03或NR-ML-05识别相同的决定簇，45种并不识别与上述5种抗体相同的表位。在US5084396中，这些抗体祐j文射性标记，并在荷载黑色素瘤异种移植物的棵鼠中比较它们与9.2.27的肿瘤摄取。NR-ML-05和NR-ML-02的肿瘤摄取最高，其次是9.2.27,然后是NR-ML-02。上述两个发明中都没有证据显示这些细胞导致癌性疾病中肿瘤负荷(tumorburden)的降^氐或患有癌性疾病的哺乳动物生存率的提高。US5034223教导了一种通过用非交联的阻断抗体(blockingantibody)预处理来促进交联抗体向带有肿瘤相关抗原的组织的运输的方法。将针对HMW-MAA,9.2.27和NR-ML-05的抗体与technicium-99(Tc-99)交联，并且在临床条件下施用，在施用前先施用了未标记的单抗NR-2AD，其具有只特异性针对1个患者的B细胞淋巴瘤的抗独特型。由于这些研究被设计为使用无细胞毒性或放射腐蚀性(radioablative)作用的Tc-99作为报道放射性同位素，没有出现抗肿瘤作用的证据，尽管通过应用该方法促进了抗HMW-MAA抗体的掘^取。US5580774教导了使用编码单抗9.2.27的抗体基因构建嵌合抗体。其没有关于公开癌性疾病的诊断或治疗的内容。US5493009和US5780029教导了针对抗HMW-MAA抗体763.74的鼠抗独特型抗体MK2-23和其交4关物。MK2-23可直接结合763.74并抑制763.74结合Colo38黑色素瘤细胞。另外，MK2-23诱出的Ab3可直接结合HMW-MAA并可竟争性抑制763.74结合Colo38黑色素瘤细胞。在一项临床试验中，在第IV期黑色素瘤患者中用MK2-23进行了积极免疫治疗。患者免疫后血清有89%与Colo38黑色素瘤细月包反应，并抑制763.74结合Cok)38黑色素瘤细胞，提示Ab3抗体的诱导。在15名患者的6人中报道了转移病灶大小的减少，但未提供研究的详情。部分地鉴定了患者血清中抗体的特异性；而且，还不清楚Ab3抗体是否只要其存在就对任何观察到的临床反应负责，因为763.74抗体没有天生的抗肿瘤作用。US5866124教导了嵌合抗独特型抗体MK2-CH7I和其衍生物，其针对抗HMW-MAA抗体763.74，并衍生自MK2-23。多项发明,例如US5017693,US5707603,US5817774,US6248870,US5112954，US6238667,教导了将化合物交联到针对HMW-MAA的抗体，但没有公开这些抗体在治疗癌性疾病中的用处。重要的是，如果这些抗体单独用作抗癌治疗是有效的，它们就不会需要交联物来赋予细胞毒性或细胞生长抑制作用了。这些专利和专利申请鉴定了MCSP抗原和相关抗体，但没有公开本发明的分离的单克隆抗体，或本发明的分离的单克隆抗体的用处。
发明内容本发明人先前已被授予美国专利6,180,357，名为"个人化的患者特异性抗癌抗体"(IndividualizedPatientSpecificAnti-CancerAntibodies),该专利涉及选择个人定制的抗癌抗体的方法，这些抗体可用于治疗癌性疾病。对于本文而言，术语"抗体"和"单克隆抗体"(mAb)可以互换使用，指杂交瘤(例如鼠或人的)产生的完整免疫球蛋白，免疫连接物，以及，如适合的，免疫球蛋白片段和所述免疫球蛋白来源的重组蛋白，例如嵌合和人源化的免疫球蛋白、F(ab')和F(ab')2片段、单链抗体、重组免疫球蛋白可变区(Fv)、融合蛋白等。本领域中普遍承认，多肽中的某些氨基酸序列可以发生变化而不显著地影响蛋白质的结构或功能。在抗体的分子重排中，骨架区(backboneregion)的核酸或氨基酸序列的改变一般是可以被容忍的。这样的改变包括但不限于，置换(优选保守性的置换)，缺失或添加。另外，将标准的化疗药征(chemotherapeuticmodalities)，例如it射性核素，与本发明的CDMAB交联，以集中该化疗剂的使用，也落入本发明的范围内。所述CDMAB也可以与毒素，细胞毒性部分，酶例如生物素交联的酶，或血源性细胞交联，以产生抗体交联物(antibodyconjugates)。本申请使用如'357专利所教导的生产患者特异性抗癌抗体的方法来分离编码癌性疾病调节性多克隆抗体的杂交瘤细胞系。可以使这些抗体特异性地针对一种肿瘤而使得癌症治疗的定制化称为可能。在本申请的范围中，具有杀细胞(细胞毒性)或抑制细胞生长(细胞增殖抑制)功能的抗癌抗体，以下都称为细胞毒性的。这些抗体可用于帮助癌症的分期和诊断，并可用于治疗肿瘤转移。个人化的抗癌治疗的前景将带来患者治疗方式的改变。临床上可能将是这样的情况在肿瘤发现时获得肿瘤样本并保存。根据此样本，该肿瘤可以由一组先有的癌性疾病调节抗体来分类。患者可能按常规分期，但可得的抗体可能可以用于对患者进一步分期。患者可以立即用已有的抗体来处理，并且/或者，可以使用本文所列出的方法或使用噬菌体展示库结合本发明公开的筛选方法来生产一组针对该肿瘤特异性的抗体。所有产生的抗体都将被添加到抗癌抗体库中，因为其他的肿瘤可能带有和正在被处理的肿瘤相同的表位。根据此方法生产的抗体可以用于治疗任何患有能结合这些抗体的癌的患者中的癌性疾病。基本上使用US6,180,357的方法，并如S.N.10/348,231所公开的，用来自患者的乳腺癌活检物的细胞免疫小鼠后，获得了小鼠单克隆抗体11BD-2Ell-2。11BD-2E11-2抗原在不同组织来源的数种人细胞系的细胞表面都有表达。乳腺癌细胞系MCF-7和卵巢癌细胞系OVCAR-3对11BD-2E11-2的体外细胞毒作用敏感。当移植到小鼠中时，11BD-2E11-2针对MCF-7和OVCAR-3细胞的细胞毒作用被其针对这些癌细胞的抗肿瘤活性进一步扩大。临床前异种移植肿瘤模型被认为是处理有效性的可靠预测手段。在一个人类乳腺癌的预防性体内模型中，11BD-2E11-2阻止了肿瘤生长并减轻了肿瘤负荷(如S.N.10/762,129公开的)。在第51天(最后一次治疗后不久)，在11BD-2Ell-2处理组中平均肿瘤大小是同型对照组的20%。监测持续到处理后280天以后。植入后7.5个月，11BD-2E11-2处理组仍有40%存活。相对地，同型对照组在处理后6.5个月后死亡率为100%。因此，在确立的人乳腺癌模型中，相对于对照处理组，11BD-2Ell-2提高了生存率并减轻了肿瘤负荷。为了确定11BD-2Ell-2是否在更多的人乳腺癌模型中有效，在一个确立的乳腺癌4莫型中测定了其针对MDA-MB-468(MB-468)细胞的抗肺瘤活性。与緩冲液对照相比，11BD-2E11-2降低了25%的肿瘤生长。因此，11BD-2E11-2在确立的和预防性的乳腺癌异种抑制物模型中有效地抑制肿瘤生长。另外，11BD-2E11-2在至少两种不同的乳腺癌模型中显示了抗肿瘤活性。除了在人乳腺癌模型中的有益作用外，11BD-2E11-2处理还在预防性的卵巢癌模型中(如S.N.10/762,129中所公开)具有抗胂瘤活性。在上述模型中，体重被用作肿瘤进展的替代量度。植入后80天(处理结束后16天)，处理组中的小鼠的平均体重为对照组的87.6%(p=0.015)。因此，11BD-2Ell-2处理是有效的，因为其在确立的人卵巢癌模型中相比于緩冲液对照组延迟了肿瘤的进展。11BD-2E11-2在数种不同的癌症模型中显示的抗肿瘤活性使之成为一种有吸引力的治疗剂。为了确定11BD-2Ell-2是否在更多的人卵巢癌模型中有效，在一种确立的卵巢癌模型中测定了其针对ES-2+SEAP细胞(用人胎盘分泌性碱性磷酸酶(SEAP)转染的ES-2卯巢癌细胞)的抗肺瘤活性。与緩冲液对照相比，11BD-2E11-2提高了处理组中一组小鼠的存活率。11BD-2E11-2处理组中的一只小鼠在处理后显示出循环SEAP水平的下降。循环SEAP水平可用作肿瘤负荷的指标。因此，11BD-2E11-2在确立的和预防性的卵巢癌异种抑制物模型中有效地抑制了肿瘤生长。另外，11BD-2E11-2在至少两种不同的卯巢癌模型中显示了抗肿瘤活性。为了验证11BD-2E11-2表位为药物靶标，测定了冷冻的正常人组织中11BD-2E11-2抗原的表达。根据用11BD-2Ell-2免疫组化染色的结果，大多数的祖师没有表达11BD-2Ell-2抗原，包括肝、肾和心脏等重要器官的细胞。但是在几乎所有的组织中血管平滑肌纤维都有染色。一些组织的上皮也有染色。11BD-2E11-2的定位和它在乳腺癌患者中的普遍性对评估11BD-2E11-2免疫治疗对患者的效益和-没计有效的临床试-睑是重要的。为了研究11BD-2E11-2抗原在来自癌症患者的乳腺肿瘤中的表达，在来自8名乳腺癌患者的肺瘤组织样本(还有7个样本在微阵列玻片上脱离或不能代表该肿瘤)中筛选11BD-2Ell-2抗原的表达。该研究的结果显示这些组织样本中的62%的11BD-2Ell-2抗原染色呈阳性。患者的样本中的UBD-2Ell-2表达似乎是对癌细胞特异性的，因为染色仅限于恶性细胞。另外，在3个来自乳腺癌患者的正常组织的样本(还有两个样品也彻底从微阵列玻片上脱离)中0个具有11BD-2E11-2染色。当根据肿瘤的分期，或癌症进展的程度来分析肿瘤时，结果并没有显示出肿瘤分期越晚11BD-2E11-2阳性表达越高的倾向。但是，结果被较小的样本量所限制。如本文所述的，其他生化数据也暗示被11BD-2Ell-2识别的抗原是MCSP。这被下面的研究结果所支持被11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白为针对MCSP的大鼠同源物的抗体所识别；被抗MCSP抗体免疫沉淀的蛋白则为11BD-2Ell-2所识别。免疫组化和生化试验结果显示，11BD-2Ell-2与MCSP抗原结合。因此，优势的证据证明11BD-2E11-2通过与MCSP上独特的表位连接而介导抗癌作用。总结起来，这些数据显示11BD-2Ell-2是一种癌相关抗原并在人类中表达，而且是一种病理学上重要的癌靶标。进一步地，该数据还显示11BD-2Ell-2抗体结合人癌组织，并可以合适地用于诊断性、治疗预测性和预后性等分析。另外，由于该抗原在大部分非恶性细胞中不表达，该抗原的细胞定位指示癌的状态；这一观察结果使得该抗原、该抗原的基因或衍生物，及该抗原的蛋白或变体可以用于诊断性、治疗预测性和预后性等分析。已经开发了多种独特的抗MCSP抗体并在许多体外和体内系统中对它们作了测试。在临床前模型中，除了一项未能重复的研究之外，棵露的抗MCSP抗体已经被证明在数个不同的黑色素瘤模型和一个胶质瘤模型中对减轻肿瘤和提高生存率没有效果；还没有用抗MCSP抗体研究其他癌类型。所有棵露的抗MCSP抗体的人体试验都没有产生任何积极的临床效果。棵露的11BD-2E11-2已被证明能在人乳腺癌的小鼠模型中提高生存率和减少肿瘤负荷。11BD-2E11-2还被证明在人卵巢癌的小鼠模型中抑制肿瘤发展和提高存活率。抗MCSP抗体已被与多种毒剂或化疗剂交联，这些交联物在小鼠黑色素瘤模型中已经显示出积极的体内效果。还没有在人中测试抗-MCSP交联物的报道，所以这些交联物的安全性还是未知。但是单克隆抗体单独给药被很好地耐受，几乎没有伴随相关的毒性。因此，如果使用单独的棵露抗MCSP抗体治疗癌症患者能够获得积极的临床结果，这将是有益的，而且较之现有的治疗方法将是一个进步。与毒剂交联并不是11BD-2Ell-2显示抗癌活性所必需的；因此不存在施用抗体-毒剂交联物所带来的特定的安全担忧。许多抗-MCSP抗体还被用来产生抗独特型抗体，这些抗体在动物和人中都已被测试。在小型非盲试验中，当用抗独特型抗体免疫患者导致可检测的抗-MCSP免疫反应时，这些患者与没有产生特异性免疫反应的患者相比生存中值增加了。在给出的例子中，可以通过施用抗独特型抗体实现靶向MCSP以获得积极的临床反应。这种方法的问题之一是，不是所有被用抗独特型抗体免疫的患者都产生抗-MCSP反应。因此，如果能有一经直接施用即可产生积极的临床效果的抗MCSP抗体，就能够克服依赖患者自身的免疫反应来产生临床上的效益的问题。11BD-2E11-2就是一种这样的抗体，因为其直接靶向MCSP,并且在临床前异种移植肿瘤模型中显示抗癌作用，临床前异种移植肿瘤模型被认为是治疗有效性的可靠预测手段。总之，本发明教导作为治疗剂的靶标的11BD-2Ell-2抗原，当其被施用时可减轻哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷(乂人而延迟其病情进展)，并延长被处理的哺乳动物的生存。该发明还教导一种CDMAB(1BD-2E11-2)及其衍生物的用途该利用CDMAB靶定其抗原，以减轻哺乳动物中表达该抗原的癌的肿瘤负荷，并延长荷载表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的生存。另外，该发明还教导检测癌性细胞中11BD-2Ell-2抗原的用途，其可用于荷载表达该抗原的肿瘤的哺乳动物的诊断、治疗预测和预后。如果初次疗程对病人无效，或发生转移，那么可以重复产生针对该肿瘤的特异性抗体的过程作为重复治疗。另外，可以将抗癌抗体与得自该患者的红细胞交联并再注入来治疗转移。目前几乎没有对转移的有效治疗方法，转移通常预示着导致死亡的不好的结果。但是转移癌通常高度血管化，通过红细胞运输抗癌抗体具有将抗体集中在肿瘤处的作用。即使在转移前，大部分癌细胞都依赖于宿主的血液供应来生存，而且与红细胞交联的抗体也可有效地对抗原位肺瘤。或者，所述抗体也可交联其他的血源性细胞，例如淋巴细胞、巨噬细胞、天然杀伤细胞等等。抗体分为五类，每一类都具有由其重链赋予的功能。一般认为棵露抗体对癌细胞的杀伤是通过抗体依赖性细胞介导性细胞毒作用(ADCC)或补体依赖型细胞毒作用(CDC)。例如鼠IgM和IgG2a抗体可以通过与补体系统的C-I组分结合活化人补体，从而激活经典的补体激活途径，可以导致肿瘤裂解。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体是IgM和IgGl。鼠IgG2a和IgG3同型抗体可有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，这导致细胞被单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和特定的淋巴细胞所杀死。IgGl和IgG3同型的人类抗体都介导ADCC。另一种可能的抗体介导细胞杀伤可能是通过使用催化细胞膜或者其相关糖蛋白或糖脂中多种化学键水解的抗体，即所谓催化性抗体(catalyticantibodies)。还有两种被更广泛承认的抗体介导癌细胞杀伤途径。第一种是使用抗体作为疫苗诱导机体产生针对位于癌细胞上的假设的抗原的免疫应答。第二种是使用抗体来耙定生长受体(growreceptors)并干扰其功能或下调该受体，以有效地使其功能丧失。癌症药物的临床有用性是基于该药物在可接受的风险模式下对患者的效益。在癌症治疗中生存率一般是人们最追求的效益，但是除了生命的延长以外，还有多种其他的被普遍承认的效益。所述其他的效益，在治疗对生存不造成不良影响的情况下，包括症状的减轻、针对不良事件的保护，推迟复发或延长无瘤生存期(disease-freesurvival),及推迟病情进展。这些标准被普遍接受，而且管理机构例如美国食品药品管理局(F.D.A.)已批准了产生此类效益的药物(Hirschfeldetal.CriticalReviewsinOncology/Hematolgy42:137-1432002)。除了这些标准以外，公认还有其他终点指标(endpoints)可能预示此类效益。美国FDA所给予的加快的批准程序部分地承认了可能存在预测患者的效益的替代终点指标。在年底(2003),在这个程序下已经有16种药物被批准，且其中4种已经得到完全批准，也就是说，后续的研究已经显示了如替代终点指标所预测的直接患者效益。在实体瘤中，判定药物效果的一个重要的终点指标是通过测量对治疗的反应来评价肿瘤负荷(Therasseetal.JournaloftheNationalCancerInstitute92(3):205-2162000)。这种评价的临床标准(RECIST标准)已经由ResponseEvaluationCriteriainSolidTumorsWorkingGroup,—个国际癌症专家组发布。如果药物4艮据RECIST标准的目标反应所显示，相对于合适的对照组显示对肿瘤负荷有作用，则其倾向于最终产生直接的患者效益。在前临床条件下肿瘤负荷一般更易于直接评估和证实。由于前临床研究可以转换为临床条件，在前临床模型中能够延长生存的药物，其临床有用性是最为人期待的。与产生对临床治疗的积极反应相似，在前临床条件下减轻肿瘤负荷的药物也可以对该致病具有显著的直接影响。虽然生存的延长是肿瘤药物治疗中人们最追求的临床结果，还有其他具有临床有用性的效益，而且人们清楚，胂瘤负荷的减轻可能关联肿瘤进展的延迟，生存的延长或二者，肿瘤负荷的减轻也可以带来直接的效益并具有临床影响(Eckhardtetal.DevelopmentalTherapeutics:SuccessesandFailuresofClinicalTrialDesignsofTargetedCompounds;ASCOEducationalBook,39thAnnualMeeting,2003,209-219页)。因此，本发明的目标之一是利用从来自特定个体的细胞生产癌性疾病调节抗体的方法，这些抗体对癌细胞是细胞毒性的，而对非癌细胞是相对无毒的，利用上述方法来分离杂交瘤细胞系和杂交瘤细胞系所编码的相应分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。本发明的另一个目的是教导CDMAB及其抗原结合片段。本发明还有一个目的是生产其细胞毒性通过ADCC介导的CDMAB，。本发明还有一个目的是生产其细胞毒性通过CDC介导的CDMAB。本发明的一个进一步的目的是提供这样的CDMAB,其细胞毒性是其催化水解细胞化学键的能力的功效。本发明的另一个目的是提供可用于癌症的诊断、预后和监控的结合测定的CDMAB。本发明的其他目的和优点可由下面的描述而清楚，其中，作为"i兌明和举例，提供了本发明的特定的实施方式。本专利或申请文件包含至少一幅彩图。本发明或发明申请公开的具有彩图的拷贝将由专利局根据要求并提供并收取必要的费用。图1:MDA-MB-231(泳道1)或OVCAR-3(泳道2)膜的Western印迹，该膜用11BD-2Ell-2探测。膜蛋白是在还原条件下分离的。分子量标记标示在右边。图2:去糖基化对于11BD-2E11-2结合MDA-MB-231膜的影响。11BD-2E11-2与在单独的去糖基化^_冲液中(泳道1),与PNG酶F，内切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(glucosaminidase)的组合中(泳道2),与PNG酶，内切-o-糖苷酶和唾液酸酶的组合中(泳道3),单独的唾液酸酶中(泳道4)，单独的内切-o-糖苷酶中(泳道5),和单独的PNG酶中(泳道6)孵育的所述MDA-MB-231膜结合。图3:用11BD-2E11-2免疫沉淀的MDA-MB-231膜蛋白的SDS-PAGE(图面A)和Western印迹(图面B)。泳道1表示分子量标准，泳道2为MDA-MB-231膜蛋白，泳道3为11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道4为同型对照的免疫沉淀物。图4:用下列物质11BD-2E11-2(图面A),IgGl同型对照(克隆107.3,图面B)，抗-大鼠NG2(多克隆，图面C)，正常家兔IgG(图面D),抗-MCSP(克隆9.2.27,图面E)和IgG2a同型对照(克隆G155-228,图面F)探测的蛋白的Western印迹。泳道1:11BD-2E11-2免疫沉淀物，泳道2:IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物，泳道3:抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物，泳道4:IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫沉淀物，泳道5:MDA-MB-231膜，和泳道6:单纯的样品緩冲液(阴性对照)。图5:11BD-2E11-2,同型对照或针对数种癌细胞系和非癌细胞系的抗-EGFR的代表性流式细胞直方图。图6:代表性的显微照片，显示11BD-2E11-2(A)和同型对照抗体(B)对来自冷冻的人组织阵列的心脏组织切片的结合模式。11BD-2Ell-2对心肌纤维没有染色。放大倍数为200X。图7:代表性的显微照片，显示11BD-2E11-2(A)、抗-肌动蛋白(B)和同型对照抗体(C)对来自冷冻的人组织阵列的骨骼肌组织切片的结合模式。11BD-2Ell-2对骨骼肌无染色，但对血管平滑肌有染色(箭头所示)。；改大倍数为200X。图8:11BD-2E11-2(A)和同型对照抗体(B)结合乳腺癌肿瘤(浸润性导管癌)的代表性显微照片。图面A的黑色箭头指向肿瘤细胞。》文大倍数为200X。图9:在预防性MDA-MB-468乳腺癌模型中11BD-2E11-2或緩冲液对照对肿瘤生长的影响。虚线表示抗体被施用的时间段。数据点表示平均值+/-测量标准误差。图10:在确立的ES-2异种移植研究中用11BD-2E11-2或緩冲液对照抗体处理后荷瘤小鼠的生存情况。图11:在确立的ES-2异种移才直研究中用11BD-2E11-2或緩冲液对照抗体处理前、处理中和处理后荷瘤小鼠的SEAP水平。具体实施方式实施例1用Western印迹法鉴定结合蛋白为了鉴定抗体11BD-2E11-2所结合的抗原，对表达该抗原的细胞膜进行凝胶电泳，并通过Western印迹转移到膜上，以确定由该抗体检测到的蛋白。1:膜的制备先前的工作显示了11BD-2Ell-2通过流式细胞术结合乳腺癌细胞系MDA-MB-231(MB-231)。先前的工作还显示11BD-2E11-2针对卵巢癌细胞系OVCAR-3的有效性。因此，使用这两种细胞系的膜制备物进行抗原鉴定。从MB-231乳腺癌或OVCAR-3卵巢细胞的铺满培养物制备全细胞膜。从积聚的细胞(cellstack)中去掉培养基，用磷酸盐緩沖盐水洗涤细胞。用解离緩冲液(Gibco-BRL,GrandIsland,NY)在37。C平台式摇床上解离细胞20分钟。收集细胞并在40。C下900g离心10分钟。离心后，将沉淀的细胞重悬于PBS中并再次在4"C下900g离心10分钟以洗涤细胞。将沉淀保存在-80°C。将细胞沉淀以每克细胞3mL緩冲液的比例重悬于匀浆緩冲液中，所述匀浆緩沖液每50mL含有1片完全蛋白酶抑制物合剂(Completeproteaseinhibitococktail)(Roche,LavalQC)。用polytron匀浆器在冰上对细胞悬液进行匀浆以裂解细胞。细胞匀浆在4。C下15,000g离心IO分钟以去除核颗粒。收集上清，分装到小管中，并在4。C下75，600g离心90分钟。小心地从小管中移出上清，并将每份膜沉淀重悬在大约5mL的匀浆緩冲液中。将所有小管中的重悬的膜沉淀合并到一个小管中，并在4。C下75,600g离心90分钟。小心地去除管中的上清，将沉淀称重。以每克膜沉淀3mL緩沖液的比例向沉淀中加入含有1%TritonX-100的溶解緩冲液。用平台式摇床在冰上300rpm振荡1小时以溶解膜。将膜溶液在75,600g离心以沉淀不溶物。从管中小心地移出含有溶解的膜蛋白的上清，测量蛋白含量，并在-80'C保存。2:SDS-PAGE和Western印迹用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离膜蛋白。将20pg的膜蛋白与含有100mMDTT的SDA-PAGE样品緩沖液混合，并加载到8%的SDS-PAGE凝胶的泳道中。在参考泳道中运行预染色的分子量标记样品(Invitrogen,Burlington,ON)。电泳先在100V下进行10分钟，然后在150V下运行直到观察到预染分子量标记的足够的分辨。通过40V下电印迹16小时将蛋白质从凝胶上转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore，Billerica,MA)上。通过注意观察预染分子量标记乂人凝胶转移到膜上来评估转移情况。转移后，用含有5%脱脂奶粉和0.5%Tween-20的三羟曱基氨基曱烷(Tris)緩沖盐水(TBST)封闭膜2小时。用TBST将膜洗涤一次，然后与5/xg/mL的稀释于含有3%脱脂奶粉的TBST中的11BD-2E11-2共孵育2小时。TBST洗涤3次后，将膜与交联辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgG(Fc)共孵育，该酶来自JacksonImmunologicals(WestGrovePA)。孵育后用TBST洗涤3次，然后与HRP底物3，3'，5,5'-四曱基联苯胺(TMB)(来自VectorLaboratories,BurlingtonON的底物试剂盒)共孵育。如图1，11BD-2E11-2清楚地结合分离的MB-231(泳道1)和OVCAR-3(泳道2)的3个分子量区域。通过与分子量(MW)标准比较，该抗体结合分子量大约为150，240和280kDa的蛋白质。所有进一步的研究都使用MB-231的膜来进行，因为这种细胞系中已经观察到了更强的反应性。实施例2测定11BD-2E11-2结合的抗原的糖基化为了确定11BD-2E11-2抗体所识别的抗原是否为糖蛋白，将MB-231膜蛋白与不同组合的PNG酶F，内切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡萄糖苷酶共孵育。用SDS-PAGE分离膜然后作Western印迹，如用11BD-2E11-2所做的一样。图2显示11BD-2E11-2结合MDA-MB-231膜的结果，所述MDA-MB-231膜在单独的去糖基化H冲液中(泳道l)，与PNG酶F,内切-o-糖苷酶，唾液酸酶，半乳糖苷酶和氨基葡糖苷酶(glucosaminidase)的组合中(泳道2)，与PNG酶，内切-o-糖苷酶和唾液酸酶的组合中(泳道3)，单独的唾液酸酶中(泳道4),单独的内切-o-糖芬酶中(泳道5)，和单独的PNG酶中(泳道6)孵育。用糖苷酶处理MB-231膜并没有消除11BD-2E11-2的结合，但是所有的的泳道中都发现了蛋白质分子量的偏移，暗示11BD-2Ell-2所识别的抗原是糖蛋白。实施例311BD-2E11-2结合抗原的鉴定1.免疫沉淀通过用11BD-2Ell-2抗体免疫沉淀溶解的膜糖蛋白来分离同源配体(cognateligand),以鉴定11BD-2E11-2对应的抗原。将100/xL的ProteinGDynabeads(DynalBiotech,LakeSuccessNY)用1mL的0.1M磷酸钠緩沖液,pH6.0洗涤3次。将溶于总体积100jiiL的pH6.00.1M磷酸钠緩沖液中的100/ig11BD-2Ell-2加入到洗涤后的微珠中。将混合物在旋转混合下孵育1小时。去掉未结合的抗体，并将11BD-2E11-2包被的抗体用含0.1%Tween-20的pH7.4的磷酸钠溶液0.5mL洗涤三次。将11BD-2E11-2包被的抗体用0.2MpH8.2的三乙醇胺1mL洗涤2次。加入1mL含0.02M二曱基庚二亚胺酸(dimethylpimelimidate)的0.2M三乙醇胺(pH8.2)并在旋转混合下孵育30分钟使11BD-2Ell-2化学交联到微珠上。将微珠在旋转混合下与1mL的0.05MTris(pH7.5)孵育15分钟以终止反应。11BD-2E11-2交联的孩吏珠用1mL含0.1%Tween-20的1mMKH2P04,10mMNa2HP04，137mMNaCl和2.7mMKC1(PBS)洗涤3次。将11BD-2E11-2交联的樣O朱与0.1M柠檬酸(pH3.0)孵育3分钟，然后用含0.1%的Tween-20的0.1MPBS洗涤3遍，进行预洗脱(pre-elute)。用所述相同的方式制备第二套抗体交联的微珠，其使用抗无关分子三硝基苯酚的小鼠IgGi抗体(克隆107.3，来自BDBiosciences,OakvilleON),作为阴性IgGi同型对照。11BD-2E11-2交联的微珠在4。C旋转混合下与含1%BSA的O.IM磷酸钠(pH7.4)温育30分钟来封闭。用0.1M磷酸钠(pH7.4)将微珠洗涤3次。将500的MB-231细胞全膜制备物与11BD-2E11-2交联的微珠在4。C旋转混合下共孵育2.5小时。将结合了免疫复合物的微珠用含1%TritonX-100的1mMKH2P04,10mMNa2HP04,287mMNaCl:2.7mMKC1洗涤3次。将11BD-2E11-2交联的微珠与0.1M柠檬酸(pH3.0)在轻柔混合下孵育3分钟以将11BD-2E11-2结合蛋白从微珠上洗脱下来。加入9/iL1MTris(pH9)将洗脱的蛋白调为中性pH。将中和的洗脱蛋白保存于-80。C。11BD-2E11-2交联的微珠用3mL含0.1%Tween-20的PBS洗涤。将IgGi同型对照(克隆107.3)交联的微珠与MB-231膜蛋白孵育并按照与11BD-2Ell-2微珠同样的方式处理。如上所述产生了两批MB-231膜蛋白的11BD-2E11-2免疫沉淀蛋白并将其合并。对IgQi同型(克隆107.3)对照微珠也同样操作。将该免疫沉淀混合物的62%(对应于从620/xgMB-231膜蛋白中免疫沉淀下来的蛋白质的量)加载到4-20%梯度SDS-PAGE凝胶的单个泳道中。在相邻的泳道中加载相同量的107.3交联微珠产生的物质以及20/xgMB-231膜蛋白。在参考泳道中运行未染色的分子量标记(Invitrogen:BurlingtonON)或预染色的分子量标记样品。样品通过在IOOV下电泳10分钟，然后在150V下电泳60分钟来分离。将凝月交在SYPRORubyTM(BioRad,Mississauga，ON)中孵育来将蛋白染色。在平行的Western印迹中，将该免疫沉淀混合物的18%，对应于从180/igMB-231膜蛋白中免疫沉淀下来的蛋白质的量，以及同样量的IgGi同型对照(克隆107.3)交联微珠所生成物质，用电泳分离。通过40V下电印迹16小时将蛋白从凝胶转移到PVDF膜(Millipore，Billerica,MA)。转移后，膜在含5%脱脂奶粉的TBST中孵育2小时来封闭。用5jug/mL的稀释于含5。/。脱脂奶粉的TBST中的11BD-2Ell-2探测该膜2小时。用TBST洗涤3次后，将膜与HRP交联的山羊抗小鼠IgG(Fc)共孵育1小时。孵育后用TBST洗涤3次，然后用HRP底物TMB共孵育。图3显示11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白得到的凝胶和Western印迹图。在凝胶上(图面A)，泳道1代表分子量标准，泳道2表示MB-231膜蛋白。在含有11BD-2E11-2免疫沉淀物的泳道(泳道3)中有独特的两条MW分别为240和280kDa的条带，其不存在于含有107.3免疫沉淀物的泳道(泳道4)中。在相应的Western印迹中(图面B),11BD-2E11-2与11BD-2Ell-2免疫沉淀的MW240和280kDa的蛋白强烈地反应(泳道3)。在Western印迹中11BD-2E11-2还和11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白中150kDa处的另一个条带强烈反应；这条条带在染色的凝胶上检测不到。11BD-2Ell-2对11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白的反应性特征与MB-231全膜中》见察到的类似(泳道2)。11BD-2Ell-2对IgGi同型对照(克隆107.3，泳道4)免疫沉淀的蛋白质没有反应性，暗示11BD-2Ell-2针对免疫沉淀的蛋白的结合是特异性的，且并非由杂蛋白的存在而引起。2.质谱用无菌的解剖刀将对应于240和280kDa蛋白的凝胶区域切下。31使用该凝胶片进行MALDI/MS和LC/MS/MS质谱来鉴定蛋白。将样品在ProGest工作站上用胰蛋白酶进行蛋白酶解，将所得的一部分消化上清用于MALDI/MS分析。点样用ZipTip自动进行(ProMS);从C18材料上洗脱肽，其中该基质(a-氰基4-羟基肉桂酸)在60%乙腈，0,2%TFA中制备。在VoyagerDE-STR仪(AppliedBiosystems,FosterCityCA)获取MALDI/MS数据，观察到的m/z值提交到ProFound(Proteometricssoftwarepackage)进行肽质量指故检索。ProFound查询存于本地的NCBInr数据库拷贝。另一部分消化上清用纳米LC/MS/MS分析，其在MicromassQ-Tof2进行，使用75/miCI8柱，流速为200nL/min。使用MASCOT的本地拷贝搜索MS/MS数据。MALDI/MS和LC/MS/MS鉴定的蛋白质如表1所示。表1:通过11BD-2Ell-2免疫沉淀MDA-MB-231膜鉴定的蛋白质<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>(MCSP)。3.验证通过测定已知的抗-MCSP抗体能否与11BD-2Ell-2免疫沉淀的蛋白反应，及反之，来验证该假定的抗原。免疫沉淀物按照上述的方式制备，但添加了小鼠抗-MCSP单克隆抗体9.2.27(IgG2a)(Chemicon，TemeculaCA)和抗无关分子三硝基苯酚的小鼠IgG2a抗体(克隆G155-178,来自BDBiosciences;OakvilleON)，后者作为IgGl同型阴性对照。在六份重复的10%凝月交上分离11BD-2E11-2免疫沉淀物、IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物、抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物、IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫^:淀物和MB-231膜。电泳和Western印迹如上所述进行。膜与稀释在含有3%脱脂奶粉的TBST中的5jiig/mL的11BD-2Ell-2、IgGl同型对照(克隆107.3)、抗-MCSP(克隆9.2.27)、IgG2a同型对照(克隆G155-228)、家兔多克隆抗-大鼠NG2抗体(MCSP是大鼠NG2的人源类似物；Chemicon，TemeculaCA)及正常家兔IgG(Sigma,SaintLouisMO)共孵育2.5小时。图4显示上述Western印迹的结果。图4(图面A)显示11BD-2E11-2结合11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道1)、IgGl同型对照(克隆107.3)免疫沉淀物(泳道2)、抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物(泳道3)、IgG2a同型对照(克隆G155-228)免疫沉淀物(泳道4)、MB-231膜(泳道5)和单独的样品緩冲液(阴性对照)(泳道6)。11BD-2E11-2在MB-231膜和11BD-2E11-2免疫沉淀物中识别同样的约1S0,M0和M0kDa的三条带。在抗-MCSP(克隆9丄27)免疫沉淀物泳道中只有上部的280kDa带^t识别。任一同型对照免疫沉淀物泳道中都没有反应，暗示11BD-2Ell-2针对免疫沉淀物的反应性是由于同时被11BD-2E11-2和9.2.27特异性结合并免疫沉淀的蛋白质造成的。在使用IgGl同型对照探测的(克隆107.3)平行印迹中(图面B)，任何一条泳道中都没有观察到反应性，暗示在用11BD-2Ell-2探测的印迹中观察到的反应性是特异性的。图面C显示家兔多克隆抗-大鼠NG2抗体结合平行印迹。抗-NG2结合到11BD-2E11-2免疫沉淀物(泳道l)中两条大约为150和240kDa的条带，但其并不结合任何其他泳道中相同分子量范围的蛋白。在一个平行的印迹中(图面D)，正常家兔IgG针对IgG2a免疫沉淀物(泳道4)和MB-231膜(泳道5)中的蛋白质显示微弱的非特异性反应性。因此，图面C上的这些泳道中(用家兔抗-NG2探测)的相同反应性应该看作是非特异性的。在一个平行的印迹中(图面E)，抗-MCSP(克隆9.2.27)只显示与抗-MCSP(克隆9.2.27)免疫沉淀物泳道中的一条带的非常微弱的结合(泳道3,如尖头所示)；这条带在MB-231膜(泳道5)中没有观察到，这暗示9.2.27可能对这种抗原具有低的亲和性，只有在其以浓缩的形式存在，例如在免疫沉淀的样品中时才显示反应性。在最后一个用IgG2a同型对照(克隆G155-228)探测的平行的印迹中(图面F)，任何泳道中都没有观察到反应性，暗示在用抗-MCSP(克隆9.2.27)探测的印迹中观察到的反应性是特异性的。这些结果显示，被11BD-2Ell-2免疫沉淀物的蛋白为MCSP的大鼠源类似物所识别，而被抗-MCSP免疫沉淀的蛋白被11BD-2E11-2所识别。质谱鉴定结合使用已知商业化抗体验证的结果显示，11BD-2E11-2的抗原是MCSP。这也和实施例2的去糖基化实验是一致的，因为MCSP的核心蛋白是糖蛋白。实施例4如S.N.10/743,451所提出的，杂交瘤细胞系11BD-2E11-2根据布达佩斯条约于2003年11月11日被保藏于AmericanTypeCultureCollection(美国典型培养物保藏中心)，10801UniversityBlvd.,Manassas,VA20110-2209,保藏号(AccessionNumber)为PTA誦5643。根据联邦条例法典(CFR)1.808，保藏人保证，所有对于该保藏材料的公众可用性施加的限制将会在专利授权时不可撤回地消除。抗体生产通过在CL-1000培养瓶(BDBiosciences,Oakville，ON)中培养杂交瘤来生产11BD-2E11-2单克隆抗体，每周进行两次收集和重接种(reseeding)。抗体用ProteinGSepharose4FastFlow(AmershamBiosciences,Baied'Urfe,QC)根据标准抗体纯化程序来纯化。如S.N.10/348,231中所描述的,在细胞毒性测试中，将11BD-2E11-2与多种阳性对照(抗國Fas(EOS9.1,IgM，k，20jUg/mL,eBioscience,SanDiego,CA)、抗-Her2/neu(IgGl,/c，10Mg/mL，InterMedico,Markham，ON)、抗-EGFR(C225,IgGl,k,5gg/mL,Cedarlane,Hornby,ON)、》文线菌酮(lOO]tiM),Sigma,Oakville,ON)和NaN3(0.1%,Sigma,Oakville,ON))和阴性对照(107.3(抗陽TNP,IgGl,k，20/xg/mL，BDBiosciences,Oakville,ON)、G155-178(抗-TNP,IgG2a，k，20/ig/mL,BDBiosciences,Oakville,ON)、MPC-11(抗原特异性未知，IgG2b,k，20/xg/mL)、J606(抗-果聚糖，IgG3，zc，20jng/mL)及IgG緩冲液(2%))作比较(表2)。测试了乳腺癌(MDA-MB-231(MB-231),MDA-MB-468(MB-468),MCF-7)、结肠癌(HT-29,SW1116，SW620)、肺癌(NCIH460)、卵巢癌(0VCAR-3(OVCAR))、前列腺癌(PC-3)及非癌(CCD27sk，Hs888Lu)细胞系(都来自ATCC,Manassas,VA)。活/死细月包毒性测定系统得自MolecularProbes(Eugene,OR)。测定按照制造商的指示进行，同时作如下的变化。在测定之前将细胞以确定的合适密度铺板。2天后，将纯化的抗体或对照用培养基稀释，转移1000微升到细胞板中并在5。/。C02培养箱中温育5天。翻转培养板将其倒空并吸干。用多通道压挤瓶将室温的含MgCh和CaCl2的DPBS分施到各个孔中，抽吸(tapped)3次，翻转倒空，然后吸干。向每个孔中加入50微升稀释于含MgCl2和CaCl2的DPBS50的荧光钙黄绿素染料，在37。C的5。/。C02培养箱中温育30分钟。用Perkin-Elmer10HTS7000荧光酶标仪读板，用MicrosoftExcel分析数据，结果列表于表l。该数据代表4个一式三份的实验的平均，并以下面的形式定性地表示4/4的实验高于阈值的细胞毒性(+++),3/4的实验高于阈值的细胞毒性(++)，2/4的实验高于阈值的细胞毒性(+)。表1中未标记的细胞表示矛盾或低于高于阈值的细胞毒性的作用。11BD-2E11-2在乳腺癌和卵巢癌细胞中是特异性细胞毒性，且不影响正常细胞。化学细胞毒剂导致了预期的细胞毒性，而引入作为比较的其他数种抗体在20个生物细胞测定的限定条件下也如预期的作用。总之，显示11BD-2E11-2抗体具有针对两种癌细胞的细胞毒活性。该抗体的这种活性是选择性的，因为不是所有种类的细胞都对其敏感。另外，该抗体还显示功能上的特异性，因为其对非癌类细胞不产生细胞毒性，这在治疗中是重要的因素。表2乳腺结肠肺卵巢前列腺正常MB-231MB-468MCF-7HT-29SW116SW620NCIH460OVCARPC-3CCD27skHs888Lu11BD-2E11-2一-+-_—-+-一一<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>用流式细胞术(FACS)评估11BD-2E11-2对上面这组癌细胞和正常细胞系以及下面的卵巢癌细胞系(A2780-cp，A2780-S，C-14,OV2008，Hey,OCC-I，OVCA-429andES-2+SEAP)的结合。首先通过用DPBS(不含Ca—和Mg++)洗涤来制备FACS的细胞。然后使用细胞解离緩冲液(INVITROGEN,Burlington,ON)在37°C下使细胞脱离其培养板。离心收集以后，将细胞重悬于含有MgCl2、CaCl2和2或25%胎牛血清(FBS)的4°CDulbecco's磷酸盐緩冲盐水(洗涤培养基)，并计数，分装到合适的细胞密度，离心沉降细胞，并在冰上将细胞重悬于20/il含有11BD-2E11-2或对照抗体(同型对照或抗-EGFR)的染色培养基(含有MgCl2和CaCl2+/-2Q/。FBS的DPBS)30分钟。在加入AlexaFluor488交联的第二抗体之前，用洗涤培养基洗涤细胞一次。然后用20到30分钟加入溶于染色培养基的AlexaFluor488。然后最后一次洗涤细胞，并将细胞重悬于含有1/ig/mL碘化丙锭或1.5%多聚曱醛的染色培养基。通过在FACScan上运行样表3<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>品，使用CellQuest软件(BDBiosciences,Oakville，ON)评估流式细胞的捕获。细胞的前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC)通过调节FSC和SSC检测器的电压和振幅增益来设定。三个荧光通道(FL1、FL2和FL3)的检测器通过如下调节运行用同型对照抗体染色的细胞，然后是AlexaFluor488交联的第二抗体，以使得细胞具有均一的峰，其中值荧光强度为大约1-5单位。通过对FSC设门(gating)和碘化丙锭排除(当其使用时)来捕获活细胞。对于每个样品，大约捕获10,000个活细胞用于分析，结果如表3和4所示。表3和4列出平均荧光强度相对同型对照增加的倍数，如下定性地表示低于5(-);5到50(+);50到100(++)并在括号中，被染色的细胞的百分比(表3和表4列出了平均荧光强度超过同型体的增加倍数<5(-);5-50(+);50-100(++);〉100(+++)，细胞染色细胞的百分比)。代表性的11BD-2E11-2直方图编为图5。11BD-2E11-2显示对乳腺肺瘤细胞系MDA-MB-231(表3)和数种卵巢肿瘤细胞系包括ES-2+SEAP(表4)的特异性肺瘤结合。11BD-2Ell-2也有对非癌细胞的结合，但该结合并未产生细胞毒性。进一步有证据显示结合并不一定预示着抗体和其同源抗原交连(ligation)的结果，这是一个非显而易见的发现。该发现暗示在不同的细胞中抗体交连的背景不仅仅对抗体结合，而且对于细胞毒性是决定性的。实施例5正常人类组织染色进行免疫组化研究以鉴定人体中11BD-2E11-2抗原的分布。之前先进行免疫组化的优化研究以确定进一步实验的条件。如上所述生产和纯化11BD-2Ell-2单克隆抗体。使用冷冻的人类正常器官组织阵列(Clinomics，Watervliet,NY)，用抗体结合20种正常人类组织。在冷(-20。C)丙酮中将玻片后固定10分钟，再使其恢复室温。将玻片在4。C冷磷酸盐緩冲盐水(PBS)中漂洗3次，每次2分钟，然后在3%过氧化氬中洗涤IO分钟以封闭内源的过氧化物酶活性。然后将玻片在PBS中洗3次，经过5分钟，然后在Universal封闭溶液(Dako,Toronto,Ontario)中室温下孵育5分钟。在抗体稀释緩冲液中(Dako，Toronto,Ontario)将11BD-2Ell-2、抗人肌肉肌动蛋白(克隆HHF35，Dako,Toronto,Ontario)或同型对照抗体(针对黑曲霉(^y/^^7/wm'gw)葡萄糖氧化酶，该酶在哺乳动物组织中既不存在也不能被诱导。)稀释到工作浓度(对每种抗体为5Mg/mL,但对抗-肌动蛋白为2/ig/mL)并在室温下孵育过夜1小时。用提供的HRP交联的第二抗体(DakoEnvisionSystem,Toronto,Ontario)在室温下经过30分钟4企测/显现第一抗体的反应性。这一步后，用PBS将玻片洗涤3次每次2分钟，然后加入DAB(3，3-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako,Toronto,Ontario)发色团底物溶液产生颜色反应来进行免疫过氧化物酶染色，染色在室温下进行10分钟。在自来水中洗涤玻片以终止生色反应。用Meyer'sHematoxylin(SigmaDiagnostics,Oakville,ON)复染后,用梯度浓度的乙醇(95-100%)将玻片脱水，并用二曱苯透明。使用封固剂对玻片进行盖片。用Axiovert200(ZeissCanada,Toronto,ON)对玻片进行显微观察，用NorthernEclipseImaging软件(Mississauga,ON)采集和保存数字图象。所得结果由病理学研究人员来阅读，评分和解析。表5显示了11BD-2Ell-2对正常人组织针对染色的结果总结。从该表看，组织染色主要有两类。有一组组织完全是阴性。这些组织包括正常曱状腺、支气管和左心室的心肌(图6)。第二组组织包括这样的组织，其在组织切片中染色是阳性，单仅限于血管的平滑肌纤维和/或上皮(图7)。这些结果提示，11BD-2E11-2的抗原在正常组织中不是广泛表达的，且该抗体只会结合人体中数目有限的正常组织。正常人组织的11BD-2Ell-2染色与先前报道的一种抗-MCSP抗体B538相似。B5先前^皮i正明结合皮肤角质形成细胞，肺泡上皮和毛细血管内皮。表5.对冷冻人正常组织的11BD-2Ell-2免疫组化(IHC)数据表IHC评分序列号组织年龄性别11BD-2E11-2肌动蛋白IgG阴'性对照1支气管61男-(PD)+++SMF和粘液性腺泡的肌上皮CD2膈61男+++血管SMF+A骨骼肌纤维+++骨骼肌纤维和血管SMF3胸肌(骨骼肌)61男+++血管SMF+++骨骼肌纤维和血管SMF4肺61男+++肺泡上皮和血管SMFCD-(F)主动脉61男十+SMF(F)CD-6左心室(心肌)61男+++血管SMF-+心"/1纤维7食道61男+++SMF(PD)CD-(F)8气管61男-(PD)+++SMF和粘液性腙_泡的肌上皮9肾61男+++血管SMF+++血管SMF-10肾上腺61男+++血管SMF+++血管SMF-11胰腺61男+++血管的SMF+肺泡上皮+++血管SMF-12脾61男+++血管的SMF和多形核白细刀包(polymorphs)(F)+++血管SMF，网状纤维和多形核白细胞(F)Bg(多形核白细月包)13肝61男+++血管SMF-(PD)-14皮肤61男+++血管SMF十A角质形成细胞+++血管SMFBg(间质)39<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>缩写SMF:平滑肌纤维，Bg:背景染色，PD:部分脱离，F:折叠，CD:完全脱离。实施例6人乳腺肺瘤染色进行免疫组化来确定11BD-2Ell-2抗原和人乳腺癌的结合。与肌动蛋白(阳性对照)和抗黑曲霉葡萄糖氧化酶抗体(阴性对照)作比较，黑曲霉葡萄糖氧化酶是一种在哺乳动物细胞中既不存在也不可被诱导的酶。使用了来自15个乳腺癌患者的乳腺癌组织阵列和5个来自乳腺癌患者的非癌性乳腺组织的样本(Clinomics,Watervliet，NY)。提供了每个患者的下列信息年龄，性别和诊断结果。依照实施例5的免疫组化程序。表6提供了11BD-2E11-2抗体对乳腺癌组织阵列染色的结合情况的总结。每个阵列含有来自15名单独患者的肿瘤样本。总的说来，8个被测试的病人(7个肿瘤样本或是完全脱离，或者无代表性)中有62%呈11BD-2E11-2抗原阳性。同样对于11BD-2Ell-2，3个来自乳腺癌患者的正常乳腺组织样本(同样有两个组织样本完全脱离)中0个为阳性(图8)。11BD-2E11-2抗原看起来不存在肺瘤阶段越高阳性表达越高的倾向。但是由于样本量小，该结果是受限制的。11BD-2E11-2染色对癌细胞是特异性的(图8)。11BD-2Ell-2所得的染色模式显示，在患者的样本中，该抗体针对恶性细胞是高度特异性的，这就使其成为一种有吸引力的药用目标。11BD-2E11-2的乳腺肿瘤染色与先前才艮道的抗-MCSP抗体B5的染色相似。B5此先被证明与60%的乳腺癌肺瘤组织结合。表6:对冷冻人正常组织和乳腺肿瘤组织的11BD-2Ell-2免疫组化<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>缩写SMF:平滑肌纤维，PD:部分检测到，F:折叠，CD:完全脱离。实施例7体内MDA-MB-468成瘤实验关于图9:6到8周龄雌性SCID小鼠用溶于100微升盐水中2百万个MDA-MB-468人乳腺癌细胞颈背皮下注射才直入。每周用卡尺测量肿瘤生长。当群组中的大多数达到100mn^的肺瘤体积时，随才几分配5-6只小鼠到两个处理组中的每一组。将11BD-2E11-2或緩冲液对照从浓贝i液用含2.7mMKC1，1mMKH2P04,137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释剂稀释后，以10mg/kg/剂量通过腹膜下注射施用300微升。然后以相同的方式将该抗体每周施用3次共10次剂量直到植入后的第66天。大约每隔6天用卡尺测量肿瘤生长，测量在本研究的整个期间内都进行，或者直到个体小鼠达到CCAC终点标准为止。在本研究的整个期间内记录小鼠的体重。研究结束时，根据CCAC指南将所有小鼠无痛苦处死。随才几分配时，每个组中的平均肿瘤体积和标准偏差是相似的。统计学上两组之间没有体重差异。这说明产生了真正的随机。如图9所示，在3周的处理阶段结束时，与緩冲液对照相比，抗体11BD-2E11-2抑制了25%的肿瘤生长^=0.52)。虽然这并不是显著的差别，但是在整个研究过程中都观察到了相对于緩冲液对照肿瘤体积减小的倾向。因此，11BD-2E11-2在确立的乳腺癌模型中显示了效力。实施例8体内MDA-MB-468成瘤实验关于图10和11:6到8周龄的雌性无胸腺棵小鼠腹膜内植入1千万个稳定转染以表达人胎盘分泌的碱性磷酸酶的ES-2+SEAP人卵巢癌细胞(SEAP)。所述1千万个卵巢癌细胞重悬于500微升无血清的a-MEM中。第7天牺牲3只小鼠确证肿瘤生长。第7天确认肿瘤生长之后，将8只小鼠随机分配到2个处理中的每一组中。将11BD-2E11-2或緩冲液对照从浓贮液用含2.7mMKC1，1mMKH2P04，137mMNaCl和20mMNa2HP04的稀释剂稀释后，以10mg/kg/剂量通过腹膜下注射施用250微升。然后将抗体每天一次施用5个剂量，然后每两天一次施用5个剂量，总共10个剂量。然后通过测量循环的SEAP的水平来推断并根据尸体解剖来观测肿瘤负荷，该推断或观测在整个研究期间都进行，或到单个小鼠达到CCAC的终点指标为止。在本研究的整个期间内记录小鼠的体重。研究结束时，根据CCAC指南将所有小鼠无痛苦处死。随机分配时分析循环血浆SEAP水平(指示肿瘤负荷)。11BD-2Ell-2和緩沖液对照之间平均SEAP水平没有显著差异。但是，在组内有变化的成瘤率(tumortakerate)。如图10所示，抗体11BD-2Ell-2在处理组的群中显示了提高生存的趋势。如图ll所示，一只接受11BD-2Ell-2处理的小鼠的循环SEAP的量降到几乎可忽略的水平。该低循环SEAP水平一直持续到植入后第60天。总之，这些11BD-2E11-2在多种人癌症模型中产生了效益(相对于对照处理提高的生存和降低的肿瘤负荷)的结果提示了这种抗体用于哺乳动物包括人的的癌症治疗的药理学和药学效益。43大多数证据显示11BD-2Ell-2通过与MCSP上存在的表位连接而介导抗癌作用。对本发明而言，该表位被定义为"MCSP抗原性部分"(MCSPantigenicmoiety),其特征在于可结合杂交瘤细胞林11BD-2E11-2所编码的单克隆抗体或其抗原结合片段或其抗体交联物。实施例3中已经显示了11BD-2E11-2可以用从表达细胞，例如MDA-MB-231细胞免疫沉淀其同源抗原。进一步还可以证明，11BD-2E11-2抗体可用于通过例如但不限于流式细胞术、细胞ELISA或免疫组化分析等手段检测表达与其特异性结合的MSCP抗原性部分的细胞和/或组织。由此，利用流式细胞术、细胞ELISA或免疫组化分析可以证明，被免疫沉淀的11BD-2Ell-2抗原可抑制11BD-2Ell-2结合这样的细胞或组织。另夕卜，和11BD-2E11-2抗体一样，其他抗-MCSP抗体可以用来免疫沉淀并分离其他形式的MCSP抗原，而且，^使用同种分析，该抗原也可用来抑制上述抗体结合表达该抗原的细力包或组织。本发明书中提及的所有专利和出版物都指示本发明相关
技术领域：
的现有技术水平。所有专利和出版物都通过引用并入本发明，其程度相当于单独地和具体地指明将每一出版物通过引用并入。应当理解，尽管本发明的一种特定形式被阐明了，但本发明并不限于这种特定形式或本文中描述和显示的部分的排列。对本领域的技术人员而言显而易见的是，可以在不脱离本发明的范围的同时作出多种变化，且本发明不应净皮认为限于本说明书所显示和描述的。本领域的技术人员很容易理解，本发明很好地适于实现本文提到和内在包含的目标，并获得本文提到和内在包含的结果和收益。本文中描述的任何寡核苷酸、肽、多肽、生物学上相关的化合物、方法、程序和技术在此都代表所述优选的实施方式，其是作为示例，而不是作为对范围的限制。本领域的技术人员可以想到其中的变化和其他用途，这些都被涵盖在本发明的精神之中并由所附权利要求的范围所限定。尽管本发明已经结合特定的优选实施方式得到描述，应当理解的是本发明，如已申明的，不应被过分地限制于这些具体的实施方式。毫无疑问，对于所描述的本发明的实施模式所作的、对本领域的技术人员而言显而易见的各种修改，都被认为包含在下面的权利要求的范围之内。权利要求1.抗癌抗体或其片段在制备治疗患者癌性疾病的药物中的用途，所述抗癌抗体或其片段的特征在于，其对于癌性组织的细胞是细胞毒性的，且对于非癌性细胞是基本上良性的；其中所述抗体或其片段与药学上可接受的佐剂能够制成混合物；所述抗体为分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其结合所述癌性组织表达的抗原性部分，所述抗原性部分的特征在于其被这样的抗体所识别该抗体具有在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征。2.根据权利要求1所述的用途，其中所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段是人源化的或嵌合的。3.根据权利要求1所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自毒素、酶、放射性化合物和血源性细胞的成员交联而形成抗体交联物；以及其中所述抗体交联物或交联片段与药学上可接受的佐剂能够制成混合物。4.根据权利要求3所述的用途，其中所述抗体或其片段是人源化的或嵌合的。5.根据权利要求1所述的用途，其中通过抗体依赖性细胞毒性来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。6.根据权利要求1所述的用途，其中通过补体依赖性细胞毒性来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。7.根据权利要求1所述的用途，其中通过催化细胞化学键的水解来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。8.根据权利要求1所述的用途，其中通过产生针对位于肿瘤细胞上的推测的肿瘤抗原的免疫反应来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。9.根据权利要求1所述的用途，其中通过靶向细胞膜蛋白以干扰其功能来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。10.根据权利要求1所述的用途，其中通过产生可有效地产生引发细胞杀伤的信号的细胞蛋白质中的构象变化来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。11.抗癌抗体或其片段在制备用于治疗患者癌性疾病的药物中的用途，其中所述抗癌抗体或其片段的特征在于其对于癌性组织的细胞是细胞毒性的，且对于非癌性细胞是基本上良性的；其中所述抗体是由在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，且能够与药学上可接受的佐剂混合。12.根据权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其片段是人源化的或嵌合的。13.根据权利要求11所述的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段与选自毒素、酶、放射性化合物和血源性细胞的成员交联而形成抗体交联物；以及其中所述交联的抗体能够与药学上可接受的佐剂混合。14.根据权利要求13所述的用途，其中所述抗体或其片段是人源化的或嵌合的。15.根据权利要求11所述的用途，其中通过抗体依赖性细胞毒性来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。16.根据权利要求11所述的用途，其中通过补体依赖性细胞毒性来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。17.根据权利要求11所述的用途，其中通过催化细胞化学键的水解来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。18.根据权利要求11所述的用途，其中通过产生针对位于胂瘤细胞上的推测的肺瘤抗原的免疫反应来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。19.根据权利要求11所述的用途，其中通过靶向细胞膜蛋白以干扰其功能来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。20.根据权利要求11所述的用途，其中通过产生可有效地产生引发细胞杀伤的信号的细胞蛋白质中的构象变化来介导所述抗体或其片段的细胞毒性。21.分离的单克隆抗体或其抗原结合片段在制备介导在细胞表面表达MCSP抗原性部分的人肿瘤细胞的细胞毒性的药物中的用途，所述抗体或其抗原结合片段能够与所述的表达的抗原性部分的分离的单克隆抗体或其抗原结合片段相结合，所述抗原性部分的特征在于其被这样的抗体所结合该抗体具有在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征，所述结合从而导致细胞毒性发生。22.根据权利要求21所述的用途，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的或嵌合的。23.根据权利要求21所述的用途，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段能够与选自毒素、酶、放射性化合物和血源性细胞的成员交联，从而形成抗体交联物。24.根据权利要求23所述的用途，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是人源化的或嵌合的。25.根据权利要求21所述的用途，其中所述分离的抗体或其抗原结合片段是鼠源的。26.根据权利要求21所述的用途，其中所述人肿瘤选自乳腺肿瘤。27.确定细胞存在的结合测定方法，所述细胞表达MCSP抗原性部分，所述抗原性部分与分离的多克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合，所述分离的多克隆抗体由在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码；所述结合测定方法包括提供细胞样品;提供分离的多克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是结合所述表达的MCSP抗原性部分的分离的单克隆抗体及其片段，所述抗原性部分的特征在于其被这样的抗体所结合该抗体具有在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征；使所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品接触；并确定所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品的结合；藉此，可以确定表达MCSP抗原性部分的细胞的存在，其中所述MCSP抗原性部分特异性地结合所述分离的单克隆抗体或其抗原。28.根据权利要求27所述的结合测定方法，其中所述细胞样品是从选自乳腺组织的组织中发生的肿瘤获得的。29.分离的多克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于确定细胞存在的结合测定的试剂中的用途，所述细胞表达MCSP抗原性部分，所述抗原性部分与分离的多克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合，所述分离的多克隆抗体由在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码。30.根据权利要求29所述的用途，其中所述细胞来自乳腺肿瘤。31.从样品中分离或篩选细胞的方法，其中所述细胞表达MCSP抗原性部分，所述抗原性部分与分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合，所述抗原性部分的特征在于其被这样的抗体所结合该抗体具有在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征；该分离或筛选细胞的程序包括提供细胞样品；提供分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段是结合所述表达的MCSP抗原性部分的分离的单克隆抗体及其片段，所述抗原性部分的特征在于其被这样的抗体所结合该抗体具有在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征；使所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品接触；并确定所述分离的单克隆抗体或其抗原结合片段与所述细胞样品的结合；藉此，通过所述结合分离了所述细胞并确证了这些细胞在所述细胞样品中的存在，其中所述细胞表达MCSP抗原性部分，所述抗原性部分与分离的单克隆抗体或其抗原结合片段特异性地结合，所述单克隆抗体由在ATCC保藏为PTA-5643的克隆所编码。32.根据权利要求31所述的方法，其中所述细胞样品是在乳腺组织中发生的肿瘤。33.单克隆抗体或其抗原结合片段在制备通过在哺乳动物中治疗人类肺瘤来延长生存和/或延迟疾病进展的药物中的用途，其中所述肿瘤表达抗原，所述抗原与所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异地结合，所述单克隆抗体具有在ATCC保藏为登录号PTA-5643的克隆所编码的单克隆抗体的鉴定性特征。34.根据权利要求33所述的用途，其中所迷抗体与细胞毒性部分交联。35.根据权利要求33所述的用途，其中所述细胞毒性部分是放射性同位素。36.根据权利要求33所述的用途，其中所述抗体激活补体。37.根据权利要求33所述的用途，其中所述抗体介导抗体依赖性细月包毒性。38.根据权利要求33所述的用途，其中所述抗体是鼠源抗体。39.根据权利要求33所述的用途，其中所述抗体是人源化抗体。40.根据权利要求33所述的用途，其中所述抗体是嵌合抗体。全文摘要癌性疾病调节抗体(CDMAB)11BD-2E11-2用于治疗人类肿瘤的用途和分离及鉴定癌性细胞的方法，所述癌性细胞表达黑色素瘤相关硫酸软骨素蛋白聚糖(MCSP)抗原性部分。单克隆抗体11BD-2E11-2(ATCC登录号PTA-5643)与MCSP抗原性部分结合，其对于表达该抗原部分的癌细胞是细胞毒性的。单克隆抗体11BD-2E11-2可用于延迟人类肿瘤的疾病进展。文档编号A61K51/10GK101254303SQ200710308359公开日2008年9月3日申请日期2005年3月23日优先权日2004年3月26日发明者大卫·S·F·杨,海伦·P·芬德利,艾莉森·L·费里,苏姗·E·哈恩申请人:阿里乌斯研究公司