显示cd63表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法

专利名称：显示cd63表面表达的细胞的细胞毒性介导的制作方法
技术领域：
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，尤其涉及肿瘤细胞的细胞毒性 的调节；最尤其涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为引发细胞毒性反应 的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发 明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。
背景技术：
癌症中的CD : CD63属于四次跨膜蛋白(tetraspanin)家族中的三型 膜蛋白，该家族目前20个成员的特征是均具有四个跨膜片段。几个工作 组通过使用针对活化的血小板的、中性粒细胞的和黑色素瘤细胞的全细 胞制备物的抗体，独立地确定了 CD63的表达。对它们的同源糖蛋白抗 原的各自的cDNA进行克隆后确认了这些不同细胞上的抗原为同一种分 子。随后，第六次国际白细胞分型研讨会(1996)将这些抗体归类为CD63 抗体。在1996年该研讨会之前，CD63曾以多个名称被命名(黑色素瘤1 抗原、眼黑色素瘤相关抗原、黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜 糖蛋白3、致密体膜蛋白(granulophysin)、黑色素相关抗原MLA1)，这些 名称往往与导致发现CD63的部分特性以及确认的抗体有关。因此，CD63 也曾被称为ME491抗原(MAb ME491)、神经腺(neuroglandular)抗原(MAbs LS59， LS62， LS76， LSI 13， LSI40， LSI52)、 Pltgp40 (MAbs H5C6, H4F8 和H5D2)、人类骨髓基质细胞抗原(MAb UF12)、骨祖细胞特异性标志物 (MAb HOP-26)和整合素相关蛋白(MAb 6H1)。被发现与人类CD63发生 交叉反应的其他抗体有8-lH、 8_2A (与ME491发生交叉反应)、NKI/C-3 禾口 NKI/black-13 (Vannegoor and Rumke， 1986; Demetrick ， 1992; Wange"/.， 1992)。
利用抗人黑素瘤细胞制备物的众多抗体的一种，即MAbME491，从 黑素瘤cDNA文库最先克隆出CD63 。人黑素瘤活检研究表明MAb ME491的反应性与黑素瘤的进展呈负相关。在正常黑色素细胞中，MAbME491 抗体的活性低，在黑色素瘤进展早期阶段(发育异常痣和放射生长期 (radial growth phase ， RGP)肿瘤)抗体活性升高，在更晚期的黑色素瘤例如 垂直生长期(vertialgrowth phase, VGP)和转移性肿瘤中，MAb ME491抗 体的活性则下降甚至丧失。应用MAb2.28(抗活化血小板)，CD63也在人 血小板中被发现并被部分表征，所述MAb 2.28检测活化-依赖的血小板 膜53kDa糖蛋白。该分子还与未激活的血小板的内部颗粒膜有关。同一 研究中，MAb2.28也用于标记巨核细胞和内皮细胞的内部颗粒，其中它 与抗体共定位到组织蛋白酶D，所述组织蛋白酶D是已知的溶酶体小室 标志物。关于抗体聚集和表达克隆的后续研究，证明该抗体识别的抗原 就是CD63，还证实其存在于溶酶体小室，在那里它与小室-特异性标志 物LAMP1和LAMP2共定位。该分子的克隆鉴定其确为CD63，并且属 于四次跨膜蛋白家族。
在许多不同组织和细胞中都能够检测到CD63的表达。在细胞水平， 人们发现它与质膜结合，也与细胞内晚期内体(late endosomal)的嚢状结构 结合。某些情况下，细胞活化通过动员细胞内储备的CD63来增加表面 表达。在B淋巴细胞，尤其在内体(endosomes)、参与将MHC II类分子 复合物输出到表面的外体(exosomes)和分泌嚢泡中，还发现CD63与MHC II类分子共定位并发生物理结合。在包括B淋巴细胞和T淋巴细胞、中 性粒细胞、乳腺癌和黑素瘤细胞的许多细胞类型中，发现CD63与诸如 CD9、 CD81、 CD11 (整合素链"m'l,x)、 CD18 (整合素链/32)、 CD49c (VLA-3 或者整合素链a3)、 CD49d (整合素链a0、 CD49f (VLA-6或者整合素链 和CD29 (整合素链A)的其他四次跨膜蛋白家族的成员相互作用。
CD63在癌症中的作用还不清楚。尽管最初几个相互独立的工作组发 现CD63参与诸如血小板和粒细胞活化、MHC II类分子依赖的抗原提呈、 整合素依赖性细胞粘附和运动以及某些类型癌症的肺瘤进展的多种事 件，但其功能还有待进一步充分阐述。虽然目前有证据支持CD63在多 种细胞生理事件中的发挥作用，但是还不清楚这些作用是彼此独立的还 是具有CD63参与的潜在的共同细胞机制。
几个工作组已经研究了 CD63和某些类型肿瘤进展之间的关系，特别是与黑色素瘤进展之间的关系。除MabME491之外，还研发了多种其 它的抗CD63单克隆抗体以用于对从携带不同进展阶段肺瘤的患者获得 的癌症标本进行免疫组化(immunohistochemical, IHC)染色。观察到着色 变浅被作者解释为极可能反映CD63的表达降低，并与肺瘤的晚期进展 和转移性特征相关。更近的一项研究还描述了包括CD63在内的几个四 次跨膜蛋白家族成员表达水平的明显下调(mRNA定量后)与几种乳腺癌 来源的细胞系体外侵袭性的显著相关性。另外一项研究通过差异显示法 确定了在去除雌激素的培养乳腺癌细胞中具有CD63。这说明CD63的表 达受到类固醇-激素的调节，并且改变的CD63丰度和/或功能也可能与乳 腺肺瘤进展有关。
与之相比，利用抗CD63单克隆抗体MAb FC-5.01的研究揭示了其 活性表位在不同正常组织中表达不同。尽管该抗体被发现能识别CD63， 但它并不能区分早期黑色素瘤和包括转移性黑素瘤在内的更晚期的黑色 素瘤(与MAbME491不同)，这表明CD63抗原存在于这些更晚期的肺瘤 细胞上，但是在来自不同阶段的肺瘤的细胞中，它的某些表位被掩盖。 这可能由于核心CD63多肽的翻译后修饰发生改变，或是由于CD63和其 他分子的相互作用，影响了用于抗体识别和结合的特定表位的提供。这 些研究结果支持Si和Hersey(1993)所描述的观察结果，即用抗CD63 MAb NKI-C3的染色不能区分来自诸如早期、放射生长期、垂直生长期以及转 移性黑素瘤的不同进展阶段的黑素瘤的组织切片。尽管在对来自乳腺癌 和非小细胞性肺癌细胞的mRNA的其他研究分析(Adachi et al.， 1998; Huang etal., 1998)中，通过定量PCR，发现四次^争膜蛋白分子家族中的两 个成员(CD9和CD82)的表达水平与肺瘤进展和患者预后存在明显的相关 性，但没有发现CD63存在这种相关性，因为CD63在所有的样本中表达 都是相似的。由于这些结果存在明显冲突，因此缺乏能明确证明CD63 和肺瘤之间的关系的有力和一致的数据。
到目前为止，很少有体内研究试图建立CD63与该分子的晚期胂瘤 抑制功能之间的联系。在这些研究中的一项中，经皮下和腹腔注射入无 胸腺小鼠的人CD63过度表达的H-RAS转化的NIH-3T3细胞，与亲代无 CD63过度表达的小鼠细胞比较，显示出恶性/致瘤性降低的表型，所述表型由减小的肺瘤体积和降低的转移可能性以及增加的生存时间所表
明。这表明转化细胞中人CD63的存在会抑制它们的恶性行为。更近期， 利用表达人CD63的转基因d、鼠模型并诱导对CD63产生耐受的研究工作 表明用与牛痘病毒融合的人CD63免疫时，可以抑制注射的人CD63-MHC I型(H-2Kb)共转染鼠黑素瘤细胞的肿瘤生长，并增加生存期。该研究作者 指出由于肿瘤生长的抑制作用仅存在于被注射CD63-MHC-I型共转染 细胞，而不是CD63单独转染细胞系的动物中，所以这种治疗作用是T 淋巴细胞依赖性的，看起来内源性抗CD63抗体并未参与该保护作用。 该解释得到以下事实的支持经纯化的人CD63预免疫并且显示已产生 抗人CD63抗体的野生型动物中，没有抗肿瘤细胞生长的保护作用。 Radford等人(1995)利用人CD63转染KM3细胞系(最初认为是人源，后 来定性为鼠源)的研究工作表明当将所述细胞皮内注射入无胸腺小鼠时， 与使用未转染的KM3亲代细胞观察到的结果比较，该蛋白的表达减慢了 这些细胞的生长并降低了其转移潜能，尽管各种转染和未转染细胞系的 体外生长率并无显著性差异。这些观察将CD63的潜在作用与其他已知 的在体内和体外影响肿瘤细胞生长率的肺瘤抑制基因区分开来。此外， 在体外试验中(Radford et al., 1997),抗CD63单克隆抗体ME491的添加 不影响相同细胞的体外生长率，所述ME491被发现通过减少细胞的随机 运动影响它们的功能。
这项研究还描述了如下观测结果在诸如层粘连蛋白、纤维连接蛋 白、胶原和玻璃粘连蛋白的细胞外基质(ECM)衍生的趋化因子作用下， CD63能促进迁移，并且这种作用可以由^-型整合素的功能性参与介导， 尽管针对整合素的抗体并不能够阻断这些作用。然而，看起来在CD63 转染细胞上，玻璃粘连蛋白介导的信号(已知为整合素cg3s的配体)的作用 与由诸如纤维连接蛋白、层粘连蛋白和胶原的其他ECM成分介导的信号 的作用之间存在拮抗效应。这提示在在特定条件下，ECM组分存在时， CD63的表达能导致迁移减少，这可能取决于粘附和运动之间的细^:平 衡。另一项研究中，抗CD63单克隆抗体(MAb710F)增强了 PMA处理的 HL-60细胞的粘附性和伸展性，而另 一种抗CD63单克隆抗体(MAb 2.28) 促进类似作用，但只针对更小部分的细胞群，并且只在加入更大的抗体量时发挥所述作用。这些结果表明尽管目前已经开发了多种抗CD63抗 体，但是它们的功能性作用可能存在很大区別。
四次跨膜蛋白家族可能也参与了细胞增殖。Oren等(1990)描述了识 别CD81(TAPA-l)的小鼠MAb5A6对淋巴瘤细胞系的抗增殖作用。在另 一项研究中，人T淋巴细胞的CD37与抗体的结合阻断了 CD37诱导的 增殖。更近期，用CD37表达缺失(CD37敲除)的小鼠动物模型的研究显 示，与来自野生型动物的T淋巴细胞对刀豆蛋白A活化和CD3/T细胞受 体结合的响应相比，来自CD37敲除小鼠的T淋巴细胞过度增殖。因此 提出在细胞生长和增殖中的功能性作用可能是四次跨膜蛋白家族的共 同特征。最近关于肝母细胞瘤和肝细胞癌细胞的研究显示，这些细胞与 抗CD81单克隆抗体的结合导致Erk/MAP激酶通路的活化。已经表明该 信号转导通路参与细胞生长和增殖事件。平行研究也表明，过表达人 CD81的转染细胞系与模拟转染对照组相比显示增殖增加。因此现有证据 已经表明四次跨膜蛋白分子总体，尤其是CD63在细胞生长增殖和细胞 粘附/运动相关事件中的作用。因为这两类细胞事件在肿瘤进展和转移过 程中起着重要作用，所以这两者是目前热点研究的靶点。
目前为止，还没有报道抗CD63抗体或者特异性针对CD63表达细胞 的其它试剂能够同时影响肺瘤细胞的体外和体内生长特性，以及影响肿 瘤细胞生长的动物模型的生存期。
氨基酸序列测定和分析没有揭示四次跨膜蛋白家族与其它蛋白质家 族之间的同源性，或具有任何目前已表征的功能模块，也没有表明其具 有任何目前已知的酶活性。结果，人们很难研究该蛋白质家族在信号转 导通路中的调节作用。但是，利用四次跨膜蛋白特异性试剂产生的证据 表明四次跨膜蛋白具有信号转导特性，所述试剂能改变细胞的生理机 能，而这密切依赖于信号转导通路的调节。CD63在物理和/或功能上均 显示出与大量分子有联系，所述分子本身是参与第二信使信号的产生的 酶，或者在物理和/或功能上与这类酶相关。
实验表明，预先用几种抗CD63单克隆抗体(AHN-16、 AHN-16.1、 AHN-16.2、 AHN-16.3和AHN-16.5)处理中性粒细胞促进它们与培养内皮症反应的起始步骤之一。此外这种作
用强烈地依赖于钙离子(Ca,的存在，所述4丐离子是公知的多种胞内信号
通路的调节因子，它作用于细胞接触刺激性抗体的特定时段。在接触抗 体更长时间后，中性粒细胞对内皮细胞的粘附作用开始变得对后来加入 的钙离子不敏感，因此提示这是动态和短暂的调节(暂时的)事件。此外，
发现CD63在物理上和CD11/CD18蛋白复合物相互作用，特异性靶向作 用于此复合物的试剂介导调节信号。在这项研究中还发现，CD63在物理 上与包括酪氨酸激酶Lck和Hck的酶的复合物有关，或者其本身就是该 复合物的一部分。这些酶是一类蛋白质的成员，这类蛋白质在特定表面 受体活化后，在介导细胞内调节信号中发挥重要作用，是导致细胞特异 性生理变化的信号转导通路级联反应的一部分。另一项研究表明，四次 跨膜蛋白(包括CD63)与单克隆抗体的共连接(co-ligation),能够增强黏着 斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)的磷酸化或活性，所述FAK由 MDA-MB-231乳腺癌细胞对胶原底物的粘附来诱导。这表明CD63(和其 它四次跨膜蛋白家族成员)直接参与整合素介导的酪氨酸激酶信号转导通
路的调节。其它可以在功能上通过抗CD63单克隆抗体MAb 710F与表面 CD63的存在和连接(ligation)交叉的信号通路是那些依赖于通过蛋白激酶 C(protdn kinase C, PKC)磷酸化调节的通路，所述PKC是另夕I、一种公知 的细胞内信号转导通路的调节剂。在本文中，骨髓细胞系HL-60的粘附 和形态改变经由MAb 710F的增强依赖于豆蔻酰佛波醇乙酯(phorbol myristate acetate, PMA)对所述细胞的预处理，尽管PKC的短暂参与并没 有得到最终证实。然而， 一独立工作组的后期研究证实PMA诱导的HL-60 分化是PKC活性依赖的，因为Ro31-8220分子(该酶的特异性抑制剂)阻 断了 PMA的作用。
支持CD63和其他四次跨膜蛋白家族成员与信号转导通路关联的进 一步证据来自下述研究。该研究描述了 CD63 (以及CD53)分子与酪氨酸 磷酸酶活性之间的物理关联(直接结合的或作为超分子复合物的一部分) 在该研究中，利用抗CD63抗体分离的免疫沉淀复合物显示与酪氨酸磷 酸酶活性有关，尽管与显示与酪氨酸磷酸酶CD45有关的CD53不同，但 不可能鉴定CD63相关的磚酸酶。更近期还发现几个四次跨膜蛋白家族的成员与II型磷脂酰肌醇4-激酶(11型PI4-K)有关(Berditchevski d a/.， 1997)。这种相互作用看起来非常特异，因为其仅在CD9、 CD63、 CD81、 CD1 51和A15/TALLA中被确定，并没有观察到发生于CD37、 CD52、 CD82或NAG-2。此外，由于每个含有PI-4激酶的复合物限于单个四次 跨膜蛋白家族成员，所以四次^争膜蛋白家族成员和PI-4K之间的关联是 唯一的。特别发现CD63-PI-4激酶复合物与其它他四次跨膜蛋白成员形 成的复合物不同，几乎完全位于脂我样结构域的细胞内小室中。这一发 现表明，与PI-4激酶相互作用的CD63部分会参与涉及或者依赖于磷酸 肌醇生物合成途径的特定的细胞内事件(Claas， C， "a/, 2001)，已知所述磷 酸肌醇生物合成途径除了作为第二信使分子外，还参与了膜运输(胞吞和 胞吐作用)以及细胞骨架重组的调节(Martin, T., 1998)。
到目前为止发现的与CD63直接相关的所有酶在信号通路调节中的 直接和重要参与提供了支持CD63与信号转导通路调节相关联的进一步 的证据，所述CD63作为这些酶活性下游的调节因子或者效应分子。
阐明导致肿瘤进展的机制是非常困难和复杂的工作，经常被很多明 显的相互矛盾的发现所掩盖，因此很少能够将那些发现成功转化为有效 的疗法。从目前已知的关于CD63与肺瘤进展和转移以及信号转导机制 之间的关联来看，在肿瘤细胞内改变CD63的功能是可能的。
开发对肿瘤细胞具有细胞毒作用的抗原特异性试剂作为潜在的治疗 或者诊断工具将是极其有益的，所述试剂结合表达识别抗原的细胞，并 且通过自身或者与其他分子结合而具有细胞的或者体内的生理活性，以 使这些试剂抑制肿瘤细胞生长、进展和转移，且对正常细胞群无显著的 损伤作用。
用作癌症治疗的单克隆抗体每个患有癌症的个体都是独特的，正 如人的身份有所差异一样，其患有的癌症也不同于其他癌症。尽管这样， 现有疗法用相同方式治疗患有同期同类型癌症的所有患者。这种患者中 的至少30%的一线治疗是失败的，从而导致更多轮次的治疗并且增加了 治疗失败、转移和最终死亡的可能性。优良的治疗方法应该是针对特定 个体的个体化疗法。现有唯一的个体化疗法是手术。化疗和放疗无法针
对患者量身定做，而手术本身在大部分情况下不足以治愈癌症。随着单克隆抗体的出现，开发个体化疗法的可能性变得更加现实， 因为每种抗体可以针对单一表位。此外，有可能制备抗体的组合，所述
组合针对表位的集群(constellation),所述集群唯一地限定了特定个体的肿瘤。
在认识到癌性细胞和正常细胞之间的显著差异是癌性细胞包含对转 化细胞特异的抗原后，科学界长期以来认为可以将单克隆抗体设计为通 过特异结合这些癌症抗原特异地靶向转化细胞；这样就产生了单克隆抗 体可以作为"魔术子弹(MagicBullets)"消除癌细胞的观点。但是，现在已 经广泛意识到没有单一的单克隆抗体可以用于癌症的所有情形，并且单 克隆抗体可以按类来开发，用来治疗目标癌症。依照本发明公开的方法 分离的单克隆抗体已经显示以有益于患者的方式改善癌性疾病过程，例 如通过减轻肿瘤负担，所述分离的单克隆抗体在本文中将分别被称为癌 性疾病调节抗体(CDMAB)或者"抗癌"抗体。
目前，癌症患者通常可选4奪的治疗方法很少。癌症治疗的组合方法 已经改善了总体存活率和发病率。但是，对于特定个体，这些改善的统 计数据和他们个人状况的改善不一定必然相关。
因此，如果提出一种方法学，使医师能够独立于相同群组中的其他 患者来治疗每例肿瘤，这就会使根据个体进行量身定做的独特治疗成为 可能。理论上这种治疗过程将提高治愈率，产生更好的结果，从而满足 长期感受到的需要。
从历史上来看，多克隆抗体已经被用于人类癌症的治疗，但只取得 了有限的成功。已经用人血浆来治疗淋巴瘤和白血病，^旦纟艮少有延长的 症状緩解或者反应。此外，与化疗相比，缺乏重现性，也没有额外的益 处。诸如乳腺癌、黑素瘤和肾细胞癌的实体瘤也用人血液、黑猩猩血清、 人血浆和马血清进行治疗过，但是相应的结果是不可预见和无效的。
有很多用单克隆抗体治疗实体肿瘤的临床试验。在20世纪80年代， 就有至少四项针对人类乳腺癌的临床试验，所述试验在使用了针对特定 抗原或基于组织特异性的抗体的至少47个患者中，只产生了一名应答者。 直到1998年，才有了成功的临床试验，该试验联合使用人源化的抗 Her2/neu抗体(Herceptii/)与顺粕。在这项试验中，对37个患者的反应进行了评估，大约有四分之一的患者有部分反应率，另外四分之一有轻微
的或稳定的病情发展。在反应者中，中位进展时间(median time to progression)是8.4个月，其中中位反应持续时间(median response duration) 是5.3个月。
Herceptii^在1998年被批准作为与Taxof联合使用的一线用药。临 床试验结果表明，与单独接受TaxoP治疗的人群的中位疾病进展时间(3.0 月)相比，接受抗体治疗与Taxol⑧联合应用的患者的中位疾病进展时间(6.9 月)增加。Herceptii^与Taxo^联合治疗组的中位存活时间也轻微增加，与 Taxo产单独治疗组相比是22个月18个月。除此之外，所述抗体和Taxol 联合应用组与单独使用Taxof组相比，在完全应答者(8%: 2%)和部分应 答者(34%: 15%)的数量方面都有增加。然而Herceptir^和Taxof联合治 疗相比Taxo严单独治疗，导致了较高的心血管毒性发病率(分别是13%和 1%)。此外，Herceptii^治疗也只对那些过表达人类表皮生长因子受体 2(Her2/neu)(通过免疫组化(IHC)分析来确定)的患者有效。Her2/neu是目 前还不知其功能或生物学重要配体的受体；大约25%的转移性乳腺癌患 者过表达Her2/neu。因此远远不能满足患乳腺癌的患者的治疗需求。即 便那些从Herceptir^治疗中受益的患者仍然需要化疗，并且随后还必须至 少在一定程度上处理这类治疗的副作用。
研究结肠直肠癌的临床试验涉及同时抗糖蛋白和糖脂耙的抗体。对 腺癌具有一定特异性诸如17-1A的抗体，已经进行了超过60例患者的2 期临床试验，其中仅有1例患者有部分应答。在其他试验中，在采用另 外的环磷酰胺的实验方案的52例患者中，使用17-lA仅产生1例完全应 答和2例轻微应答。迄今为止，17-1A作为III期结肠癌辅助治疗的III 期临床试验还没有显示出改善的疗效。使用最初被批准用于成像的人源 化鼠单克隆抗体也没有使肿瘤消退。
只有到了最近，使用单克隆抗体进行的结肠直肠癌的临床试验才有 一些阳性结果。在2004年，ERBITUX⑧被批准作为表达EGFR的转移结 肠直肠癌患者的二线治疗用药，这些患者对于基于依立替康(irinotecan) 的化疗是耐受的。双臂II期临床研究和单臂研究的结果表明，ERBITUX 与依立替康联合应用分别有23%和15%的反应率，中位疾病进展时间分别是4.1和6.5月。来自同 一项双臂II期临床试验和另 一项单臂研究的结 果表明，ERBITUX⑧单独治疗的反应率分别是11%和9%,中位疾病进展 时间分别是1.5和4.2个月。
因而在瑞士和美国，￡113汀1;乂@与依立替康的联合应用，以及在美国， ERBITUX⑧的单独治疗都已经被批准作为依立替康一线治疗失败的结肠 癌患者的二线治疗。因此，与Herceptii^—样，ERBITUX⑧治疗在瑞士只 被批准作为单克隆抗体和化疗联合应用。此外，在瑞士和美国，ERBITUX 治疗只被批准作为患者的二线治疗。同样，在2004年，AVASTIN⑧被批 准与基于静脉注射5-氟尿嘧啶的化疗联合应用，作为转移性结肠直肠癌 的一线治疗。ni期临床研究结果表明，联合应用AVASTIN⑧和5-氟尿嘧 啶，与单独使用5-氟尿嘧啶相比，延长了患者的中位存活时间(分别是20 个月和16个月)。然而，还是与Herceptin⑧和ERBITUX⑧一样，AVASTIN 只被批准作为单克隆抗体与化疗联合应用。
对于肺癌、脑癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌和胃癌的治疗，疗效 仍然很差。对于非小细胞肺癌最有希望的近期结果来自II期临床试验， 其中治疗涉及偶联到细胞杀伤药物阿霉素的单克隆抗体(S GN-15; dox-BR96,抗-Sialyl-LeX)与化疗剂泰素帝(Taxotere)联用。泰素帝是唯一 经FDA批准用于肺癌二线治疗的化疗剂。原始数据显示相对于单用泰素 帝，总体存活率提高。该研究招募的62例患者中，2/3接受SGN-15与泰 素帝联合治疗，而剩余的1/3接受单独的泰素帝治疗。对于接受SGN-15 与泰素帝联合治疗的患者，中位总体存活时间为7.3个月，与之相对，接 受泰素帝单独治疗的患者为5.9个月。接受SNG-15加泰素帝治疗的患者 在1年和18个月时的总体存活率分别为29%和18%，与之相比，接受泰 素帝单独治疗的患者分别为24°/。和8%。进一步的临床试验在计划中。
临床前试验中，使用单克隆抗体治疗黑色素瘤取得了有限的成功。 这些抗体中，极少有达到临床试验期的，且至今还没有一种得到批准， 或在III期临床试验中显示出良好效果。
由于对能够明确促进疾病发生的30， 000种已知基因产物中的相关 靶点缺乏鉴定，使治疗疾病的新药的发现受阻。在胂瘤学研究中，潜在 的药物耙点仅因为其在肿瘤细胞中过表达这一事实而经常被选择。随后，这样鉴定的靶点通过与大量化合物的相互作用被筛选。就潜在抗体的治
疗而言，这些候选化合物通常由依据Kohler和Milstein提出的基本原理 (1975， Nature, 256， 495-497, Kohler and Milstein)的制备单克隆抗体的传统 方法所产生。从抗原(例如，全细胞、细胞成分、纯化的抗原)免疫过的小 鼠收集脾细胞，并与永生的杂交瘤细胞伴侣融合。基于与靶抗原密切结 合的抗体的分泌来筛选所产生的杂交瘤。包括Herceptin⑧和RITUXIMAB 在内的许多针对癌细胞的治疗和诊断的抗体已经被用这些方法制备并已 基于它们的亲和性被选择。这项策略的缺陷是双重的。首先，由于对组 织特异性的癌症过程认识的贫乏及由此产生的鉴定这些靶标的过分筒单 的方法(诸如通过过表达来筛选)，与用于治疗或诊断的抗体结合的合适靶 标的选择是有限的。其次，与受体有最大结合亲和性的药物分子通常具 有启动或抑制信号的最大可能性这一假说并不总是成立。
尽管乳癌和结肠癌的治疗取得了 一些进展，但是有效的抗体治疗的 鉴定与开发对所有类型癌症而言都是不够的，不管是作为单一试剂还是 联合治疗。
现有专利
US05296348讲述了用于选4奪特异性针对内化的癌细胞表面抗原的
的单克隆抗体的方法。通过实施例，显示ME491抗体在W9、 WM35、 WM983黑素瘤细胞和SW948结肠直肠癌细胞中内化。此外，显示了 ME491抗体降低了 SW948细胞中的转录和细胞增殖。专利申请 US20030211498A1 (及其相关申请:WO0175177A3， WO0175177A2, AU0153140A5)公开了 一种使用与卵巢肺瘤标志多肽结合的抗体来抑制 卵巢肿瘤生长或者转移的方法，所述多肽由选自包括CD63抗原的一组 的卵巢肿瘤标志基因编码。利用卵巢癌进行了基因表达系列分析，将使 CD63被识别的卵巢肿瘤标志基因作为候选基因。专利申请 WO02055551A1 (及其相关申请CN1364803A)^^开了 一种新的多肽-人 CD63抗原56.87。专利申请CN1326962A公开了 一种新的多肽-人CD63 抗原14.63。专利申请CN1326951A公开了一种新的多肽-人CD63抗原15.07。专利申请CN1351054A公开了一种新的多肽-人CD63抗原11.11。 这些专利和专利申请均鉴定了 CD63抗原和抗体，但未公开本发明分离 的单克隆抗体，或者本发明分离的单克隆抗体的应用。
编码ME491多肽抗原的基因被克隆，其序列于1988年2月24日被 接受公布(Can Res 48:2955, 1988年6月1日)；编码CD63的基因被克隆 并于1991年2月公开了其序列(JBC 266(5):3239-3245, 1991),并且所述 公开清楚表明了 ME491与CD63的同一性。
WO2004041170.89 (序列识别号89，优先权申请日2004年6月29 日),WO2003068268-A2 (序列识别号1,优先权申请日2003年2月13日 (2003WO-EP001461); 其他优先权日2002年2 月 14 日 (2002GB-00003480)), WO2003057160-A29 (序列识别号40,优先权申请 日2002年12月30日(2002WO-US041798);其他优先权日2002年1月 2曰(2002US-0345444P))都公开了与CD63具有100%序列同源性的多肽。
WO2003016475-A2 (序列识别号:9787&12101,优先权申请日2002 年8月14日(2002WO-US025765)其他优先权日2001年8月14日(2001 US-0312147P)公开了与包含CD63的238个氨基酸中的237个氨基酸具 有100%序列同源性的多肽。
WO2003070902-A2 (序列识别号:27,优先权申请日2003年2月18 曰(2003WO-US004902); 其他优先权日2002年2月 20曰 (2002US-0358279P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的224个氨基 酸具有94%序列同源性的多肽。
EP1033401-A2 (序列识别号4168&4913,优先权申请日2000年2月 21日(2000EP-00200610); 其他优先权日1999年2月 26日 (99US-0122487P))公开了分别与包含CD63的238个氨基酸中的205个氨 基酸和94个氨基酸具有100%序列同源性的多肽。
WO200257303-A2 (志贺菌属(Shigella) ospG捕获的人猎物蛋白#26， 优先权申请日2002年1月11日(2002WO-EP000777);其他优先权日 2001年1月12日(2001US-0261130P))公开了与包含CD63的238个氨基 酸中的130个氨基酸具有100。/。序列同源性的多肽。
WO200055180-A2(序列识别号756，优先权申请日2000年3月8日(2000WO-US005918)其他优先权日1999年3月12日(99US-0124270P)) 公开了与包含CD63的238个氨基酸中的127个氨基酸具有99%序列同 源性的多肽。
WO200200677-A1 (序列识别号:3203，优先权申请日2001年6月7 曰(2001WO-USO18569); 其他优先权日2000年6月 7 曰 (2000US-0209467P))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的132个氨基 酸具有97%序列同源性的多肽。
WO9966027-A1 (来自人CD63蛋白的大胞外环(Large extracellular loop)序列，优先权申请曰1999年6月15日(99WO-US013480);其他优 先权日1998年6月15日(98US-0089226P))公开了与包含CD63的238 个氨基酸中的99个氨基酸具有100%序列同源性的多肽。
WO200270539-A2 (序列识别号1207,优先权申请日2002年3月5 曰(2002WO-US005095); 其他优先权日2001 年3月 5曰 (2001US-00799451))公开了与包含CD63的238个氨基酸中的102个氨基 酸具有86%序列同源性的多肽。
EP1033401-A2(序列识别号4169，优先权申请日2000年2月21日 (2000EP-00200610);其他优先权日:1999年2月26日(99US-0122487P) 公开了与包含CD63的238个氨基酸中的74个氨基酸具有100%序列同 源性的多肽。
这些专利申请鉴定了与CD63抗原具有不同序列同源性的多肽。在 大多数情况下，这些申请还公开了相应多肽及其同系物的抗体和抗体衍 生物，但没有公开本发明分离的单克隆抗体，或本发明分离的单克隆抗 体的应用。重要的是，所有上述申请都是在编码CD63的多核苷酸序列 公开后提交的。
发明概述
本发明人此前已被授予了 "个体化患者特异性抗癌抗体，，的美国专利 6,180,357,该专利涉及选择个体化定制抗癌抗体的方法，所述抗体可用 于治疗癌性疾病。本领域公知可以改变多肽中的某些氨基酸序列而不会 对蛋白质的结构或功能产生显著的影响。在抗体的分子重排中，对骨架区的核酸或氨基酸序列的修饰通常是可以耐受的。这些修饰包括但不限 于取代(优选保守取代)、删除或添加。此外，本发明还涉及将标准的化疗
模式，例如放射性核素，与本发明的CDMAB偶联，从而使所述化疗剂 的作用集中。CDMAB还可以与毒素、细胞毒性部分、酶(例如生物素偶 联酶)或者造血细胞偶联，从而形成抗体偶联物。
本申请采用6,180,357专利中讲述的制备患者特异性抗癌抗体的方 法，以分离杂交瘤细胞系，所述细胞系编码癌性疾病调节单克隆抗体。 这些抗体可以被制备为特异性地针对一种肿瘤，由此使得癌症治疗的个 体化成为可能。在本申请公开的内容中，具有细胞杀灭(细胞毒素的)或细 胞生长抑制(细胞生长抑制的)特性的抗癌抗体将在下文中被称为细胞毒 的。这些抗体可以用于帮助癌症的分期和i貪断，也可以用于治疗肿瘤转 移。这些抗体也可以通过预防性治疗的方式用于癌症预防。与传统的药 物发现才莫式下制备的抗体不同，用本方法制备的抗体可以耙向以前没有 表明对恶性组织生长和/或存活必需的分子和途径。而且，这些抗体的结 合亲和性满足启动细胞毒性作用事件的要求，所述事件可不顺从于更强 的亲和性相互作用。
个体化抗癌治疗的前景将给患者的治疗方式带来改变。可能出现的 临床情景是在肿瘤出现时获取肿瘤样本并入库。通过该样本，从预存在 的癌性疾病调节抗体组中对肺瘤进行分型。对该患者进行常规分期，而 所提供的抗体可用于该患者的进一步分期。用现有的抗体可以直接对该 患者进行治疗，且所述肿瘤特异性的抗体组可以通过使用本文中列出的 方法来制备或通过噬菌体显示库与本文公开的筛选方法合用来制备。既 然其他肿瘤可能携带一些与被治疗肺瘤相同的抗原决定簇，所有制备的 抗体都将被加入到抗癌抗体库中。按照本方法制备的抗体可以用于治疗 许多患有与这些抗体结合的肿瘤的患者的癌性疾病。
除抗癌抗体之外，患者可以选择接受目前推荐的疗法作为多模式治 疗方案的一部分。通过本方法分离的抗体对非癌性细胞是相对无毒的事 实允许大剂量抗体组合的使用，所述组合或者单独使用，或者与常规疗 法联用。高治疗指数也允许短时程重复治疗，这将降低治疗抗性细胞出 现的可能性。如果患者的初期治疗产生耐药性或发生了转移，可以重复肿瘤特异 性抗体的制备过程进^f亍再次治疗。此外，所述抗癌抗体可以与从该患者 体内获得的红细胞偶联，重新输注到患者体内用于治疗转移肺瘤。目前 几乎没有有效的治疗转移癌的方法，而转移通常预示着导致死亡的不良 结果。然而，转移癌通常血管丰富，并且通过红细胞来递送抗癌抗体可 以具有将抗体富集在肿瘤部位的作用。即便在转移之前，大多数癌细胞 也要依赖于宿主的血供来存活，因而与红细胞偶联的抗癌抗体对原位肿 瘤同样有效。可选#^也，所述抗体可以与例如淋巴细胞、巨噬细胞、单 核细胞、自然杀伤细胞等其他血细胞偶联。
抗体有五类，每类都与其重链所赋予的功能相关。通常认为通过抗 体依赖性细胞的细胞毒性作用或补体依赖性细胞毒性作用来介导棵抗体
的癌细胞杀伤功能。例如，鼠IgM和IgG2a抗体能够通过结合补体系统 的Cl组分来活化人类补体，从而活化导致肿瘤裂解的补体活化的经典途 径。对于人类抗体，最有效的补体激活抗体通常是IgM和IgGl。鼠IgG2a 和IgG3同种型抗体可以有效地募集具有Fc受体的细胞毒细胞，所述Fc 受体会导致单核细胞、巨噬细胞、粒细胞和某些淋巴细胞的细胞杀伤作
用。人IgGl和IgG3同种型抗体介导ADCC。
抗体介导的癌症杀伤的另一个可能机制可能通过抗体的使用，所述
抗体能够催化细胞膜及其结合的糖蛋白或糖脂中的多种化学键的水解， 即所谓的催化抗体。
抗体介导的癌细胞杀伤还有三种机制。第 一种是用抗体作为疫苗以
诱导机体产生针对存在于癌细胞的推定抗原的免疫反应。第二种是用抗 体靶向生长受体，并干扰它们的功能或下调所述受体，以使受体功能有 效丧失。第三种是这类受体对细胞表面部分的直接连接(ligation)作用，这 可导致直接的细胞死亡，比如诸如TRAIL Rl或TRAIL R2的死亡受体， 或是诸如aV03及其类似物的整合素分子的连接。
癌症药物的临床应用是基于该药物在可接受的风险范围下对患者的 益处。在癌症治疗中，存活率通常是追求的最主要的益处。但是，除了 延长寿命之外，还有许多其他公认的益处。在治疗对存活率没有负面影 响的情况下，这些其他益处包括症状减轻、防止副作用、延长复发或无疾病存活时间以及延长病情进展时间。这些标准是一皮普遍接受的，且诸
如美国食品药品管理局(F.D.A.)等管理机构批准产生这些益处的药物 (Hirschfeld d a/. Critical Reviews in Oncology/Hematolgy (月中瘤学/血液学 的临床综述)42:137-143 2002)。除了这些标准之外，人们充分认识到还有 一些其他的指标可以预测这些类型的益处。在某种程度上，美国FDA准 许的快速审批程序肯定了可能预测患者受益的替代品的存在。到2003年 末，有16种药物在这种程序下得到批准，在这些药物中，有四种进入了 完全审批，即后续的研究已经显示了直接的患者受益，正如替代指标预 测的那样。确定药物对实体肺瘤疗效的一个重要的指标是通过测定对治 疗的反应来评价月中瘤负荷(Therasse & a/. Journal of the National Cancer Institute 92(3):205-216 2000)。这类评价的临床标准(RECIST criteria (RECIST标准))已经由实体肿瘤反应评价标准工作组(Response Evaluation Criteria in Solid Tumors Working Group)^^布，该工作组由国际癌症专家组 成。正如依据RECIST标准的客观反应显示的，与适当的对照组相比， 对肿瘤负荷有确切作用的药物易于最终对患者产生直接的益处。在临床 前设置中，肿瘤负荷通常能更直接地被评价和记录。因为临床前研究可 以转化成临床设置，所以在临床前模型中延长存活率的药物有最好的预 期临床效用。与临床治疗产生的积极作用相似，在临床前设置中减轻肿 瘤负荷的药物也对疾病有明显的直接影响。尽管延长生存时间是癌症药 物治疗中追求的最主要的临床结果，但仍有其他有临床作用的益处，并 且显然，降低肺瘤负荷(其与疾病进展的延迟、生存时间的延长或两者都 有关系)也能导致直接的益处，并具有临床作用(Eckhardt a/. Developmental Therapeutics: Successes and Failures of Clinical Trial Designs of Targeted Compounds (发展的治疗学靶化合物的临床试验设计的成功 与失败)；ASCO Educational Book, 39th Annual Meeting, 2003, pages 209-219)。
基本上利用US 6,180,357的方法，以及如在美国专利6,657,048和 S.N.10/348,231和S.N.60/642,057中所公开的(其中每个的内容通过引用并 入本文)，用来自患者肺(H460-22-1)或者乳腺(7BDI- 58， 7BDI-60, 7BD-33-llA和1A245.6)的肿瘤活检的细胞免疫小鼠后获得小鼠单克隆抗体7BDI-58、 7BDI-60、 H460画22-l、 1A245.6和7BD-33隱11A。 H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原在不同组织来源的广泛人细胞系的细胞表面 表达。7BDI-58和7BDI-60抗原在乳腺癌细胞的细胞表面表达。乳腺癌细 胞系MDA-MB-231 (MB-231 )和黑素瘤细胞系A2058在体外对H460-22-l
的细胞毒作用敏感。乳腺癌细胞系MCF-7和前列腺癌细胞系PC-3在体 外对1A245.6和7BD-33-11A的细胞毒作用敏感。乳腺癌细胞系Hs574.T 在体外对7BDI-58和7BDI-60的细胞毒作用敏感。
H460-22-l在体内针对乳&泉癌症的抗肺瘤活性进 一 步扩充了 H460-16-2针对培养物中乳腺癌细胞的细胞毒性结果(如S.N.l 1/321,624 所公开的)。在人乳腺癌的预防性体内模型中，在移植肿瘤细胞前l天给 予小鼠H460-22-l ，然后每周注射一次，持续7周。在治疗期间，H460-22-l 在抑制肿瘤生长方面比同种型对照抗体明显更为有效(pO.OOOl)。在治疗 期末，给予H460-22-l的小鼠的肺瘤生长的只有对照组的17.7%。在治疗 后的随访期间，H460-22-l的治疗效果仍然持续，治疗组的平均肿瘤体积 继续明显小于对照组，直至测量期结束。
使用存活率作为抗体功效的测量标准，对照组在移植后第74至81 天之间达到50%的死亡率。相反，H460-22-l治疗组在研究结束时还没有 达到50%的死亡率。H460-22-l与同种型对照治疗组之间的这种差异是显 著的(p0.0015)。这些数据表明，与对照治疗组相比，H460-22-l治疗带 来了存活益处。H460-22-l的治疗显示是安全的，因为它没有诱导包括体 重降低和临床不良应激在内的任何毒性症状。与对照治疗组相比， H460-22-l在已建立的人乳腺癌模型中延緩了肿瘤生长并提高了存活率， 因此，H460-22-l的治疗是有效的。这些结果还是可重现的，因为在另一 项该类研究中观察到类似的结果，表明了其对癌症患者治疗的关联和益 处。
除了预防性的乳腺癌体内肺瘤模型外，H460-22-l在建立的体内肺瘤 模型中显示了针对MB-231细胞的抗肿瘤活性(如在S.N.l 1/321,624中所
公开的)。在这种异种移植肿瘤模型中，MB-231乳腺癌细胞经皮下植入 免疫缺陷小鼠，以使所述肿瘤在抗体治疗前达到临界尺寸。比较了用 H460-22-l的治疗和标准的化疗药物顺铂治疗，显示顺铂和H460-22-l治疗组的平均肿瘤体积显著(pO.001)小于同种型对照抗体治疗组。
H460-22-l治疗介导了肿瘤抑制，其约为顺柏化疗介导的肿瘤抑制的2/3, 但H460-22-l治疗没有使用顺铂时观察到的显著的体重降低(pO.003)和 临床不良应激(clinical distress)。 H460-22-l的抗肺瘤活性及其极小的毒性 使其成为有吸引力的抗癌治疗剂。
在治疗后的时期，与同种型对照抗体组比较，H460-22-l通过延緩肺 瘤生长来维持对肺瘤的抑制。在治疗后31天，与同种型对照组比專支， H460-22-l通过减少42%的紳瘤生长限制了肿瘤大小，该减少可与治疗结 束时观察到48%的减少相比。在建立的乳腺癌肺瘤模型中，这些结果表 明H460-22-1在超出治疗期时仍维持对肺瘤的抑制的潜力，并且证实所 述抗体在哺乳动物中减轻肿瘤负荷和提高存活率的能力。
1 A245.6和7BD-33-l 1A针对培养物中乳腺和前列腺癌细胞的细胞毒 性的结果被通过其在体内针对这些癌症的抗肿瘤活性进一步扩展(如在 S.N. 10/348,231、 S.N. 10/891,866、 S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751所 公开的)。
7BD-33-l 1A和1A245.6在MB-231人乳腺癌预防性体内模型中防止 肿瘤生长和肿瘤负荷。治疗后300天持续监测。7BD-33-IIA从未产生肿 瘤，并且在移植后的9个月内7BD-33-11A治疗组的87.5%依然存活(一 只小鼠死于非肿瘤相关因素)。相反，同种型对照组在第72天(治疗后23 天)的死亡率为100%。 1A245.6治疗的小鼠在治疗后151天达到100%的 死亡率，这比同种型对照治疗组的时长超过6倍。因此1A245.6在乳腺 癌模型中提高存活率并阻止肿瘤生长(从而延緩疾病进展)，同时 7BD-33-llA在更大程度上提高存活率并阻止肿瘤生长。
7BD-33-l 1A和1A245.6在建立的人乳腺癌体内模型中还显著地抑制 肿瘤生长并减轻肿瘤负荷。到第80天(治疗后23天)，7BD-33-11A治疗 的小鼠的平均肺瘤体积比同种型对照组低83%(p=0.001)。在该天， 1A245.6的治疗减少了 35%的平均肿瘤体积，但是，所述减少在该实验中 没有达到显著性(pi.135)。
使用存活率作为抗体功效的测量标准，估计在治疗后大约60天， 7BD-33-11A治疗组中的死亡风险为同种型对照组的约16% (p=0.0006)。同种型对照组在治疗后50天100%死亡。相比之下，1A245.6治疗的小鼠 存活至治疗后100天，7BD-33-llA治疗组的60%在治疗后130天仍然存 活。这些凄t据表明，与对照治疗组相比，1A245.6和7BD-33-11A治疗均 带来存活益处并减轻肺瘤负荷。
7BD-33-llA和1A245.6的治疗显示是安全的，因为其没有诱导包括 体重减轻或者临床不良应激在内的任何毒性症状。与对照治疗组相比， 7BD-33-l 1A和1A245.6治疗在建立的人乳腺癌模型中延緩肿瘤生长并提 高存活率，因此，7BD-33-llA和1A245.6治疗是有效的。
在S.N.10/810,751公开的研究(其内容在此引入作为参考)中，在两种 不同的已建立的乳腺癌异种移植模型中确定了 7BD-33-llA的作用，所述 作用被与单独的化疗药物(顺柏)治疗相比或同7BD-33-11A与化疗药物 (顺铂)联用相比。
在MB-231模型中，第83天(治疗后20天)，与緩冲液对照治疗动物 相比，7BD-33-llA治疗导致肺瘤生长降低83。/。(p二0.002)。与对照比较， 单独的顺铂治疗导致肺瘤体积减小77%，而顺铂与7BD-33-llA联用导致 肿瘤体积减小88% (p=0.006)。
在MDA-MB-468 (MB-468)模型中，第62天(治疗后12天)，观察到 与7BD-33-11A联用的顺铂治疗导致了最大程度的肿瘤生长减少(97%, p=0.001)。与緩冲液对照比4交，单独的顺铂治疗产生95%的肿瘤生长减少， 而单独的7BD-33-11A治疗显示37%的减少^=0.046)。
在MB-231和MB-468模型中，以体重为量度，与顺铂治疗相比， 7BD-33-llA治疗导致更好的动物健康状况。这些结果表明，与单独的顺 铂治疗相比，7BD-33-llA治疗在MB-231模型中具有更好的效果，并且 在两种乳腺癌模型中比顺铂能更好的被耐受，具有较少的诸如体重减轻 的副作用。
为了确定7BD-33-11A治疗在各种剂量下的作用，在预防性乳腺癌异 种移植模型中进行了剂量反应实验(如在S.N. 10/810,751中所公开的)。在 第55天(治疗后5天)，相对于同种型对照治疗组，0.2mg/kg的治疗组使 肺瘤生长减少了85。/。。还是在第55天，2mg/kg和20mg/kg的治疗组均 没有发生肿瘤。在第25天(治疗后75天)获得了类似的结果，其中20mg/kg治疗组依然没有发生肿瘤 > 而2 mg/kg治疗组具有一些初期的胂瘤 生长。7BD-33-llA的治疗也显示出存活益处。同种型对照组的所有小鼠 到第104天(治疗后54天)均死亡，而0.2mg/kg7BD-33-llA治疗组存活 至第197天(治疗后147天)。在使用2.0和20 mg/kg 7BD-33-11A的治疗 组观察到了更大的存活益处；到第290天(治疗后240天)，2.0 mg/kg治 疗组只有50%死亡，而20 mg/kg治疗组到第290天还没有出现死亡。因 此，全部三种剂量的7BD-33-11A治疗显示出显著的胂瘤生长抑制和增加 的存活率，且最高剂量表现出最高程度的功效。
除了在建立的乳腺癌体内肺瘤^t型中的有益效果，7BD-33-11A和 1A245.6治疗在预防性体内前列腺癌模型中也具有针对PC-3细胞的抗肿 瘤活性(如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中所公开，其各自内容 在此引入作为参考)。在治疗期后不久，7BD-33-llA和1A245.6治疗比同 种型对照抗体更有效抑制肺瘤生长(p值分别为0.001和0.017)。在治疗期 末，给予7BD-33-llA或者1A245.6的小鼠的肺瘤生长分别为同种型对照 组的仅31%和50%。
对于PC-3 SCID异种移植模型，体重可以用作疾病进展的替代指标。 第52天，与同种型对照相比，7BD-33-11A和1A245.6治疗分别显著(p 分别为0.002和0.004)阻止了 54%和25。/。的体重减轻。监测治疗后小鼠的 存活。治疗后第11天，同种型和緩沖液对照小鼠达到100%的死亡率。 相反，7BD-33-llA和1A245.6在治疗后38天达到100%的死亡率，时间 比对照组长3倍多。因而，由于7BD-33-11A和1A245.6的治疗与同种型 对照治疗组相比，在已建立的人前列腺癌模型中延緩肿瘤生长、防止体 重减轻并延长存活时间，7BD-33-l 1A和1 A245.6的治疗是有效的。
除了预防性的前列腺癌体内肺瘤模型，7BD-33-l 1A在建立的体内肺 瘤模型中显示了针对PC-3细胞的抗肿瘤活性(如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中所公开的，所述专利的每一个的内容在此引入作为参考)。 7BD-33-11A治疗再次与同种型对照进行比较。显示就在治疗后， 7BD-33-11A治疗组的平均肿瘤体积显著(p<0.024)小于同种型对照治疗 组。与同种型对照组相比，7BD-33-11A的治疗介导了 36%的肿瘤抑制。
除了在乳腺癌和前列腺癌的体内肺瘤模型中的有益作用，7BD-33-11A治疗在预防性体内胰腺癌模型中也具有针对BxPC-3细胞的 抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所^>开的)。在治疗期后不久， 7BD-33-llA治疗比緩冲液对照更有效地抑制肺瘤生长(71。/。， p=0.0009)。 此外，与緩冲液对照治疗组相比，7BD-33-llA治疗带来了存活益处。在 7BD-33-llA治疗组中，40%的小鼠在緩冲液对照组小鼠全部死亡后2周 依然存活。
除了在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌体内肺瘤;^莫型中的有益作用， 7BD-33-11A治疗在两个独立的预防性体内黑素瘤模型中也具有针对 A2058和A375细胞的抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所公开的)。在 A2058和A375模型中，7BD-33-l 1A治疗比緩沖液对照更有效地抑制肺 瘤生长(分别为72%, p=0.011和63%, p=0.0006)。 7BD-33-l 1A在黑素瘤以 及乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌模型中的抗肿瘤活性使其成为有吸引力的 4元癌症治疗剂。
除了在人黑素瘤预防性体内模型中显示的有益作用，7BD-33-11A治 疗在两个独立的建立的体内黑素瘤模型中也具有针对A2058和A375细 胞的抗肺瘤活性(如在S.N. 11/321,624中所公开的那样)。在分别针对 A2058和A375模型的7BD-33-11A治疗和7BD-33-l 1A加氮烯唑胺治疗 组中，肿瘤生长均被显著抑制。在A2058模型中，平均肿瘤体积是对照 组测量的30.87。/Q(p0.443)。在A375模型中，7BD-33-l 1A/氮烯唑胺联合 治疗组导致39.1天的中位TTE(time-to-endpoint,到终点的时间)，相当于 肿瘤生长147。/。的显著延緩(p0.01)。在任一种模型中均未观察到毒性死 亡。因此，看来在乳腺以及目前黑素瘤的建立的人类癌症体内^^莫型中 7BD-33-11A的治疗是安全的并显示出功效。
为了确定7BD-33-11A在体内表现的功效是否全部或者部分归因于 ADCC活性，在NOD SCID和SCID小鼠建立的肿瘤模型中检测了 7BD-33-llA针对MB-231细胞的抗肺瘤活性。NOD SCID小鼠的天然杀 伤(NK)细胞具有功能缺陷，并且缺乏循环补体和功能上未成熟的巨噬细 胞群，而SCID小鼠同时具有补体和强有力的NK细胞活性。7BD-33-11A 是小鼠IgG2a单克隆抗体，因此在体内具有ADCC活性。将7BD-33-llA 的抗肿瘤活性与緩冲液对照和H460-22-l(基于其同种型，不应该通过ADCC显示其活性的小鼠IgGl单克隆抗体)进行比较。第54天(末次治疗 后4天)，在SCID治疗组中，7BD-33-llA和H460-22-l治疗小鼠发生的 肿瘤的体积分别仅为缓冲液对照治疗小鼠的平均肿瘤体积的1.9 %和 3.6%。相反，在NODSCID治疗组中，同样在第54天(末次治疗后4天)， 7BD-33-11A治疗小鼠的肿瘤生长是緩沖液对照治疗小鼠的平均肿瘤体 积的67%。 H460-22-l治疗小鼠表现出与SCID小鼠类似的效果；月中瘤生 长为缓沖液对照治疗小鼠的平均肿瘤体积的1.4%。因此，看起来 7BD-33-l 1A的体内活性部分归因于ADCC活性，而H460-22-l的抗肿瘤 作用不依赖于ADCC。
为了验证H460-22-l 、 1A245.6和7BD-33-l 1A表位作为药物耙点的 有效性，测定了它们的靶抗原在正常人组织中的表达。如在S.N. 10/603,006和S.N. 10/810,751中部分公开的(其中每个的内容通过引用并 入本文)，确定了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6对正常人组织的结 合。通过IHC染色，大部分组织未能表达7BD-33-11A抗原，包括例如 肾、心脏和肺的重要的器官。7BD-33-llA使唾液腺、肝、胰腺、胃、前 列腺和十二指肠染色，并使扁桃体强染色。组织染色的结果表明 7BD-33-11A显示了对多种细胞类型的受限制的结合，但具有对侵润性巨 噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的结合。对于H460-22-l和1A245.6，更 广泛的组织呈现阳性染色。对于大多数情况，染色局限于上皮或者侵润 性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞。但是，在心肌和肝细胞上均观察 到阳性染色。7BD-33陽11A、 H460-22-l和1A245.6均显示了膜和细胞质 的染色模式。
如在S.N. 10/810,751中所公开的(其内容在此引入作为参考),将 7BD-33-l 1A与商品化供应的抗CD63抗体(RFAC4和H5C6)进行了比较。 正常人组织染色的结果表明，7BD-33-llA再次显示出对多种细胞类型的 受限制的结合，但具有对侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞的结 合。相互比较，RFAC4和H5C6抗体显示了类似的染色模式。但是，RFAC4 和H5C6的染色模式非常不同于使用7BD-33-llA观察到的模式。具体来 说，RFAC4和H5C6抗体与更广泛的正常组织结合，通常在7BD-33-l 1A 也是阳性的组织中具有较高的染色强度，并且不仅结合于侵润性巨噬细胞、淋巴细胞和成纤维细胞，还结合于大部分组织的上皮细胞。
H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原的定位以及其在诸如乳膽— 癌患者的人群中的普遍性的测定在评价这些抗体的治疗用途以及设计有 效的临床实验中非常重要。为了描述H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-llA 抗原在癌症患者乳腺肿瘤中的表达，筛检了来自98例个体乳腺癌患者的 肿瘤组织样本的7BD-33-llA抗原表达(来自50例患者的结果之前已经在 S.N.10/603，006和S.N. 10/810,751中进行了描述，所述专利每一个的内容 在此引入作为参考)，并且筛检了来自50例患者的肺瘤组织样本的 1A245.6 (如在S.N.10/603,006中所公开的，其内容在此引入作为参考)和 H460-22-l抗原表达(如在S.N.l 1/321,624中所7>开的，其内容在此引入作 为参考)。
这些研究的结果显示，37%的组织样本对7BD-33-llA抗原的染色呈 阳性。患者样本中7BD-33-llA的表达显示对癌细胞的特异性，因为其染 色局限于恶性细胞。此外，7BD-33-11A使来自乳腺癌患者的20个正常 组织样本中的0个染色。另一方面，H460-22-l和1A245.6分别使92%和 98%的乳腺癌组织样本染色。H460-22-l和1A245.6还使来自乳腺癌患者 的IO个正常组织样本中的9个染色。但是，这种染色通常比使用乳腺癌 组织样本观察到的染色弱得多，并且一般限于侵润性成纤维细胞。 7BD-33-llA、 H460-22-l和1 A245.6抗原的乳腺肺瘤表达看起来定位于 恶性细胞的细胞膜和细胞质，这使CD63成为有吸引力的治疗耙标。
如在S.N. 10/810,751中所公开的(其内容在此引入作为参考)，将 7BD-33-l 1A与RFAC4和H5C6以及抗Her2抗体(c-erbB-2)进行了比较。 本研究的结果与先前的结果类似，显示36%的肺瘤组织样品对 7BD-33-11A抗原的染色呈阳性，而94%和85%的乳腺肺瘤组织分别对 H5C6和RFAC4表位的染色呈阳性。患者样本中7BD-33-11A的表达显 示出对癌细胞的特异性，因为其染色局限于恶性细胞。此外，7BD-33-11A 使来自乳腺癌患者的10个正常组织样品中的0个染色，而H5C6和RFAC4 使8个正常乳腺组织样品中的7个染色。与c-erbB-2相比，7BD-33-11A 显示了完全不同的染色模式，其中半数的7BD-33-11A抗原表达呈阳性的 乳腺肿瘤组织样本的Her2表达呈阴性，表明7BD-33-l 1A靶向不能用现 33有抗体疗法治疗的患者群。在对7BD-33-11A和Her2染色都呈阳性的乳 腺肺瘤组织切片之间也存在染色强度的差异。c-erbB-2抗体还使一个正常 乳腺组织切片阳性染色。
如在S.N.10/603,006、S.N.10/810,751和S.N.11/321,624中所公开的(所 述专利的每一个的内容在此引入作为参考)，基于乳腺肺瘤表达的雌激素 和黄体酮的受体，进一步评价了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的 表达，所述雌激素和黄体酮的受体在乳腺胂瘤的发展、治疗和预后中起 重要作用。1A245.6抗原的表达与雌激素或黄体酮的受体的表达之间没有 明显的相关性。在缺乏雌激素受体并存在黄体酮受体与7BD-33-llA抗原 表达之间以及在同时存在雌激素和孕激素受体与H460-22-l抗原表达之 间存在轻度相关性。当基于癌症进展的阶段或者程度来分析肺瘤时，对 于7BD-33-llA和H460-22-l而言，结果均显示，较高的胂瘤阶段具有较 高阳性表达的趋势。使用RFAC4获得了类似的结果。H5C6也显示出与 雌激素或者黄体酮受体表达有非常轻微的相关性，但与肝瘤阶段没有明 显的相关性，然而，该结论受小样本规模的限制。
7BD-33-11A抗原的定位及其在前列腺癌患者中的流行在评价 7BD-33-11A免疫治疗对前列腺癌患者的益处和设计有效临床试验中是 非常重要的。为了描述7BD-33-11A抗原在癌症患者前列腺肿瘤中的表 达，筛才企了来自51例个体前列腺癌患者的肿瘤组织样本的7BD-33-11A 抗原表达(如在S.N. 10/810,751中所公开的，其内容在此引入作为参考)。 该研究的结果显示，88%的组织样本的7BD-33-llA抗原的染色呈阳性。 尽管7BD-33-llA也使正常组织切片高强度染色，但在胂瘤组织样本中与 正常样本相比存在更高程度的膜染色。有一个胚胎性横紋肌肉瘤组织样
本没有7BD-33-11A抗原的染色。在测试的小样本规模中，肺瘤阶段和 7BD-33-llA抗原的存在之间看起来没有直接的相关性。
7BD-33-11A抗原的定位及其在黑素瘤患者中的流行在评价 7BD-33-11A免疫治疗对黑素瘤患者的益处中以及在设计有效临床试验 中是非常重要的。为了描述7BD-33-11A抗原在癌症患者黑素瘤中的表 达，筛冲全了来自39例个体黑素瘤患者的胂瘤组织样本的7BD-33-UA抗 原的表达(如在S.N. 11/321,624中所公开的)。该研究的结果显示,90%的组织样本的7BD-33-11A抗原染色呈阳性。在该小样本中，肺瘤阶段和
7BD-33-llA抗原的存在之间看起来也没有直接的相关性。
为了进一步扩展7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的潜在治疗益
处，还测定了所述抗原在多种人类癌组织中出现的次数以及定位(如在
S.N.10/603，006、 S.N.10/810,751和S.N.11/321,624中所公开的，所述专利 的每一个的内容在此引入作为参考)。除了乳腺癌和前列腺癌，还有数种
癌症类型表达7BD-33-11A抗原。呈现阳性的人类癌症类型包括皮肤 (1/2)、肺(3/4)、肝(2/3)、胃(4/5)、曱状&泉(2/2)、子宫(4/4)和肾(3/3)。 一些 癌症不表达所述抗原，这些包括卵巢(0/3)、睾丸(0/1)、脑(0/2)和淋巴结 (0/2)。对于H460-22-l和1A245.6,如用正常人组织阵列一样，来自多种 人组织类型的许多肿瘤呈现阳性染色。在皮肤、肺、肝、子宫、肾、胃 和膀胱的恶性细胞中观察到较深的染色。与在人乳腺癌、前列腺癌和黑 素瘤组织中的定位一样，7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的定位同 时存在于这些肿瘤细胞的膜和细胞质内。因此，除了 H460-22-l、 1A245.6 和7BD-33-llA抗体在体外结合癌细胞系夕卜，还有证据表明所述抗原在人 类和多种类型癌症中表达。
如在S.N. 10/810,75 l(其内容在此引入作为参考)中对7BD-33-11A的 描述，以及如在S.N.l 1/321,624中对lA245.6和H460-22-l的描述，生化 数据也表明H460-22-l、 1 A245.6和7BD-33-l 1A识别的抗原就是CD63。 这也得到了研究支持，所述研究表明针对CD63有反应性的单克隆抗体 RFAC4识别通过免测沉淀结合至7BD-33-llA、 H460-22-l或1A245.6的 蛋白。此外，细菌表达研究表明，H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A 与CD63的胞外环2结合。还通过构象依赖性区分了 7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的表位。这些IHC和生化结果证明，H460-22-1、 1A245.6和7BD-33-11A结合CD63抗原。因此，此优势证据表明， H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A通过CD63上存在的独特构象表位的 连接来介导抗癌作用。为了本发明的目的，所述表位被定义为"CD63抗 原部分"，其特征在于具有与由杂交瘤细胞系7BD-33-llA、 1A245.6、 H460-22-1编码的单克隆抗体、其抗原结合片段或者其抗体偶联物相结合 的能力。总体上，该数据表明H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗原是癌 症相关抗原，并且在人类中表达，是病理相关的癌症靶标。此外，该数 据还i正实了 H460-22-l、 1A245.6和7BD-33-11A抗体与人类癌症组织的 结合，并可以适用于可以是诊断、治疗预测或者预后的分析。另外，因 为该抗原在多数非恶性细胞中的表达相对很少发生，该抗原的细胞膜定 位指示了细胞的癌性状态，该发现允许该抗原、其基因或者衍生物、其 蛋白或者其变体用于可以是诊断、治疗预测或者预后的分析。
本发明描述了 H460-22-l、 7BD-33-llA和1A245.6的开发和用途，
通过美国专利6,180,357中描述的方法来开发，并通过其在细胞毒性分析、 在动物模型中未建立和建立的肿瘤生长以及在延长癌性疾病患者存活时
间中的作用来进行鉴定。此外，本发明公开了 7BD-33-11A两种人源化形 式的开发，其中一种在预防性动物模型中显示相似的细胞毒性。本发明 还公开了小鼠单克隆抗体AR51A994.1、 7BDI-58和7BDI-60的开发和用途。
本发明代表了癌症治疗领域的进展，因为它描述了与靶分子CD63 上存在的一个或者多个表位特异结合的试剂，所述试剂还具有针对恶性 肿瘤细胞而不是正常细胞的体外细胞毒特性，其在人类癌症的体内模型 中还直接介导肿瘤生长的抑制和存活的延长。既然任何其他先前描述的 抗CD63抗体没有一种显示具有相似的性质，这是相对于任何其他先前 描述的抗CD63抗体的进展。它也提供了本领域内的进展，因为其首次 清楚证明了 CD63直接参与某些类型肿瘤的生长和发展相关的事件。它 也代表了癌症治疗的进展，因为其能够在人类患者中展示类似的抗癌特 性。另一个进展是将这些抗体包含在抗癌症抗体文库中，通过确定不同 抗癌抗体的合适组合会提高靶向表达不同抗原标志物的肿瘤的可能性， 以实现最有效的靶向和抑制所述肿瘤的生长和进展。
总而言之，本发明讲述了 7BD-33-llA抗原作为治疗剂靶标的用途， 给予所述治疗剂时能够降低哺乳动物中表达该抗原的癌症的肿瘤负荷， 还能够使被治疗的哺乳动物的存活延长。因此，本发明的目的是利用制 备抗来源于特定个体的癌细胞、或者一种或多种特定癌细胞系的癌性疾 病调节抗体(CDMAB)的方法，以分离杂交瘤细胞系和该杂交瘤细胞系编码的相应的分离的单克隆抗体及其抗原结合片段。所述CDMAB对癌细 胞有细胞毒性作用，而同时对非癌细胞相对无毒。
本发明的另外目的是讲述癌性疾病调节抗体，其配体和其抗原结合 分段。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过抗体 依赖的细胞毒性介导。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性通过补体 依赖的细胞毒性介导。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体，其细胞毒性是它们催 化细胞化学键水解的能力的功能。
本发明的另外目的是产生癌性疾病调节抗体和配体，其可用于癌症 诊断、预测和监测的结合分析。
通过本发明下述的说明、举例和一些实施方案的描述，本发明其他 的目的和优点将变得显而易见。
附图简述


图1比较了杂交瘤上清针对细胞系OCC-l、 OVAR-3和CCD-27sk 的细胞毒性百分比和结合水平。
图2是细胞毒性分析中AR51A994.1与阳性对照和阴性对照的比较。
图3表示AR51A994.1和抗EGFR对照与癌症和正常细胞系的结合。 数据制成表格，以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。
图4包括针对数种癌细胞和非癌细胞系的AR51A994.1和抗EGFR 抗体的代表性FACS直方图。
图5是细胞毒性分析中7BDI-58和7BDI-60与阳性对照和阴性对照 的比專支。
图6表示7BDI-58、 7BDI-60和抗Her2对照与癌细胞和正常细胞系 的结合。数据制成表格，以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。
图7包括针对数种癌细胞和非癌细胞系的7BDI-58、 7BDI-60和抗 Her2抗体的^表性FACS直方图。
图8显示7BDI-58在预防性MDA-MB-231乳腺癌模型中对肺瘤生长的影响。垂直虚线表示给予抗体的时期。数据点表示平均值+ASEM(均数 的标准误)。
图9显示7BDI-58在预防性MDA-MB-231乳l^癌才莫型中对体重的影 响。数据点表示平均值+ASEM。
图10.获自MDA-MB-231细胞的全细胞膜部分的样本(泳道l)以及 获自PC-3(泳道2)和CCD-27sk(泳道3)细胞系的全细胞裂解产物的样本的 Western印迹。用如上所述的7BDI-58 、 7BDI-60 、 AR51A994.1 、 7BD-33-l 1A、 1A245.6和H460-22-l作为探针检测印迹。
图11.通过MDA-MB-231细胞系的全细胞膜部分与7BD-33-llA的 免疫沉淀制备的免疫复合物。印迹的各条泳道分别用7BDI-58(泳道1)、 AR51A994.1(泳道2)、 7BD-33-l 1A(泳道3)以及同种型对照抗体(泳道4 和5)作为探针来检测。
图12.通过ASPC-1人胰腺癌细胞系的全细胞膜部分与1A245.6的免 疫沉淀制备的免疫复合物。印迹的重复泳道分别用7BDI-60(泳道1)、 1A245.6 (泳道2)、抗CD63克隆H5C6 (泳道3)以及用同种型对照抗体(泳 道4和5)作为探针来纟企测。
图13.人重组融合构建体GST-EC2(CD63)的Western印迹。印迹的 各条泳道分别用7BDI-58(泳道1)、 7BDI-60 (泳道2)、 AR51A994.1 (泳道 3)、 7BD-33-11A (泳道4)、 H460-22-l (泳道5)、 1A245.6 (泳道6)以及用 阴性对照H460-22-l (抗CD44;泳道7)和同种型对照抗体(泳道8和9)作 为探针来检测。
图14是7BD-33-llA在人胰腺肺瘤和正常组织微阵列中结合的汇总。 图15.代表性显^:图，显示了在人组织^:阵列中用7BD-33-llA(A) 或同种型对照抗体(B)在胰腺肿瘤组织上获得的的结合模式以及用 7BD-33-11A (C)或同种型对照抗体(D)在非肿瘤胰腺组织上获得的结合模 式。7BD-33-llA对肺瘤细胞显示强阳性染色，而对正常组织显示弱-中等 染色。放大倍数是200x。
图16.由7BD-33-11A引发的小鼠效应细胞抗人乳腺癌细胞的体外 细胞毒活性。在不同浓度7BD-33-llA或同种型对照存在的条件下，5lCr 标记的MDA-MB-231细胞与非粘附(a)和粘附(b)的小鼠脾效应细胞孵育。图17.在用7BD-33-llA或者緩冲液对照实施多种给药方案后，来自 MDA-MB-231异种移植物的巨噬细胞数目的汇总。 图18. 7BD-33-llA抗体N端氨基酸的序列。
图19. 7BD-33-llA抗体轻链可变区的cDNA序列(SEQ ID NO:l)。核 苷酸序列下面显示的是推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)。信号肽序列 以斜体表示。CDRs(Kabat命名法)以下划线表示。成熟的轻链起始于天门 冬酰胺残基(粗体和双下划线)。
图20. 7BD-33-llA抗体重链可变区的cDNA序列(SEQ ID NO:3)。核 苷酸序列下面显示的是推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。信号肽序列 以斜体表示。CDRs(Kabat命名法)以下划线表示。成熟的重链起始于谷氨 酸残基(粗体和双下划线)。
图21. VL区域氨基酸序列的比对(alignment)。7BD-33-llA(Mu33-llA) 和(hu)AR7BD-33-11A (Hu33-11A)的VL区域以及人受体1LVE和JK2的 氨基酸序列以单字母代码表示。在7BD-33-llA VL序列中以下划线表示 CDR序列(Kabat命名法)。图中略去了人VL片段中的CDR序列。 (hu)AR7BD-33-llA VL序列中单下划线的氨基酸被预测与CDR序列接 触，因此用相应的小鼠残基取代。从顶部开始读起，公开的序列是SEQ ID NO:2的氨基酸残基21-50; SEQ ID NO:6的氨基酸残基22-52; SEQ ID NO:62; SEQ ID NO:2的氨基酸残基51-80; SEQ ID NO:6的氨基酸残基 53-82; SEQ ID NO:6的氨基酸残基63-77; SEQ ID NO:2的氨基酸残基 81-110; SEQIDNO:6的氨基酸残基83-112; SEQ ID NO:6的氨基酸残基 85-112; SEQ ID NO:2的氨基酸残基111-132; SEQ ID NO:6的氨基酸残 基113-134; SEQIDNO:6的氨基酸残基113-116和SEQ ID NO:6的氨基 酸残基125-134。
图22. VH区域氨基酸序列的比对。7BD-33-11A (Mu33-11A)、 (hu)AR7BD-33-l 1A (Hu33-11A)、 (hu)AR7BD-33-l 1A(V1 IL)的VH区域以 及人类受体AAR32409和JH6的氨基酸序列以单字母代码表示。在 7BD-33-11A VH序列中以下划线表示CDR序列(Kabat命名法)。图中略去 了人 VH 片段中的 CDR 序歹'j 。 (hu)AR7BD-33-llA 和 (hu)AR7BD-33-11 A(Vl 1L) Vh序列中单下划线的氨基酸被预测与CDR序列接触，因此用相应的小鼠残基取代。双下划线的氨基酸已经用共有的 人残基取代以减少潜在的免疫原性。从顶部开始读起公开的序列是SEQ
ID NO:4的氨基酸残基20-49; SEQ ID NO:8的氨基酸残基20-49; SEQ ID NO: 12的氨基酸残基20-49; SEQ ID NO:63; SEQ ID NO:4的氨基酸残 基50-79; SEQ ID NO:8的氨基酸残基50-79; SEQ ID NO: 12的氨基酸残 基50-79; SEQ ID NO:64; SEQ ID NO:4的氨基酸残基80-109; SEQ ID NO:8的氨基酸残基80-109; SEQ ID NO: 12的氨基酸残基80-109; SEQ ID NO:65; SEQ ID NO:4的氨基酸残基110-138; SEQ ID NO:8的氨基酸残 基110-138; SEQ ID NO: 12的氨基酸残基110-138; SEQIDNO:66以及 SEQ IDNOS:8和12的氨基酸残基128-138。
图23.小外显子(mini exon)中(hu)AR7BD-33-l 1A的轻链可变区的核 苷酸序列(SEQ ID NO:5)和推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO:6)>信号肽序 列以斜体表示。CDRs(Kabat命名法)以下划线表示。成熟的轻链起始于天 冬氨酸残基(粗体和双下划线)。该序列侧翼为独特的Mlul (ACGCGT)和 Xbal (TCTAGA)位点。
图24.小外显子中(hu)AR7BD-33-llA(VllL)的重链可变区的核苦酸 序列(SEQ ID NO:7)和推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO:8)。信号肽序列以 斜体表示。CDRs(Kabat命名法)以下划线表示。成熟的重链起始于谷氨酸 残基(粗体和双下划线)。显示的序列侧翼为独特的Mlul (ACGCGT)和 Xbal (TCTAGA)位点。
图25.用于7BD-33-11A Vl基因枸建的引物。从顶部读起，公开的 序列是SEQ ID NOS:21-39。
图26.用于7BD-33-llA Vh基因枸建的引物。从顶部读起，公开的 序列是SEQ ID NOS :40-61 。
图27. (hu)AR7BD-33-llA Vl或者VH小外显子的合成图解。使用一 系列的20(对于VO或22(对于VH;如图所示)个重叠寡核苷酸。将寡核苷 酸l-20(对于Vl)或者l-22(对于Vh)退火并利用Pfu Turbo聚合酶将其延 伸。利用5'和3'侧翼寡核苷酸扩增获得的组装双链V基因以产生V^和 VH基因片段，将所述片段利用凝胶纯化，用Mlul和Xbal消化，并分别 亚克隆入pVk和pVgl.D.Tt或pVg2M3.D.T载体。图28. FACS竟争实验的汇总。
图29.通过定点诱变产生单个氨基酸取代的VH突变体的图解。进行 两轮独立的PCR。在第一轮PCR中，扩增两个部分的Vh基因片段。这 两个片段在第二轮PCR中进一步共同扩增，以产生具有单个氨基酸取代 的全长Vh基因片^:。利用侧翼的Mlul和Xbal位点，带有所需突变的 Vh基因被巫克隆入pVgl.D.Tt和pVg2M3.D.T。
图30.用于(hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗体表达的质粒构建体。V^和 VH基因被构建为侧翼是Mlul和Xbal位点的小外显子。V区域被整合入 相应的表达载体。
图31. (hu)AR7BD-33-llA /c轻链cDNA (SEQ ID NO:9)和翻译的氨 基酸序列(SEQIDNO: 10)。所述氨基酸以单字母代码表示；点(.)表示翻 译终止密码子。成熟轻链的第一个氨基酸以双下划线和粗体表示，位于 其信号肽序列之前。
图32. (hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L) 7l重链cDNA (SEQ ID NO:l l)和翻 译的氨基酸序列(SEQ IDNO: 12)。所述氨基酸以单字母代码表示；点(*)
表示翻译终止密码子。成熟重链的第 一个氨基酸以双下划线和粗体表示， 位于其信号肽序列之前。
图33. (hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L)下2M3重链cDNA (SEQ ID NO: 13) 和翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO: 14)。所述氨基酸以单字母代码表示； 点(')表示翻译终止密码子。成熟重链的第一个氨基酸以双下划线和粗体 表示，位于其信号肽序列之前。
图 34.在如本文所述的非还原和还原性条件下，进行 7BD-33-llA(Mu33-llA) 、 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)和 (hu) AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3 (VI 1L)的SDS-PAGE分析
图 35.利用体积排阻色镨法(Size exclusion HPLC)对(A) (hu)AR7BD-33画llA-IgGl(VllL)和(B) (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3 (V11L) 进行的HPLC分析。
图36. FACS竟争实验的汇总。
图 37. FACS 竟争， 以比较 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-11A-IgGl(Vl 1L)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)与人CD63的相对结合亲和力。如本文所述，在不同量的竟争剂 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33画llA-IgGl(VllL) 或
(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3(Vl 1L)存在的条件下，对FITC标记的 7BD-33-l 1A与人CD63+ PC-3细胞的结合进行分析。
图38显示在人黑素瘤的小鼠模型中，7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3的治疗对肿瘤生 长的影响。肿瘤体积表示为组平均值士SEM。垂直虚线表示给药的第一天 和最后一天。
图39显示研究期间单克隆抗体治疗对体重的影响。体重表示为组平 均值士SEM。
图40.抗CD63的7BD-33-llA、 H460國22-l、 1A245.6的结合亲和力 以及人源化抗体(hu)AR7BD-lllA-IgGl和(hu)AR7BD-l 1A-IgG2M3的结
合亲禾口力。通过表面等离子体共寺展(surface plasmon resonance)来观'J定,斤述 抗体与纯化的重组GST融合构建蛋白GST-EC2(CD63)结合的解离常数。
发明详述
下面用于概述、描述、实施例和权利要求书中的字词或短语通常都 有其指定的含义。
术语"抗体"使用其最广泛的涵义，且特别包括，例如单克隆抗体(包 括激动剂、拮抗剂和中和抗体，脱免疫的、鼠科的、嵌合的或人源化的 抗体)、携带有多表位特异性的抗体组合物、单链抗体、抗体的免疫偶联 物和抗体片,爻(见下文)。
本文使用的术语"单克隆抗体"指从一群基本上同质的抗体中获得的 抗体，也就是说，包括这群抗体的单个抗体是相同的，除了可以少量存 在的可能自然发生的变异。单克隆抗体针对单一抗原部位是高度特异性 的。而且，与包含针对不同决定基(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相 比，每一种单克隆抗体针对抗原上的单一的决定基。除了特异性之外， 单克隆抗体的优势还在于其合成可以不受其他抗体的污染。修饰语"单克 隆的"指从基本同质的抗体群中获得的抗体的特征，而不能解释为需要通 过任何特定方法来产生该抗体。例如，本文使用的单克隆抗体可以通过由Kohler d a/.， Atowm, 256:495 (1975)首次描述的杂交瘤(鼠或人)方法制 备或由重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利第4,816,567号)。"单 克隆抗体"也可以从噬菌体抗体文库中分离，使用的技术在例如Clackson d a/" A^w", 352:624- 628 (1991)和 Marks & a/.， Afo/. 5/o/， 222:581-597 (1991)中描述过。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区域或其 可变区。抗体片段的实例包括非全长的抗体、Fab、 Fab'、 F(ab')2和Fv 片段；双体(diabodies);线形抗体；单链抗体分子；单链抗体，单结构域 抗体分子，融合蛋白，重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
"完整"抗体指不但包含轻链恒定结构域(QJ和重链恒定结构域CH1 、 CH2、 CH3,还包含结合抗原的可变区的抗体。恒定结构域可以是天然序 列的恒定结构域(例如，人天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列的变体。 优选地，完整抗体有一个或多个效应功能。
依据完整抗体的重链恒定结构域的氨基酸序列，完整抗体可以分为 不同的"种类"。主要有五类完整的抗体IgA、 IgD、 IgE、 IgG和IgM, 其中几种可进一步分成"亚类"(同种型)，例如，IgGl、 IgG2、 IgG3、 IgG4、 IgA和IgA2。与不同种类抗体对应的重l^恒定区分别^皮称为o; S， e, 7和M。 不同种类的免疫球蛋白的亚单位结构和三维空间结构是公知的。
抗体"效应器功能"指那些由抗体Fc区引起的(天然序列的Fc区或氨 基酸序列变体的Fc区)的生物活性。抗体效应器功能的实例包括Clq结 合；补体依赖的细胞毒性作用；Fc受体结合；抗体依赖的细胞介导的细 胞毒性作用(ADCC);吞噬作用；细胞表面受体的下调(例如B细胞受体； BCR)等。
"抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用"和"ADCC"指细胞介导的反 应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性的细胞毒细胞(例如天然杀伤(NK) 细胞，中性粒细胞和巨噬细胞)识别结合在靶细胞上的抗体，随后导致该 輩巴细胞的裂解。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达F(ryRIII,而 单核细胞表达Fc7RI, FcryRII和FqRUL关于造血细胞FcR表达的总结 见Ravetch and Kinet, j薩.i ev. /画画/ 9:457-92 (1991)464页的表3。为 了测定目标分子的ADCC活性，可以进行例如在美国专利5，500，362或5,821,337中描述的体外ADCC活性分析。用于这类分析的效应细胞包括 外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可选4奪地或附加地，可以 在体内评价目标分子的ADCC活性，例如在诸如Clynes d a/. iW^S (USA) 95:652-656 (1998)中公开的动物模型中。
"效应细胞"指表达一种或多种FcRs、执行效应功能的白细胞。优选 地，这些细胞至少表达FcryRIII，并执行ADCC效应器功能。介导ADCC 的人类白细胞的实例包括外周血单核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、 单核细胞、细胞毒T细胞和中性粒细胞；优选PBMCs和NK细胞。效 应细胞可以从其天然来源中分离，例如从本文中描述的血液或PBMC中 分离。
术语"Fc受体"或"FcR"用于描述结合于抗体Fe区的受体。优选的 FcR是天然序列的人类FcR。而且，优选的FcR是结合于IgG抗体(7受 体)的受体，并包括FcryRI、 Fc^RII和Fcry RIII亚类的受体，其包括这些 受体的等位基因变体和可选择的剪接形式。Fc7RJI受体包括FcyRIIA ("激 活性受体")和F(ryRIIB ("抑制性受体")，两者的氨基酸序列相似，主要不 同在于其胞浆结构域。激活性受体Fc7RIIA在其胞浆结构域含有基于免 疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)。抑制性受体Fc7RIIB在其胞浆结构域 含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)。(参见在DaSron， J"聽.Wev. /mm朋o/. 15:203-234 (1997)中的综述M)。在Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92(1991); Capel & a/" /mw画匿Ac^ 4:25-34 (1994) 和de Haas " a/.， J.丄W. C/z".脸A 126:330-41 (1995)中对FcR进行了综 述。本发明中的术语"FcR"包括将来要被鉴定的FcR在内的其他FcR。 该术语也包括负责将母体的IgGs转运到胎儿体内的新生受体， FcRn(Guyer a/" /. /mmimo/. 1 17:587 (1976)禾口 Kim & a/"五Mr J. /画画/. 24:2429 (1994))。
"补体依赖性细胞毒性作用"或"CDC"指分子在补体存在下，裂解把细 胞的能力。补体激活途径通过补体系统的第一组分(Clq)与交联了同类抗 原的分子(比如，抗体)的结合而起始。为了评价补体激活，可以进行如 Gazzano-Santoro W a/., / /mmwwo/. A^AoA 202:163 (1996)中4苗述的CDC 分析。术语"可变的"指可变结构域某些部分的序列在抗体间高度不同，并 用于每一种特定抗体与其特定抗原的结合及其特异性。然而，变化并不 是均匀分布在抗体的可变结构域内。在轻链和重链的可变结构域内，变 化集中在所谓的高度可变区的三个片段内。可变结构域内更加高度保守 的部分被称为骨架区(FRS)。每个天然的重链和轻链可变结构域，包含主 要釆用^-片层构型的四个FRS，其由三个高度可变区连接在一起，形成
环状连接，在一些情况下形成部分>片层结构。每条链的高度可变区由FR 以密切靠近的方式结合一起，并与其他链的高度可变区一起，有助于抗 体的抗原结合部位的形成(参见Kabat a a/， 5^we"ces 尸ratoVw //wn柳o/o&ra/ /"tems^^疾夢^M尹蛋冷的^/力，5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991 ))。恒定结构i或并 不直接参与抗体与抗原的结合，而是呈现各种效应功能，例如参与抗体 在抗体依赖性的细胞毒效应(ADCC)中的作用。
本文使用的术语"高度可变区"指抗体上负责与抗原结合的氨基酸残 基。高度可变区通常包括"互补决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链 可变结构域的氨基酸残基24-34 (Ll)、 50-56 (L2)和89-97 (L3)及重链可 变结构域的氨基酸残基31-35(H1)、 50-65(H2)和95-102(H3); Kabat d a/, Se，e"cas1 o/ /VotoVw o/ /mm調0/0g7-ca/ /"&ms,f^瘦夢《标蛋力的/^/力, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))和/或"高变环"区的那些残基(例如轻链可变结构域的残基2632 (Ll)、 50-52 (L2)和91 -96 (L3)及重链可变结构域的26-32 (Hl)、 53-55 (H2) 和96-101 (H3); Chothia and Lesk, 7kfo/所o/. 196:901-917(1987))。"骨架 区"或"FR"残基指除了本文定义的高变区残基之外的那些可变区的残基。 木瓜蛋白酶水解抗体产生了两个相同的被称为"Fab"片段的抗原结合片 段和一个残余的"Fc"片段，每个"Fab"片段都有单一的抗原结合部位，"Fc" 片段的名称反映了其易结晶的能力。抗体经胃蛋白酶处理后，产生F(ab')2 片段，其有两个抗原结合部位，且仍能够与抗原交联。
"Fv"是包含完整的抗原识别和抗原结合部位的最小抗体片段。此区 域由以非共价键的方式紧密结合的一条重链和一条轻链可变结构域的二
聚体构成。以这种每个可变结构域的三个高变区相互作用的构型决定VH-VL 二聚体表面的抗原结合部位。六个高变区域共同赋予了抗体的抗原 结合特异性。然而，即便单一的可变结构域(或只含有三个抗原特异性高 变区的一半的Fv)仍能够识别和结合抗原，虽然比完整结合位点的亲和性
低。Fab片段也含有轻链恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。 Fab' 片段与Fab片段的不同在于重链CH1结构域的羧基末端多了几个氨基酸 残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH在本文中指 代Fab'，其中恒定结构域的半胱氨酸残基至少携带一个游离的硫基。最 初的F(ab')2抗体片段以Fab'片段对产生，之间有铰链的半胱氨酸。其他 的抗体片段的化学偶联也是公知的。
来自任意脊推动物的抗体的"轻链"都可以归于两种截然不同的所谓 /c和入链中的一种，/c和入链的分类基于其恒定结构域的氨基酸序列。
"单链Fv"或"scFv"抗体片段包含抗体的Vh和VL结构域，其中这些 结构域存在于单一的多肽链上。优选地，Fv多肽进一步包含Vh和Vl 结构域之间的多肽连接子，使scFv形成适于抗原结合的结构。关于scFv 的纟宗述参见Pliickthun in 尸力awz"co/ow o/Mo"oc/o"a/ J""Z76>d/&s"(^^^ 發我i/^秀理釣，vol. 113， Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag， New York, pp. 269-315 (1994)。
术语"双体(Diabodies)"指带有两个抗原结合位点的小型抗体片段，其
在相同多肽链上(VH-VO含有与轻链可变结构域(VO结合的重链可变结构 域(Vh)。通过使用因过短而不能使同一条链上的两个区域配对的连接子， 使这些结构域被迫与另一条链上的互补结构域配对，由此产生了两个抗 原结合位点。例如在EP 404,097; WO 93/11161 ;和Hollinger & a/.， Jcad. 90:6444-6448 (1993)中对双体作了更详细的描述。
"分离"抗体是指从其天然环境的组分中鉴别、分离和/或回收的抗体。 其天然环境下的污染成分是指干扰抗体诊断或治疗性用途的物质，可能 包括酶、激素和其它的蛋白质或非蛋白质溶质。因为抗体的天然环境中 的至少 一种组分将不存在，所以分离抗体包括重组细胞内部的原位抗体。 但是，通常分离的抗体会经过至少一步的纯化步骤来制备。
"结合"目的抗原(例如，CD63抗原)的抗体是指能够对该抗原有充分 亲和力的抗体，以致该抗体在耙向表达该抗原的细胞时，可以用作治疗或诊断试剂。如果抗体是结合CD63部分的抗体，那么它通常会优先结
合CD63抗原部分，而不是其它受体，这不包括诸如非特异性的Fc接触 的偶然的结合或与其他抗原共有的翻译后修饰成分结合，该抗体不会与 其他蛋白有明显的相互作用。检测与目的抗原结合的抗体的方法在本领 域中是公知的，可以包括但并不局限于诸如FACS、细胞ELISA和Western 印迹等分析。
如本文使用的，"细胞"、"细胞系"、"细胞培养物"的表述可以交替使 用，所有这些用法都包括其子代。也可以理解为由于人为的或非人为的 突变，所有的子代在DNA组成上不可能完全相同。在原始转化细胞内筛 选的有相同功能或生物学活性的突变子代包括在内。从有意使用不同指 代的上下文中，指代是清楚的
"治疗"既指治疗性处理，也指预防性或防止的措施，其目的就是预 防或减緩(减轻)靶向的病理状态或病症。需要治疗的个体包括那些已经存 在所述病症的个体，还包括那些将发展为该病症的或名夂对其病症进行预 防的个体。因此，本文中欲被治疗的哺乳动物可已经^皮诊断为患有该病 症或可倾向于或易感于该病症。
术语"癌症"和"癌性"是指或描述哺乳动物的生理状态，其典型特征是 细胞生长或死亡不受调控。癌症的例子包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细 胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴恶性肿瘤。这些肿瘤更多具体的实例包括鳞 状细胞癌(例如鳞状上皮细胞癌)，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的 ^i癌和肺的鳞状癌的肺癌，腹膜癌，肝细胞癌，包括胃肠道癌的胃癌， 胰腺癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卯巢癌，肝脏癌症，膀胱癌，肝细胞 瘤，乳腺癌，结肠癌，直肠癌，结肠直肠癌，子宫内膜或子宫癌，唾液
腺肿瘤，肾癌，前列腺癌，外阴肿瘤，甲状腺癌，肝癌，肛癌，阴茎癌， 还有头颈部癌。
"化疗剂"是用于癌症治疗的化合物。化疗剂的实例包括诸如噻替 派和环磷酰胺(CYTOXANTM)的烷化剂；例如白消安(busulfan)、英丙舒凡 (improsulfan)、哌泊舒凡(piposulfan)的烷基磺酸酯类；如笨佐替派 (benzodopa)、 卡波醌、美妥一齐口底(meturedopa)和乌瑞"^派(uredopa)的氮丙 啶类；包括六甲蜜胺、曲他胺(triethylenemelamine)、三亚乙基磷酰胺、三亚乙基硫代磷酰胺和三曱基奥罗蜜胺(trimethylolomelamine)在内的乙 烯亚胺类(ethylenimines)和曱基蜜胺类(methylamelamine);如瘤可宁 (chlorambucil)、萘氮芥、环磷酰胺、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺、 氮芥(mechlorethamine)、 盐酉史曱氧氮芥、美法仑、新氮芥(novembichin)、 苯乙酸氮芥(phenesterine)、泼尼莫司汀、曲磷胺、乌拉莫司汀(uracil mustard) 等氮芥类药物；如卡氯芥、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、 雷莫司汀等硝脲类(nitrosureas);如阿克拉霉素类、放线菌素、安曲霉素、 重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加里刹霉素、洋红霉素、碳霉素 (camomycin)、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托咪定、 6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表阿霉素、依索比星、依达比星、 麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、灰霉素、 potfiromycin、噤呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、 杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星类的抗生素；曱氨碟呤和 5-氟尿嘧啶(5-FU)类抗代谢类药；如二甲叶酸、氨曱喋呤、蝶罗呤、三曱 曲沙等叶酸拟似物；如氟达拉滨、6-巯嘌呤、硫米噤呤、石克鸟。票呤类噪呤 类似物；如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮杂尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱 氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU等嘧啶类似物；如卡鲁 睾酮、屈他雄酮丙酸酯、表硫雄醇、美雄烷、睾内酯酮等男性激素类药 物；如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦等抗肾上腺类药物；如亚叶酸等叶 酸补充物；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶； bestrabucil;比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟 氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明； 米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；尼曲吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡 柔比星；足叶草酸；2-乙肼；丙卡巴肼；PSK ;雷佐生；西佐喃；锗螺 胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2，2',2"-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地 辛；达卡巴。秦；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷； gacytosine;阿拉伯糖苷("Ara-C");环磷酰胺；塞替派；如紫杉醇(泰素， Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N丄)禾口多西他赛(泰素帝， Aventis, Rhone-Poulenc Rorer， Antony, France)等紫杉》克类；苯丁酉吏氮界； 吉西他滨；6-碌u鸟噪呤；巯。票呤；曱氨蝶呤；如顺铂和卡铂等铂类似物；长春^f成；铂；依托泊苷(VP-16);异环磷酰胺；丝裂霉素C;米托蒽醌； 长春新石咸；长春瑞滨；去曱长春i咸；诺消灵(novantrone);替尼泊苷；柔 红霉素；氨蝶呤钠；希罗达；伊班膦酸钠；CPT-11;拓朴异构酶抑制剂RFS 2000; 二氟甲基鸟氨酸(DMFO);视黄酸；埃斯波霉素；卡培他滨；以及 上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。调节或抑制激素对 肿瘤作用的抗激素类药物也包括在本定义内，像抗雌激素药物，例如， 包括它莫西芬、雷洛昔芬、芳香化酶抑制剂4(5)-咪唑、4-轻基他莫昔芬、 曲沃昔芬、雷诺昔芬、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(法乐通)；抗雄激 素物质，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以 及上述任一种药物在药学上可接受的盐、酸或衍生物。
用于治疗目的的"哺乳动物"指任何一种可归于哺乳类的动物，包括 人类、小鼠、免疫缺陷鼠或棵鼠或品系小鼠、家畜和农场动物及动物园 内的动物、体育动物或宠物，比如绵羊、狗、马、猫、母牛等。优选地， 本文的哺乳动物指人类。
"寡核苷酸"指短长度、单链或双链多聚脱氧核苦酸，其可利用已知 的方法化学合成(例如磷酸三酯、亚磷酸盐、亚磷酰胺化学，利用例如发 表于1988年5月4日的EP 266,032描述的固相技术；或利用Froehler d a/， M/c/. Jc/A Wm.， 14:5399-5407, 1986描述的脱氧核苷H-磷酸盐中间物)， 然后用聚丙烯酰胺凝胶纯化。
除非另外指出，术语"CD63抗原部分"用于本文时是指四次跨膜蛋 白家族的III型膜蛋白，其还称为黑色素瘤1抗原、眼黑色素瘤相关抗原、 黑色素瘤相关抗原ME491、溶酶体相关膜糖蛋白3、 granulophysin、黑色 素相关抗原MLA1。
"嵌合"抗体指免疫球蛋白，其部分重链和/或轻链与来源于特定种属 或属于特定抗体种类或亚类的抗体的对应序列相同或同源，同时链上余 下序列与来源于另一种属或属于另一种类或亚类的抗体的对应序列相同 或同源，此外还指这些抗体的片段，只要这些片段能够表现出所需的生 物活性(美国专利4,816,567和Morrison W a/，尸rac.淑/. 《"■园,
81 :6851 -6855 (1984))。
非人类(例如鼠科)抗体的"人源化"形式指特殊的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片^爻(例如Fv， Fab, Fab', F(ab)2或抗体的其他抗原结合序 列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。在绝大多数情况下，人源 化抗体是人的免疫球蛋白(受者抗体)，其中，所述受者抗体的互补决定区 (CDR)的残基被诸如具有所需的特异性、亲和力、能力的小鼠、大鼠或兔 等的非人类抗体(供者抗体)的CDRs的残基所替代。在一些情况下，人类 免疫球蛋白的Fv骨架区(FR)残基被相应的非人类FR残基所替代。此 外，人源化抗体可以包括既不在受者抗体也不在引入的CDR或FR序列 的残基。这些修饰进一步改善和优化了抗体的性能。通常，人源化抗体 包括至少一个，通常是两个可变区的基本上全部，其中全部或基本上全 部的CDR区对应非人类免疫球蛋白的CDR区，且全部或基本上全部的 FR残基是人类免疫球蛋白共有序列的FR残基。人源化抗体也最适宜包 含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc),通常是人类免疫球蛋白的恒定 区。
疫球蛋白。通过改造抗体的结构可以实现去免疫化。任何本领域技术人 员公知的去免疫化技术都可以使用。例如，在发表于2000年6月15曰 的WO 00/34317中，描述了一项-使抗体去免疫原性的适当的^支术。
"同源性"被定义为比对序列和必要时引入空位(gaps),以实现最大同 源性百分比后，氨基酸序列变体中相同残基的百分比。用于比对的方法 和计算机程序是本领域公知的。
在本说明书自始至终中，杂交瘤细胞系以及从其产生的分离的单克 隆抗体可^皮选^奪用其内部名称7BDI-58、 7BDI-60、 7BD-33-11A、 1A245.6、 H460-22-l或AR51A994.1，或者用保藏号IDAC 141205-01、 ATCC PTA-4623 、 ATCC PTA-4890 、 ATCC PTA-4889 、 ATCC PTA-4622或ID AC 141205-06来表示。
本文使用的"配体"包含对靶抗原显示结合特异性的部分，其可以是 完整的抗体分子和至少具有抗原结合区或者其部分(即，抗体分子的可变 部分)的任意分子，例如，Fv分子、Fab分子、Fab'分子、F(ab')2分子、 双特异抗体、融合蛋白或者任意基因工程分子，所述分子特异识别并结 合与分离的单克隆抗体结合的抗原，所述单克隆抗体由命名为IDAC141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA陽4889， ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06 ( IDAC 141205-01, ATCC PTA画4623， ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06抗原)的杂交瘤细胞系产生。
本文使用的"抗原结合区"表示识别靶抗原的分子的部分。 本文使用的"竟争性抑制"指使用常规的抗体相互(reciprocal)竟争分 析(Belanger L.， Sylvestre C. and Dufour D. (1973), Enzyme linked immunoassay for alpha fetoprotein by competitive and sandwich procedures(竟争和夹心法的曱胎蛋白的酶联免疫测定).Clinica Chimica Acta48, 15)能够识别并结合决定簇位点，其中由命名为IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA陽4889， ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体(IDAC 141205- 01, ATCC PTA-4623， ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06抗体)耙向所述决定簇位点。
本文使用的"耙抗原"是IDAC 141205-01， ATCC PTA- 4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原或 其部分。
如本文所用，"免疫偶联物"指以化学或生物学方式与细胞毒素、放 射性试剂、酶、毒素、抗肿瘤药或治疗剂结合的诸如抗体的任何分子或 配体。该抗体可以在所述分子的任何位置与细胞毒素、放射性试剂、抗 肿瘤药或治疗剂连接，只要它能够与其靶标结合。免疫偶联物的实例包 括抗体毒素化学偶联物和抗体-毒素融合蛋白。
如本文所用，"融合蛋白"指任何嵌合蛋白，其中，抗原结合区与例 如毒素、酶或蛋白药物的生物活性分子连接。
为了更充分理解本文中描述的发明，进行下述说明。
本发明提供配体(即，IDAC 141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06配体)， 其特异识别并结合IDAC 141205-01 ， ATCC PTA-4623， ATCC PTA-4890， ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原。
本发明的配体可以采用任何形式，只要它具有抗原结合区，所述抗原结合区竟争性抑制由杂交瘤IDAC 141205-01, ATCC PTA- 4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06产生的 单克隆抗体与其靶抗原的免疫特异结合。因此，与IDAC 141205-01 , ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或 IDAC 141205-06抗体具有相同结合特异性的任何重组蛋白(例如，融合蛋 白，其中所述抗体与诸如淋巴因子或者肿瘤抑制生长因子的另 一蛋白结 合)也属于本发明的范围。
在本发明的一种实施方案中，所述配体是IDAC 141205-01， ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗体。
在其他实施方案中，所述配体是抗原结合片段，其可以是具有IDAC 141205- 01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或者IDAC 141205-06抗体的抗原-结合区的Fv分子(例如单链 Fv分子)，Fab分子，Fab'分子，F(ab')2分子，融合蛋白，双特异抗体，异种抗 体或者任何重组分子。本发明的配体针对IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890， ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06单克隆抗体针对的表位。
本发明的配体可以被修饰，即，通过分子内的氨基酸+务饰，从而产 生衍生物分子。也可以是化学修饰。
衍生物分子将保留所述多肽的功能特性，即，具有这类取代的分子 ^!夸仍然允许所述多肽与IDAC 141205-01, ATCC PTA-4623, ATCC PTA-4890, ATCC PTA-4889, ATCC PTA-4622或IDAC 141205-06抗原或者其 部分结合。
这些氨基酸取代包括在本领域中公知的"保守"氨基酸取代，但并不 局限于此。
例如，某些被称为"保守氨基酸取代"的氨基酸取代能够在蛋白中经 常出现，但并不改变该蛋白的构象或功能，这是蛋白质化学中已建立的法则。
这些改变包括异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)和亮氨酸(L)的任何一种取代任 何其他的疏水氨基酸；天门冬氨酸(D)取代谷氨酸(E)，反之亦然；谷氨酰胺(Q)取代天冬酰胺(N)，反之亦然；以及丝氨酸(S)取代苏氨酸(T),反之 亦然。其他的取代也可被认为是保守的，这取决于特定氨基酸的环境和 其在蛋白质三维结构中的作用。例如，甘氨酸(G)和丙氨酸(A)可经常互换， 丙氨酸和缬氨酸(V)也是。相对疏水的曱硫氨酸(M)可经常与亮氨酸和异 亮氨酸互换，有时与纈氨酸互换。赖氨酸(K)和精氨酸(R)经常互换，其发 生部位氨基酸残基的明显特征是其电荷，这两种氨基酸残基的不同pK的 差别并不明显。在特定情境下，仍有其他的一些变化可以被认为是"保守 的"。
给定一种抗体，本领域普通技术人员可以制备识别相同表位的竟争 性抑制配体，例如竟争性抗体(Belanger d a/., 1973)。 一种方法是用表达 该抗体识别抗原的免疫原产生免疫。该样品可以包括组织、分离的蛋白 或细胞系，但并不局限于这些。可以用诸如ELISA、 FACS或免疫沉淀的 竟争性分析筛选产生的杂交瘤，该分析能鉴定抑制所检测抗体结合的抗 体。另一种方法可以利用噬菌体展示文库，淘选识别所述抗原的抗体 (Rubinstein da/.， 2003)。在任何一种情况下，杂交瘤的选择都是基于它们 竟争过原抗体与其靶抗原的结合的能力。因此，这些杂交瘤的特征是识 别与所述原抗体相同的抗原，并且这些杂交瘤将更为特异地识别同样的 表位。
实施例1
杂交瘤制备-杂交瘤细胞系AR51A994.1和7BDI-58
依据布达佩斯条约，杂交瘤细胞系7BDI-58和AR51A994.1于2005 年12月14日保藏于加拿大国际微生物保藏单位(IDAC)，位于加拿大马 尼托巴省温尼伯市阿林顿街道1015的加拿大卫生部微生物局，R3E3R2, 保藏号分别为141205-01和141205-06。依据37 CFR 1.808的规定，保藏 者保证在专利授权时将不可撤销地取消对公众获取该保藏材料的所有限 制。
如在S.N. 10/713,642中所公开的那样，制备产生抗癌抗体7BDI-58 的杂交瘤。为了制备产生AR51A994.1抗癌抗体的杂交瘤，在PBS中制 备冷冻的人卵巢子Cambridge, MA)的单细胞悬浮液。将IMMUNEASY (Qiagen, Venlo, Netherlands)佐剂轻轻混合后备用。通过皮下注射含2百万个细胞的50微 升抗原-佐剂来免疫4到6周龄的BALB/c小鼠。初次免疫后2和5周， 用新鲜制备的含2百万个细胞的50至60微升抗原-佐剂腹腔注射加强免 疫小鼠。末次免疫后第3天，取出脾脏用于融合。将分离的脾细胞与NSO-l 骨髓瘤细胞伴侣融合，制备杂交瘤。检测杂交瘤亚克隆融合的上清。
为了检测杂交瘤细胞分泌的抗体是IgG,还是IgM同种型，进行 ELISA分析。将4。C包被缓冲液(O.l M碳酸盐/石友酸氢盐緩沖液，pH 9.2-9.6) 中的浓度为2.4微克/mL的山羊抗小鼠的IgG + IgM (H+L)，按100微升 /孔加入ELISA板过夜。该ELISA板用洗涤缓冲液(PBS + 0.05%吐温)洗 三次。按100微升/孔加入封闭緩沖液(5%奶洗涤緩沖液)，室温l小时， 随后用洗涤緩冲液洗三次。按100微升/孔加入杂交瘤上清，将该板室温 孵育1小时。该板用洗涤緩冲液洗三次，按100微升/孔加入山羊抗小鼠 的IgG或IgM辣才艮过氧化物酶偶联物的1/100,000稀释液(用含5%奶的 PBS稀释)。室温孵育1小时后，该板用洗涤缓冲液洗三次。按100微升 /孔加入TMB溶液，室温孵育1-3分钟。按50微升/孔加入2MH2SO4， 终止颜色反应，用Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。 如图1所示，AR51A994.1杂交瘤主要分泌IgG同种型抗体。
为了确定杂交瘤细胞分泌抗体的亚类，使用小鼠单克隆抗体同种型 分型试剂盒(HyCuIt Biotechnology, Frontstraat, Netherlands)进4亍同种型分 型(isotyping)实验。将500微升缓冲溶液加入到包含大鼠抗小鼠亚类特异 抗体的检测条(test strip)上。向试管中添加500微升杂交瘤上清，并通过 温和搅拌浸没。利用偶联到胶体微粒的大鼠单克隆二抗来直接检测捕获 的小鼠免疫球蛋白。这两种蛋白的组合产生了用于分析同种型的可视信 号。抗癌抗体AR51A994.1为IgGl, k同种型。
经过一轮有限稀释，在细胞ELISA分析中，检测杂交瘤上清中与靶 细胞结合的抗体。检测了 2种人卵巢癌细胞系，和1种人正常皮肤细胞 系分别是OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk。铺板的细胞在使用前先固 定。室温下，该板用包含MgCl2和CaCl2的PBS洗涤三次。每孔加入100 微升稀释于PBS中的2%多聚曱醛，室温10分钟，然后倒掉。室温下，该板用包含MgCh和CaCl2的PBS再洗涤三次。每孔加100微升溶于洗 涤緩沖液(PBS + 0.05%吐温)的5%奶进行封闭，室温1小时。该板用洗 涤缓冲液洗三次，纟姿75^:升/孔加入杂交瘤上清，室温孵育1小时。用洗 涤缓冲液将该板洗三次，按100微升/孔加入辣根过氧化物酶偶联的山羊 抗小鼠的IgG抗体的1/25,000稀释液(用含5%奶的PBS稀释)。室温孵育 1小时后，该板用洗涤緩沖液洗三次，每孔加入100微升TMB底物， 室温孵育1-3分钟。每孔加入50微升2 M H2S04终止反应，并用 Perkin-Elmer HTS7000酶标仪在450 nm波长处读板。如图1列表所示， 结果表示为与内部(in-house)的IgG同种型对照相比，高出背景的倍数， 事先已经证明该对照不与所检测的细胞系结合。来源于杂交瘤 AR51A994.1的抗体显示出与卵巢癌细胞系OVCAR-3和正常皮肤细胞系 CCD-27sk的结合。
进行抗体结合试马全的同时，在OCC-l、 OVCAR-3和CCD-27sk这 些细胞系上4全测了杂交瘤上清的细胞毒性作用。Calcein AM购自 Molecular Probes (Eugene, OR)。根据厂商的说明及下述的改动进行分析。 所述分析前将细胞以预定的合适密度进行铺板。2天后，将来自杂交瘤微 量滴定板的75微升上清转移到细胞板，在5% C02培养箱中孵育5天。 将阳性对照孔吸净，加入100微升叠氮钠(NaN3)或者放线菌酮。经过5 天处理后，倒空反应^反的液体并吸干。通过多通道^4f瓦将室温下包含 MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，叩打3次，倒空液体并吸干。将 用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升荧光钙黄绿素染料添加到 每个孔中，在5% C02培养箱中37。C孵育30分钟。在Perkin-Elmer HTS7000荧光读板仪中读板，数据用Microsoft Excel进行分析。结果列 表于图1。来自AR51A994.1杂交瘤的上清分别对OCC-l和OVCAR-3 细胞产生了 14%和10%的特异细胞毒性。对于OCC-l的细胞毒性分别是 从阳性对照叠氮钠和放线菌酮得到的细胞毒性的16%和15%。对于 OVCAR-3的细胞毒性是从阳性对照放线菌酮得到的细胞毒性的22%。图 1的结果表明AR51A994.1的细胞毒性作用不与其对癌细胞类型的结合水 平成正比。尽管OVCAR-3细胞中的结合水平更高，但是与OVCAR-3细 胞相比，OCC-l细胞中产生的细胞毒性水平更高。如图1所示，AR51A994.1在CCD-27sk正常细胞系中不产生细胞毒性。已知的非特异 性的细胞毒性试剂放线菌酮和NaN3普遍产生了预期的细胞毒性作用。
实施例2
抗体制备
通过在CL-1000瓶(BD Biosciences, Oakville， ON)中培养杂交瘤来制 备AR51A994丄7BDI-58和7BDI-60单克隆抗体，每周进行两次收集和 再接种。根据利用蛋白G琼脂糖凝胶4快流(Protein G Sepharose 4 Fast Flow) (Amersham Biosciences, Baie d'Urft, QC)的标准抗体纯化步骤来纯 化抗体。利用去免疫的、人源化的、嵌合的或者鼠科的单克隆抗体也在 本发明的范围内。
在细胞毒性分析中，将AR51A994.1抗体与许多阳性对照(抗-EGFR 抗体(C225, IgGl, k, 5微克/mL, Cedarlane, Hornby, ON),放线菌酮(100微 摩尔，Sigma, Oakville, ON> NaN3 (0.1%, Sigma， Oakville, ON))和阴性对照 (107.3 (抗TNP, IgGl, k, 20微克/mL， BD Biosciences, Oakville, ON),以及 IB7.1 (抗TNP), IgGl, /c, 20微克/mL,内部纯化))，以及緩冲稀释液对照进 行了比较(图2)。检测了胰腺癌(BxPC-3)、卵巢癌(OCC-l和OVCAR-3) 和非癌(CCD-27sk, Hs888丄u)细胞系(均来自ATCC, Manassas, VA)。 4丐黄 绿素AM购自Molecular Probes (Eugene, OR)。根据厂商的说明及下面列 出的改动进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度进行铺板。2天 后，将100微升纯化的抗体或者对照稀释于培养基中，然后转移到所述 细胞板，在5。/。C02培养箱中孵育5天。然后将板倒空并吸干。通过多通 道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，叩打3次， 倒空液体，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的50微升 荧光钙黄绿素染料添加到每个孔中，在5% C02培养箱中37。C孵育30分 钟。在Perkin-ElmerHTS7000荧光读板仪内读板，数据用Microsoft Excel 进行分析，结果列表于图2。每种抗体得到5至50的分数，其基于以一 式三份检测的4次实验观察到的平均细胞毒性，以及得到25至100的分 数，其基于分析间所观察到的变异。这两种分数(细胞毒性分数)的总和显 示于图2。大于或者等于55的细胞毒性分数被认为对所测细胞系是阳性的。相对于同种型和緩沖液阴性对照，AR51A994.1抗体在OVCAR-3卵 巢癌细胞系和BxPC-3胰腺癌细胞系中产生了特异的细胞毒性。这与来自 AR51A994.1克隆的杂交瘤上清的数据一致，所述上清也显示出针对 OVCAR-3细胞系的特异细胞毒性(参见实施例1)。在OCC-l卵巢癌细胞 系中AR51A994.1没有产生阳性的细胞毒性分数。重要的是，与阴性对照 相比，AR51A994.1对诸如CCD-27sk或者Hs888丄u的非癌细胞系没有产 生显著的细胞毒性，表明该抗体对癌细胞的细胞毒性是特异的。化学细 胞毒性试剂诱导了针对多种细胞系的预期的细胞毒性。
通过流式细胞术(FACS)检测AR51A994.1与胰腺癌(BxPC-3)、卯巢 癌(OCC-l和OVCAR-3)和非癌(CCD-27sk，Hs888丄u)细胞系的结合。首先 用DPBS(不含Ca"和^^++)洗涤细胞单层来制备用于FACS的细胞。然后 在3TC使用细胞离解緩沖液(INVITROGEN, Burlington, ON)将细胞从它 们的细胞培养板上分离出来。经离心和收集后，将细胞重悬于4°C的包含 MgCl2、 CaCl2和2%胎牛血清的DPBS(染色培养基)并计数，等分到合适 的细胞密度，离心以沉淀所述细胞，并在20 Aig/mL测试抗体(AR51A994.1) 或者对照抗体(同种型对照，抗EGFR)存在的条件下将其重悬于4。C的染 色培养基中，冰上置30分钟。在添加AlexaFluor546偶联的二抗前，用 染色培养基洗涤细胞一次。然后在4。C添加溶于染色培养基的Alexa Fluor 546偶联的抗体，孵育30分钟。然后最后一次洗涤细胞，将其重悬于固 定培养基(包含1.5%多聚曱醛的染色培养基)。使用FACSarray System Software (BD Biosciences, Oakville, ON)在FACSarray 上运行样本来评 价细胞的流式细胞采集。通过调整前向角散射(FSC)和侧向角散射(SSC) 探测器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和SSC。通过运行未染色的细 胞来调节荧光(Alexa-546)通道的检测器，以便细胞具有中位荧光强度约 为1至5单位的一致的峰。对于每种样本，获得大约10,000个门事件(染 色的固定细胞)用于分析，结果显示于图3。
图3以高于同种型对照的倍增来表示平均荧光强度。图4汇集了 AR51A994.1抗体的代表性直方图。AR51A994.1显示了与卵巢癌细胞系 OCC-l和OVCAR-3(分另U为16和14.8倍)以及非癌月申细胞系 Hs888丄u(24.6倍)的强结合，与胰腺癌细胞系BxPC-3(8.6倍)和非癌皮肤细胞系CCD-27sk(5.1倍)的较弱结合。这些数据表明AR51A994.1显示出 功能特异性，因为尽管AR51A994.1与多种被测细胞系存在明显的结合， 但其在体外只存在与OVCAR-3卵巢癌和BxPC-3胰腺癌相关的细胞毒性。
为了进一步证实上述的体外结合和细胞毒性结果，在细胞毒性分析 中，利用肺癌(A549)、其他的胰腺癌(AsPC-l和PL45)和卯巢癌(C-13, ES-2, Hey， OV2008, OVCA-429和OVCAR-3)细胞系(A549， AsPC-l, PL45和 OVCAR-3来自ATCC, Manassas， VA; C-13, ES-2， Hey, OV2008和 OVCA-429购自 Ottawa Regional Cancer Center (Ottawa, Ontario))只十 AR51A994.1抗体以及上述阳性和阴性对照进行了检测。如上所述进行 Live/Dead细胞毒性分析。相对于同种型和緩沖液阴性对照，AR51A994.1 抗体在ES-2、 OV2008和OVCA-429卵巢癌细胞系和A549肺癌细胞系中 产生了特异的细月包毒性(图2)。AR51A994.1抗体也在OVCAR-3卯巢癌细 胞系中产生特异的细胞毒性。这与上述OVCAR-3细胞毒性的数据一致。 AR51A994.1在C-B和Hey卵巢癌细胞系或AsPC-1和PL45胰腺细胞系 中没有产生阳性的细胞毒性分数。化学细胞毒性试剂诱导针对多种细胞 系的预期的细胞毒性。
通过上述流式细胞术(FACS)评估了 AR51A994.1与肺癌(A549)、其 他的胰腺癌(AsPC-l和PL45)和卵巢癌(C-13、 ES-2、 Hey、 OV2008、 OVCA-429和OVCAR-3)细胞系的结合。图3以高于同种型对照的倍增来 表示平均焚光强度。图4汇集了 AR51A994.1抗体的代表性直方图。 AR51A994.1显示了与卵巢癌细胞系ES-2和OV2008 (分别为22.2和19.8 倍)更强的结合，而与卵巢癌细胞系C-13、Hey、OVCA-429和OVCAR-3(分 别为9.8、 4.4、 3.9和4.3倍)、胰腺细胞系AsPC-1和PL45(分别为4.1和 2.4倍)和肺癌细胞系A549(4.6倍)的结合较弱。这些数据表明AR51A994.1 显示出功能特异性，因为尽管AR51A994.1与所有的被测细胞系存在明显 的结合，但其只存在与 一些癌细胞系相关的细胞毒性。
在细胞毒性分析中，将7BDI-58和7BDI-60抗体与许多阳性对照(抗 Her2(IgGl,k, 10微克/mL, Inter Medico, Mai'kham, ON)，放线菌酮(100微 摩尔，Sigma, Oakv"e, ON))和阴性对照(107.3 (抗TNP, IgGl, k, 20微克/mL, BD Biosciences, Oakville， ON))以及緩冲稀释液对照进行比较(图 5》检测了卵巢癌(OVCAR-3)和乳腺癌(MDA-MB-468 (MB-468))以及非癌 (Bst549, CCD陽27sk, Hs888丄u)细胞系(均来自ATCC, Manassas, VA)。 Live/Dead细胞毒性分析购自Molecular Probes (Eugene, OR)。根据厂商的 说明及下面列出的改动进行分析。所述分析前将细胞以预定的合适密度 铺板。2天后，将100微升纯化的抗体或者对照稀释于培养基中，然后转 移到所述细胞板，在5。/。C02培养箱中孵育5天。然后将板倒空并吸干。 通过多通道挤瓶将室温下包含MgCl2和CaCl2的DPBS分入每个孔中，叩 打3次，倒空液体，然后吸干。将用包含MgCl2和CaCl2的DPBS稀释的 50微升荧光钙黄绿素染料添加到每孔中，在5% C02培养箱中37。C孵育 30分钟。在Perkin-ElmerHTS7000荧光读板仪内读板，数据用Microsoft Excel进行分析，结果列表于图5。每种抗体得到5至50的分数，其基于 以一式三份检测的4次实验观察到的平均细胞毒性，以及得到25至100 的分数，其基于分析间所观察到的变异。这两种分数(细胞毒性分数)的总 和显示于图5。大于或者等于55的细胞毒性分数被认为对所测细胞系是 阳性的。相对于同种型和緩冲液阴性对照，7BDI-58抗体在OVCAR-3卵 巢癌细胞系中产生特异的细胞毒性。7BDI-58在MB-468乳腺癌细胞系中 没有产生阳性的细胞毒性分数。重要的是，与阴性对照相比，7BDI-58 对例如Bst549、 CCD-27sk或Hs888丄u的非癌细胞系没有产生显著的细 胞毒性，表明该抗体对癌细胞具有特异的细胞毒性。相对于同种型和緩 沖液阴性对照，7BDI-60抗体在MB-468乳腺癌细胞系中产生了特异的细 胞毒性。7BDI-60在OVCAR-3卵巢癌细胞系中没有产生阳性的细胞毒性 分数。重要的是，与阴性对照相比，7BDI-60对例如Bst549、 CCD-27sk 或者Hs888丄u的非癌细胞系没有产生显著的细胞毒性，表明该抗体对癌 细胞具有特异的细胞毒性。化学细胞毒性试剂诱导针对多种细胞系的预 期的细胞毒性。
通过流式细胞术(FACS)检测了 7BDI-58和7BDI-60与乳腺癌 (MB-468)、卵巢癌(OVCAR-3)和非癌(Bst549、 CCD-27sk、 Hs888丄u)细 胞系的结合。首先用DPBS(不含Ca+'和Mg++)洗涤细胞单层来制备用于 FACS的细胞。然后在37°C使用细胞离解缓冲液(INVITROGEN,Burlington, ON)将细胞从它们的细胞培养板上分离出来。经离心和收集 后，将细胞重悬于4。C的包含MgCl2、 CaCl2和25%胎牛血清的Dulbecco's 磷酸盐緩沖液中(洗涤培养基)并计数，等分到合适的细胞密度，离心以沉 淀所述细胞，将所述细胞重悬于包含20 /xg/mL测试抗体(7BDI-58或 7BDI-60)或对照抗体(同种型对照或者抗EGFR)的染色培养基(包含MgCl2 和CaCl2的DPBS )中，冰上置30分钟。在添加Alexa Fluor 488偶联的二 抗前，用洗涤培养基洗涤细胞一次。然后添加溶于染色培养基的Alexa Fluor488偶联抗体20分钟。然后最后一次洗涤细胞，重悬于包含l微克 /mL碘化吡啶的染色培养基。使用CellQuest软件(BD Biosciences)在 FACScan上运行样本来评价细胞的流式细胞采集。通过调整前向角散射 (FSC)和侧向角散射(SSC)探测器上的电压和振幅，设置细胞的FSC和 SSC。通过运行使用纯化的同种型对照抗体染色，继之用AlexaFluor488 偶联的二抗染色的细胞来调节3种焚光通道的^企测器(FL1、 FL2和FL3), 以便细胞具有一致的峰，且中位荧光强度约为1-5单位。通过FSC设门 和碘化吡啶拒染法获得活细胞。对于每种样本，获得大约10,000个活细 胞用于分析，结果显示于图6。
图6显示高于每种抗体的同种型对照的平均焚光强度倍增。7BDI-58 和7BDI-60抗体的代表性直方图汇集于图7。 7BDI-58对卵巢癌细胞系 OVCAR-3(13.8倍)、非癌肺细胞系Hs888丄u(18.3倍)、非癌乳腺细胞系 Bst549(10.8倍)和非癌皮肤细胞系CCD-27sk(22.5)显示出较强的结合，而 与乳腺癌细胞系MB-468(3.8倍)的结合较弱。这些凄t据表明7BDI-58显示 出功能特异性，因为尽管7BDI-58与多种^^f佥测的细胞系存在明显的结 合，但其只存在与OVCAR-3卵巢癌相关的细胞毒性。7BDI-60显示了与 卵巢癌细胞系OVCAR-3 (5.7倍)、乳腺癌细胞系MB-468 (5.1倍)、非癌 肺细胞系Hs888丄u (9.1倍)、非癌乳腺细胞系Bst549 (3.7倍)和非癌皮肤 细胞系CCD-27sk (8.1倍)的结合。这些数据表明7BDI-60显示出功能特 异性，因为尽管7BDI-60与多种被^^测的细胞系存在明显的结合，但其 只存在与MB-468乳腺癌相关的细胞毒性。
实施例3MDA-MB-231细胞的体内肺瘤实验
参考图8和9，将颈背部皮下注射的100微升生理盐水中的5百万 个人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)植入到4至6周的雌性SCID小鼠。将所 述小鼠随机分成2个治疗组，每组5只。在植入后一天，每组小鼠经腹 腔给予稀释后体积为30(M鼓升的20 mg/kg 7BDI-58测试抗体或者緩冲液 对照，所述稀释使用含有2.7mMKCl、 lmMKH2P04、 137mMNaCl和 20 mM Na2HP04的稀释剂/人原液浓度稀释。然后在整个研究期间以同样 方式每周注射一次所述抗体和对照样本，共8次剂量。利用测径器大约 每7天测量一次肿瘤生长。在整个研究期间每周记录一次动物的体重。 研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的动物都采取安乐死。在人 乳腺癌的MDA-MB-231体内预防模型中，7BDI-58显著降低肺瘤生长。 移植后第55天，也是最后一次治疗给药后5天，7BDI-58治疗组的平均 肿瘤体积比緩冲液对照治疗组的肿瘤体积小91.2%(图8)。研究结束时 7BDI-58治疗组的肿瘤体积与对照的肿瘤体积有显著差异(p咱.0105， t-检验)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测量一次的体重是动物健 康和发育停止的指标。如图9所示，在整个研究期间对照或7BDI-58治 疗组的体重没有显著差异。治疗周期结束时两组间的体重也没有显著差异。
总之，7BDI-58在该人乳腺癌异种移植模型中被良好地并且降低了肿
瘤的负荷。
实施例4
单克隆抗体7BDI-58、 7BDI-60、 AR55A994.1和抗CD63抗体之间交叉反 应的测定
当利用7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1作为探针时，全细胞膜部 分和全细胞裂解产物的Western印迹结果显示与利用ARIUS'抗CD63单 克隆抗体7BD-33-llA、 1A245.6和H460-22-l获得结果的高相似性(图 10)。为了确定前面的抗体是否与CD63交叉反应，在免疫沉淀复合物的 Western印迹中使用它们作为探针，所述免疫沉淀复合物利用7BD-33-l 1A或者1A245.6从培养生长的细胞的全细胞膜部分获得。
简单来说，300微克的MDA-MB-231全细胞膜部分(l mg/mL终蛋白 浓度)与偶联7BD-33-llA的蛋白G琼脂糖珠在4。C孵育2小时。洗涤后 将所述珠在1 x非还原性十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE )样本緩沖液中煮沸，通过10%聚丙歸酰胺凝胶电泳分析样 本。在电转到PVDF膜上后，根据标准Western印迹步骤，所述印迹用 抗体7BDI-58、 AR51A994.1 、 7BD-33-11A以及IgGl和IgG2a同种型对 照作为探针检测。所有一抗在5微克/mL的工作浓度下使用。所获印迹 的图像(图ll)显示，,7BDI-58和AR51A994.1与7BD-33-llA抗体识别 的相同抗原交叉反应，因此它们特异与CD63结合。
为了确定抗体7BDI-60是否与CD63交叉反应，从ASPC-1细胞系分 离的全细胞膜部分制备人CD63和抗体1A245.5的免疫复合物。通过在非 还原性条件下的10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析免疫复合物以及将蛋 白电转到PVDF膜后，利用抗体7BDI-60、 1A245.6、抗CD63克隆H5C6 和IgGl同种型对照检测所述印迹。所有一抗在5微克/mL的工作浓度下 使用。图12显示除了同种型对照外，所有抗体与相同的抗原CD63交叉 反应。
为了进一步证实7BDI-58、7BDI-60和AR51A994.1之间针对人CD63 的交叉反应，在大肠杆菌表达的人CD63最大胞外环重组GST融合构建 体的Western印迹中使用所述抗体作为探针。简单来说，通过10%制备 性SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析5微克纯化的重组GST融合蛋白。转移 后，根据标准Western印迹步骤，用7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1 以及用抗CD63抗体7BD-33-l 1A、 1 A245.6和H460-22-l 、抗CD44抗体 (克隆H460-16-2)和用IgGl和IgG2a同种型对照抗体作为探针进行检测。 所有一抗在5微克/mL的工作浓度下使用。该实验的结果(图13)显示，除 了同种型对照外，所有抗体与人CD63最大胞外环的重组GST融合构建 体特异性交叉反应，因此表明7BDI-58、 7BDI-60和AR51A994.1与人 CD63特异结合。
实施例5人胰腺肺瘤组织染色
进行IHC研究以进一步(在S.N.10/603,006中初次^^开了胰腺癌的染 色)评价7BD-33-11A与人胰腺肿瘤组织的结合。此前进行IHC优化研究 以便确定进一步实验的条件。
组织切片在58。C烘箱中干燥1小时脱蜡，通过将组织切片5次浸泡 于染色缸中的二甲苯进行脱蜡，每次4分钟。经过一系列梯度乙醇洗涤 (100%-75%)处理后，切片在水中重新水合。将载玻片浸泡于pH值为6 的10 mM柠檬酸盐緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)中，随后分别用高、中、 低能量设置的微波炉加热载玻片5分钟，最后将其浸没在冷的PBS中。 随后将载玻片浸没在3%的过氧化氢溶液中6分钟，用PBS清洗3次，每 次5分钟，干燥，并在室温用通用封闭液(Dako, Toronto, Ontario)孵育5 分钟。用抗体稀释緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)将7BD-33-l 1A、单克 隆小鼠抗肌动蛋白(Dako, Toronto, ON)或同种型对照抗体(靶向黑曲霉 (As/ e^/〃M A7ge。葡萄糖氧化酶，该酶在哺乳动物组织中不存在或也不可 诱导；Dako， Toronto, Ontario)稀释至工作浓度(除了抗肌动蛋白抗体被 稀释到2微克/mL外，每种抗体都是5微克/mL)，并在室温孵育1小时。 用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟。用提供的HRP偶联的二抗(Dako Envision System, Toronto, Ontario)来4全测/显现一抗的免疫活性，室溫孵育 30分钟。在该步骤之后，用PBS清洗所述载玻片3次，每次5分钟，随 后加入DAB(3, 3'-二氨基联苯胺四盐酸盐，Dako, Toronto, Ontario)生 色团底物溶液，在室温下进行免疫过氧化物酶染色10分钟，发生颜色反 应。在自来水中洗涤所述载玻片以终止显色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75%-100%) 脱水并用二曱苯透明。用封固齐'J(Dako Faramount， Toronto, Ontario)在所 述载玻片上盖上盖玻片。使用Axiovert 200(Ziess Canada, Toronto, ON) 对载玻片进行显微检查，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga ON) 获取并存储数字图像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。
利用人胰腺的正常和肿瘤组织微阵列(Pentagen, Seoul, Korea)对32种 人胰腺肿瘤和4种正常胰腺组织进行抗体结合的检测。图14是人正常和 肿瘤胰腺组织阵列的7BD-33-11染色结果的汇总。每种肿瘤样本用两个点代表以克服组织异质性。2个点的平均分数作为最终肿瘤切片的分数。 对于4种非肿瘤组织中的每一种只提供1个点。
如图14所示，微阵列上7BD-33-11A与被测胰腺癌的总结合是 27/32(84%)。抗体在3/32中显示强(+++)染色，在7/32中显示中等(++)染 色，在9/32中显示弱(+)染色和以及在8/32中显示疑似(+/-)染色。所述结 合限于肿瘤细胞。细胞定位是细胞质和膜的，且具有颗粒状染色模式。 染色细胞的百分比表明了 7BD-33-llA与胂瘤细胞的不同结合，范围在小 于10%至大于50%之间。根据组织微阵列提供的胰腺肺瘤组织学类型， 7BD-33-l 1A对26/30(87%)的导管腺癌和1/2(50%)的内分泌癌存在结合。 对4/4(100%)的非肿瘤胰腺组织存在结合；所述结合是针对腺泡上皮细胞 和胰岛(图l5)。
根据胰腺肿瘤的组织学分级，所述抗体分别对切片分级为Gl、 G1-G2、G2、G2-G3、G3、G4的1/1(100%)、 2/3(67%)、 9/12(75%)、 2/2(100%)、 6/6( 100%)和1/1(100%)存在结合。对5/5(100%)未知等级的切片存在结合。 就胰腺癌的肺瘤TNM期而言，所述抗体分别对I、 II、 III和IV期的 1/1(100%)、 14/17(82%)、 1/1(100%)和10/11(91%)的切片存在结合。因此， 没有在抗体结合和不同的癌参数(组织学肿瘤类型，等级和TNM期)之间 发现联系。相关性的这种缺乏可能归因于代表一些癌症分期的小样本规 模。
7BD-33-11A抗原看起来在胰腺肿瘤组织表达。因此7BD-33-11A具
有作为治疗胰腺癌的治疗药物的潜力。
实施例6
抗体7BD-33-11A体外抗体依赖的细胞的细胞毒(ADCC)活性的证明
先前来自7BD-33-11A在预防性人乳腺癌模型上的体内治疗用途的 证据表明，ADCC是该抗体在所述动物模型中的体内活性的可能机制， 所述证据通过比较7BD-33-l 1A在SCID与NOD/SCID小鼠中的功效获得 (如在S.N. 60/642,057中所公开的)。通过体外细胞毒性分析进一步验证了 7BD-33-11A介导针对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的抗体依赖的细胞的 细胞毒性的能力。从BALB/cAJcrniT小鼠的脾脏获得小鼠效应细胞，并用小鼠IL-2(20 nM)刺激4天。粘附和非粘附的效应细胞被分离并用于体 外细胞毒性分析。从细胞培养板解离MDA-MB-231耙细胞，1000万个细 月包用40jitCi的Na251Cr04 (GE Healthcare Amersham Biosciences)标i己60分 邻并按每孔104个细胞加到96孔板中。就在以25:1的效应物靶标(E:T) 比例添加小鼠效应细胞前，将不同终浓度的7BD-33-llA或者IgG2a同种 型-配对对照添加到"Cr标记的靶细胞。37。C孵育4小时后，测量溶解细 胞释放的51Cr。每次分析重复3次，结果表示为特异性溶解的百分比， 其定义为(实验cpm-自发cpm)x 100/(最大cpm-自发cpm)。
该实验的结果(图16)清楚地表明7BD-33-llA利用粘附和非粘附的效 应细胞诱导特异性和剂量依赖的MDA-MB-231靶细胞溶解，而当耙细胞 在相同浓度的同种型-配对对照存在的条件下孵育时，没有观察到这种现 象。因此，该数据证明7BD-33-11A能够通过募集效应细胞活性介导 ADCC。
实施例7
MDA-MB-231异种移才直物中的巨喧细胞积聚
关于7BD-33-11A介导针对MDA-MB-231乳腺癌细胞系的抗体依赖 的细胞的细胞毒性的能力的其它证据来自利用免疫组织化学的体内研 九。
6至8周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入溶于100微升生理 盐水的5百万个人乳腺癌纟田胞(MDA-MB-231)。每周用测径器测量肝瘤生 长。当同组中的大多数达到100 mm、范围80-120 mm"的平均肿瘤体积 时，处死3只小鼠，收集它们的肿瘤，其中一部分保存在福尔马林和OCT 中。剩余的小鼠被分到治疗或者对照组，每组3只小鼠。分配后1天， 每组经腹腔给予稀释后体积为300微升的7BD-33-11A测试抗体(剂量为 15 mg/kg)或者緩冲液对照，所述稀释使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀释。 在3、 6或者IO次给予测试抗体或者对照后，每周给予3次，处死小鼠， 收集肿瘤并保存在福尔马林和OCT中。将肿瘤样本转移到多伦多综合医 院(Toronto General Hospital) (Toronto, ON)的病理学研究实'睑室(Pathology Research Lab)进行处理。
组织切片在58。C烘箱中干燥1小时脱蜡，通过将组织切片5次浸泡 于染色缸中的二曱苯进行脱蜡，每次4分钟。经过一系列梯度乙醇洗涤 (100%-75%)处理后，切片在水中重新水合。将载玻片浸没于pH值为6 的10 mM柠檬酸盐緩沖液(Dako, Toronto, Ontario)中，随后用高、中、低 能量设置的微波炉分别加热载玻片5分钟，最后将其浸没在冷的PBS中。 随后将载玻片浸没在3%的过氧化氬溶液中6分钟，用PBS洗涤3次，每 次5分钟，干燥，并在室温用通用封闭液(Dako, Toronto, Ontario)卵孚育5 分钟，抗生物素蛋白D封闭液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)室温 孵育15分钟以及生物素封闭液(Vector Laboratories, Burlingame, CA)室温 孵育15分钟。将抗Mac-3 (BD Bioscience, Oakville, ON)在抗体稀释緩冲 液(Dako, Toronto, Ontario)中稀释到其工作浓度(0.75孩吏克/mL),并在室温 孵育1小时。只与抗体稀释緩沖液孵育的载玻片被用作阴性对照。用PBS 洗涤所述载玻片3次，每次5分钟。利用生物素化的抗大鼠(BD Bioscience, Oakville, ON)来检测/显现一抗的免疫反应性。利用Vectastain EliteABC 试剂(Vector Laboratories, Burlingame, CA)斗企测颜色反应。在自来水中洗涤 所述载玻片以终止显色反应。用Meyer苏木精(Sigma Diagnostics, Oakville， ON)复染后，将所述载玻片用梯度乙醇(75%-100%)脱水并用二 甲苯透明。用封固剂(DakoFaramount， Toronto, Ontario)在所述载玻片上 盖上盖玻片。使用Axiovert 200 (Ziess Canada, Toronto, ON)对载玻片进 行显樣b险查，使用Northern Eclipse成像软件(Mississauga， ON)获取并存 储数字图像。由组织病理学家对结果进行读取、评分和解释。在100x放 大率(Ziess Axiovert 200M)下进行载玻片的扫描。随机选择5个不同热点 部位计数巨噬细胞(Mac-3阳性)。选择肺瘤内区域计数，同时避开外围密 集地带。在选择了欲计数的区域后，将放大率调整为400x，并利用 QImaging Retiga相才几和Northern Eclipse软件(Version 7.0)捕获图# 利用 Northern Eclipse的手动计数功能进行阳性细胞的手动计数。计数期间避 开坏死区和血管间隙。
胂瘤切片的检查显示了胂瘤相关巨噬细胞的3种分布模式。在肺瘤 外围和周围结缔组织之间存在条带样模式的外周侵润。所有7BD-33-11A治疗的肿瘤中这种模式都很明显，而緩沖液治疗的肿瘤中只有 一些较明 显。肿瘤细胞间还存在成群的聚集，最后，在肿瘤细胞之间或者环绕着 肿瘤细胞有分散的单个细胞的存在。
如图17所示，与緩冲液治疗相比，所有3个剂量的7BD-33-llA的 治疗导致更高的巨噬细胞积聚。最高的积聚发生在6次给药的样本，并 且在统计学上是显著的(p二0.047)。这与说明在6次给予7BD-33-llA后观 察到肿瘤生长抑制的最大百分比的数据是一致的。此外，当考虑到来自 全部3个剂量的数据时，巨噬细胞在7BD-33-l 1A治疗的肺瘤中的积聚也 是显著升高(p=0.037)。只与抗体稀释緩冲液孵育的全部样本均是阴性的。
因此，在MDA-MB-231异种移植物中，相对于緩沖液治疗的异种移 植物，7BD-33-11A治疗的异种移植物存在肿瘤相关巨噬细胞的显著积 聚。该数据支持先前关于ADCC作为7BD-33-11A的作用机制的证据。
实施例8
7BD-33-11A的人源4匕
由蛋白质设计实验室(Protein Design Labs) (PDL, Fremont, CA)基本 上根据Queen等的步骤(1989)进行7BD-33-UA的人源化操作。首先，鉴 定与7BD-33-l 1A的重链和轻链(分别为VH和VO可变区的氨基酸序列具 有高同源性的人可变(V)区。然后，CDR序列以及对于保持CDRs结构重 要的骨架氨基酸被移植到选择的人骨架序列。此外，被发现在相应人V 区亚群中非典型的人骨架氨基酸被共有氨基酸取代以减少潜在的免疫原 性。所获人源化的可变区在小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0中表达于IgGl和 IgG2M3 形式(分别为 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-l 1A陽IgG2M3(Vl 1L))中。
产生小鼠抗人CD63单克隆抗体的杂交瘤细胞系7BD-33-11A在 DMEM (HyClone, Logan， UT)中培养，所述DMEM包含10% FBS (HyClone， Logan, UT) 、 1% MEM-非必需氨基酸 (BioWhittaker, Walkersville, MD)、 0.1% 2-巯基乙醇(Sigma, St. Loms, MO)、 1%丙酮酸 #] (Invitrogen, Carlsbad, CA)、 1% L-谷氨酰胺(Invitrogen, Carlsbad, CA)。将小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0-Agl4 (ATCC, Manassus, VA;以下称为Sp2/0)在包含10%FBS的DMEM中培养利用蛋白G琼脂糖柱通过亲和 层析从培养上清纯化小鼠单克隆抗体7BD-33-11A>利用FluoReporter荧 光素-EX蛋白标记试剂盒(Molecular Probes, Eugene, OR)制备FITC偶联 的7BD-33-llA。最初从国立癌症研究所获得的人前列腺癌细胞系PC-3 在包含10% FBS的RPMI-1640 (BioWhittaker， Walkersville, MD)中培养。 所有细胞系均在37。C下于7.5%032培养箱中培养。
在Argo BioAnalytica, Inc. (Kenilworth, NJ)进行7BD-33-l 1A N端氨基 酸的测序。图18显示的所测氨基酸的序列与根据小鼠轻链和重轻链可变 区基因预测测的序列一致。
利用TRIzol试剂(Invitrogen, Carlsbad, CA, Burlington, ON)/人大约107 个7BD-33-11A杂交瘤细胞提取总RNA，并根据供应商的操作步骤利用 PolyATtract mRNA分离系统(Promega Corporation, Madison, WI)分离 poly(A)+RNA 按照供应商的操作步骤，利用SMART RACE cDNA扩增 试剂盒(BD Biosciences Clontech， Palo Alto, CA)合成双链cDNA。利用分 别与小鼠7和k链C区退火的3'引物以及SMART RACE cDNA扩增试 剂盒提供的5'通用引物，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增重链和轻链的可 变区 cDNAs 。 对于 VH PCR ， 3'引物具有序歹ll 5'-GCCAGTGGATAGACCGATGG-3'(SEQIDNO: 15)。对于V^PCR， 3'引 物具有序列5'-GATGGATACAGTTGGTGCAGC-3' (SEQ ID NO: 16)。 VH 和VL cDNAs被亚克隆入pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen, Carlsbad, CA) 以便序列测定。才艮据厂商的说明书，通过利用荧光双脱氧链终止剂 (Applied Biosystems， Foster City， CA)的PCR循环测序反应进行DNA测 序。在Model 3100基因分析仪(Applied Biosystems, Foster City, CA)上分 析测序反应。鉴定出与典型的小鼠轻链和重链可变区同源的独特序列。 发现VL和VH序列分别属于亚群I和IIA。编码轻链和重链可变区的cDNA 序列分别显示于图19和20。从cDNA序列分析推导的N端20个氨基酸 的序列与由对轻链和重链氨基酸测序确定的相应序列一致。
按照Queen等人(1989)公开的方法进行人源化抗体V区的设计。根 据序列同源性选择用作7BD-33-llACDRs受体的人V区骨架。计算机程 序ABMOD和ENCAD (Levht， 1983)被用于构建可变区的分子模型。被预测与CDRs接触的人源化V区的氨基酸用7BD-33-llA的相应残基取代。 将被发现在相同V区亚群中非典型的人源化V区中的氨基酸改变为共有 氨基酸以消除潜在的免疫原性。根据对人V和J区序列的同源性检索， 选择人V区AAR32409(Huang et al., 1997)和J片段JH6(Ravetch " a/., 1981)作为(hu)AR7BD-33-llA 重链可变区的骨架。对于 (hu)AR7BD-33-l 1A轻链可变区，使用人V区1LVE (Miura 2003)和 J片段JK2 (Hieter " a/.， 1982)。 7BD-33-l 1A的Vh和人受体AAR32409/JH6 之间的骨架氨基酸的同一性是77%，而7BD-33-11A的V^和人受体1L VE/JK2之间的同 一性是88%。
在计算机模型提示与CDRs有显著接触的骨架位置，来源于V区的 氨基酸被原始人骨架氨基S复取代。这发生在重链的残基30， 48， 67， 68, 70, 72,74,97和98。对于轻链，取代发生在残基22。相应的人V区亚群中 在其各自位置很少存在的骨架残基被在那些位置的人类共有氨基酸取 代。这发生在重链的残基38、 40和84。 7BD-33-llA、设计的 (hu)AR7BD-33-l 1A以及受体人的VL和VH的V区氨基酸序列的比对分 别显示于图21和22。
利用20 (对于轻链)或者22 (对于重链)个重叠的合成寡核苷酸构建和 扩增重链和轻链可变区基因，所述寡核苷酸大约40个碱基对长(Stemmer ^ a/., 1995)。将所述寡核苷酸退火，并利用Pfu Turbo聚合酶(Stratagene, LaJolla，CA)延伸以产生组装的双链全长V基因。利用Pfu Turbo聚合酶 通过PCR扩增组装的重链和轻链的V基因片段。用凝胶纯化PCR扩增 的片段，并用Mlul和Xbal消化，用凝胶纯化，再分别亚克隆入pVgl.D.Tt 或pVg2M3.D.Tt (Cole & "/.，997)和pVk (Co W a/, 1992)。质粒pVgl .D.Tt 类似于pVg2M3.D.Tt (Cole d a/.， 1997)，<旦它包含编码^1恒定区而不是？2 恒定区的基因组片段。利用Pfu Turbo聚合酶，通过用22个重叠寡核苷 酸的基于PCR的一步基因组装法导入单个氨基酸取代(Stemmer ^ a/.， 1995)，以产生一组(hu)AR7BD-33-llA VH变体(V24A, R38K和V24A, R38K)。使用高保真扩增聚合酶)(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)通过 重叠-延伸PCR进行定点诱变以产生另一组(hu)AR7BD-33-llA VH变体 (V11L、 120M和Q111A)。编码人源化Vl或者VH的基因被设计为小外显子(图23和24),所述小外显子包括信号肽、剪接供体信号以及用于后续 克隆入哺乳动物表达载体的适当的限制性内切酶位点。Vl和VH小外显子 中的剪接供体信号分别来源于相应的人种系JK和JH序列。人源化的 和VH小外显子中的信号肽序列来源于小鼠抗E/P选择素单克隆抗体 EP5C7的Vl和Vh区(He e/a/., 1998)。分别通过20和22个重叠的合成寡 核苷酸的延伸(图25和26)构建(hu)AR7BD-33-l 1A Vl和Vh基因，并进行 PCR扩增，如图27所示。将用于Vl的寡核苦酸1-20和用于Vh的寡核 苷酸1-22混合、退火并通过使用PfU Turbo DNA聚合酶的PCR延伸。通 过使用引物1和20(对于VJ或者1和22(对于VH)的PCR扩增获得的V 基因双链DNA组装物以并入侧翼的Mlul和Xbal位点。获得的V^基因 片賴j皮克隆入哺乳动物表达载体pVk (Co a/., 1992)以产生 pVk-(hu)AR7BD-33-11A 。 VH片分别#皮克隆入pVgl.D.Tt和 pVg2M3.D.Tt (Co d a/, 1997)以产生pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A和 pVg2M3-(hu)AR7BD-33-l 1A。
按照供应商的推荐利用脂质体转染(Lipofectamine)方法将 pVgl-(hu)AR7BD-33-llA 或 pVg2M3-(hu)AR7BD-33-l 1A 以及 pVk-(hu)AR7BD-33-llA共转染入293-H细胞以实现瞬时转染，所述 293-H细胞在包含2%低Ig FBS (HyClone, Logan, UT)的RPMI-1640中培 养。大约7"06个细胞与各15微克的轻链和重链质粒转染，所述质粒已 经与70微升的脂质体2000转染试剂形成复合物。细胞在C02培养箱中 孵育5-7天。
通过蛋白A琼脂糖柱层析纯化瞬时表达的(hu)AR7BD-33-llA.IgGl 和(hu)AR7BD-33-llA.IgG2M3抗体。在FACS竟争分析中4企测这两种抗 体对人CD63的亲和力。7BD-33-UA、 (hu)AR7BD-33-11A.IgGl和 (hu)AR7BD-33-11 A.IgG2M3抗体以浓度依赖的方式与FITC-偶联的 AR7BD-33-11A竟争。利用计算机软件GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, CA) 获得的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3抗体的ICso值分 别是7.02微克/mL、 25.3微克/mL和62.3孩i克/mL(图28)。 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl的亲和力比7BD-33-l 1A的亲和力低3.6倍。为了恢复人源化期间7BD-33-11A丧失的抗原结合亲和力，通过22 个重叠的合成寡核苷酸的延伸和PCR扩增(V24A和R38K)以及如图29 显示的定点诱变(V11L、 I20M和Q111A)，在VH中实现从人类残基到小 鼠残基的数个单氨基酸取代。对于每种突变体，中间的数字指示氨基酸 取代的位置，左边和右边的字母分别以单字母代码指示突变前后的氨基 酸。V24A和R38K突变体被组合以产生双氨基酸取代突变体(V24A, R38K)。六种VH突变体被克隆入如上所述的pVgl。
六种变异的(hu)AR7BD-33-llA IgGl抗体在293-H细胞中瞬时表 达，并通过蛋白A琼脂糖柱层析纯化，利用FACS竟争方法分析它们对 人CD63的亲和力。所述六种抗体以浓度依赖的方式与FITC-偶联的 7BD-33-l 1A竟争。它们的ICM)值显示于图28中。在它们中间，只有VI1L 变异体与CD63的结合高于野生型和其他变异抗体。在 VH((hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)) 中携带 VI1L 取代的 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl抗体的亲和力在7BD-33-l 1A的亲和力的3倍以 内。
如上所述产生携带 V11L 突变的重链表达载体 pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A (pVgl-(hu)AR7BD-33-l 1A (VI 1L))。为了表达 (hu)AR7BD-33-llA画IgG2M3(VllL), 将携带 VI1L 突变的 (hu)AR7BD-33-llA Vh基因克隆入如上所述的pVg2M3.D.Tt (Cole d 1997)，产生pVg2M3-(hu)AR7BD-33-llA. V11L。轻《连恒定区来源于人种 系k片段(Hieter " a/., 1980)重链分别来源于人种系(Ellison & a/., 1982) 和人 72M3 (Cole " a/, 1997)片段。应注意到 pVg2M3(hu)AR7BD-33-llA.VllL中编码的下2M3重链的倒数第二个残基 是甘氨酸，甘氨酸是比Cole等人(1997)使用的丝氨酸更典型的残基。人 巨细胞病毒主要的立即早期启动子和增强子启动轻链和重链基因的表 达。选择标志(g;^基因)的表达由SV40早期启动子启动。如图30所示的 最终质粒的总体结构通过限制性酶切图语进行验证。轻链和重链基因的 可变区和恒定区外显子的序列通过核苦酸测序来验证。
为 了得到稳定产生(hu)AR7BD-33-11A-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)的细胞系，通过电穿孔将相应的重链和轻链表达载体引入小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0的染色体。基本上按照Co 等人(1992)的描述通过电穿孔进行到Sp2/0的稳定转染。转染前，利用Fspl 使表达载体线性化。将大约107个细胞分别与25微克和50微克的线性化 的轻链和重链质粒共转染。在包含10% FBS (HyClone, Logan, UT)的 DMEM (BioWhittaker， Walkersville， MD)中悬浮转染的细胞，然后按照100 微升/孔接种入几个96孔板。48小时后，每孔加入100微升选择培养基(包 含10% FBS、 HT培养基添加剂(Sigma， St. Louis, MO)、 0.5 mg/mL黄噤呤 (Sigma， St. Louis, MO)和2.4微克/mL霉酚酸(Sigma, St. Louis, MO的 DMEM)。选4奪开始后大约10天，通过ELISA分析培养上清中的抗体生 成。Immulon 4 HBX免疫分析4反(ThermoLabsystems, Franklin, MA)用100 微克/孔的1微克/mL的AffiniPure山羊抗人IgG Fc7-链特异性多克隆抗 体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)在4°C包被 过夜，所述抗体溶于pH为9.4的0.2M碳酸钠-碳酸氢钠緩沖液中。所述 板用洗涤緩冲液(包含0.1%吐温-20的PBS)洗涤，再用300微升/孔的溶 于TBS的SuperBlock封闭緩冲液(Pierce Biotechnology, Rockford, IL)室温 下封闭30分钟。用洗涤緩沖液洗涤后，将包含(hu)AR7BD-33-UA的样 本适当稀释于ELISA緩冲液(包含1% BSA和0.1%吐温20的PBS)中， 并按照100微升/孔加入ELISA板。使用人源化的IgGl， k抗体 HuAIP12(Protein Design Labs, Inc.; WO 2004/101511A2)和嵌合的 IgG2M3， k抗体OKT3 (Colee,a/, 1997)作为标准品。室温下孵育所述板 1.5小时并用洗涤緩沖液洗涤后，使用100微升/孔的HRP-偶联的 AffiniPure 山羊抗人IgG Fc下-链特异性多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, PA)的1:1000牙希jf奪液冲企测 结合的抗体。室温下孵育1小时并用洗涤緩沖液洗涤后，按照100微升/ 孔添加ABTS过氧化物酶底物/过氧化物酶溶液B (KPL, Inc., Gaithersburg, MD)进行显色。室温下孵育4分钟后，通过添加100微升/ 孔的2%草酸终止显色。利用VersaMax微板读数仪(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)在415 nm处读耳又吸光度。
高产的Sp2/0转染子，Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)(克隆 弁18)和Sp2/0-(hu)AR7BD-33-UA-IgG2M3(VllL)(克隆#5)，在包舍10%FBS的DMEM中扩增，然后在包含1%低Ig FBS (HyClone， Logan, UT) 的无蛋白基础培养基-2 (Protein-Free Basal Medium-2, PFBM-2) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer et al. (2000))中适应并扩增生长， 一直生长到衰 竭所述PFBM-2添加有无蛋白添加培养基-3 (Protein-Free Feed Medium-3: PFFM-3) (Protein Design Labs, Inc.; Sauer et al. (2000))。
为 了 i正实轻链和重《连 mRNA 序列， 从 Sp2/0(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL) ( 克 隆 #18) 和 Sp2/0(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)(克隆#5)分离总RNA。利用总 RNA作为模板并且用随机的六脱氧核苷酸作为引物，通过Superscript Preamplification System (Invitrogen， Carlsbad, CA)合成第一链cDNA按月g 供应商的操作步骤使用Superscript II逆转录酶进行反应。使用分别结合 5'和3'非编码区的5'和3'引物，通过PCR扩增包含(hu)AR7BD-33-llA轻 链或重链的完整编码区的DNA片段。引物序列显示如下
轻链和重链的5'引物
mbr3 5'-CCATAGAAGACACCGGGACC-3' (SEQ ID NO: 17) 轻链的3'引物
mcl21 5'-AGGTGCAAAGATTCACTT-3' (SEQ ID NO: 18) 重链的3'引物
mcl24 5'-TCCCGTCGCGACCCACG-3' (SEQ ID NO: 19)
将扩增的片段用凝胶纯化，并利用合适的引物将其进行测序。轻链 和重链的测定序列在每个核普酸位置都与
(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgGl(Vl lL)和(hu)AR7BD-33-l 1 A-IgG2M3(Vl 1L)的 已知编码序列一致(图31、 32和33)。
通过在90% FBS (HyClone， Logan, UT> 10% DMSO (Sigma, St, Louis, MO)中冷冻 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA.VllL.Gl (克隆#18)和 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA.VllL.G2M3 (克隆#5)转染子制备了 10个小^f瓦 的种子库。每个小瓶包含大约5xl(^个细胞。每个种子库中的1个小瓶被 解冻并在PFBM-2中生长，将细胞培养物送出进行支原体检测(Bionique Testing Laboratories, Saranac Lake, NY)。 DNA荧光染料分析和直接培养 法均显示是支原体污染阴性的。(Hu)AR7BD-33匿l lA画IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗体在293-H细胞中瞬时表达，或者 在如下所述的 S p 2 / 0 细胞中稳定表达。 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)(克隆弁18)和 Sp2/0-(hu)AR7BD-33-llAIgG2M3(VllL)(克隆#5)在滚瓶(每个滚瓶400 mL)中中扩增至在包含1。/。低IgFBS的PFBM-2中的0.8升。在Protein A Sepharose(蛋白A琼脂糖)上通过亲和层析从用过的培养上清中纯化 (hu)AR7BD-33-l lA-IgGl(Vl lL)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)单 克隆抗体。离心及过滤后，来自瞬时或者稳定转染子的培养上清加载于 HiTrap Protein A HP柱(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)上。在用20 mM柠檬酸钠緩冲液(pH 3.5)洗脱该抗体前，用含有150 mM NaCl的20 mM柠檬酸钠緩沖液(pH 7.0)洗柱。洗脱的混合部分用1.5M柠檬酸钠緩 沖液(pH 6.5)中和。用PBS透析蛋白，然后在4。C保存前将其经过0.2微 米滤器过滤。通过测量280 nm处的吸光度确定抗体浓度(l mg/mL=1.4 A280)。 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)的产量是50 mg, (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)的产量是22 mg。然后通过按照标准 程序进行的SDS-PAGE分析抗体。按照供应商推荐的还原和非还原性条 件，在NuPAGE样本还原剂(Invitrogen, Carlsbad， CA)存在或不存在的情 况下分别将7BD-33-llA、 (hu)AR7BD扁33-l 1 A-IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗体在70。C加热10分钟。然后，在 NuPAGE MES SDS电泳緩冲液(Invitrogen, Carlsbad, CA)中，抗体在 4隱12%的Bis-Tris NuPAGE凝胶(Invitrogen, Carlsbad, CA)中于200伏特下 跑20分钟。作为蛋白标准品，广范围的SDS-PAGE标准品(BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA)在还原条件下泳动。室温下凝胶用SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, CA)染色过夜，然后在室温下用1120脱色 过夜。非还原条件下的SDS-PAGE分析(图 3 4 )表明 (hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗体的分子量大约为150至160 kDa。还原条 件下的分析表明(hu)AR7BD-33-UA(VUL)抗体由一条分子量大约为50 kDa的重4连和一条分子量大约为25 kDa的轻链组成。然后通过体积排阻 色谱法(Size exclusion HPLC)分析纯度。利用Vanon HPLC系统进行体积排阻HPLC,所述系统由Rainin柱加热器CH-1型、Dynamax溶剂递送系 统SD200型和Knaver可变波长监浮见器组成使用Varian Prostar/Dynamax 0.24系统控制5.51版软件控制自动进样器、泵和检测器，以及获得、保 存和处理数据。利用串联连接的两个TosoHaas TSK-GEL G3000SWXL体 积排阻HPLC柱(7.8 mmx300 mm, 5微米粒径，250A孔径；TosoHaas， Montgomery ville, MD)实现分离。流动相是pH 7.4的PBS，流速为1.5 mL/ 分钟。用分光光度计测量法在280 nm处监测柱洗脱液。利用体积排阻 H P L C测定的抗体纯度看起来大于9 5 % (图 3 5)。
通过FACS竟争方法分析(hu)AR7BD-33-llA(VllL)抗体对人CD63 的亲和力，所述抗体已经从稳定转染子的培养上清中纯化。用无菌PBS (BioWhittaker, Walkersville, MD)洗涤PC-3细胞三次。在37。C的〔02培养 箱中，将所述细胞在包含2.5 mM EDTA的HBSS(BioWhittaker, Walkersville,MD)培养基中孵育5-7分钟以使细胞脱离。再用FACS染色 緩沖液(FSB)(包含0.5% BSA的PBS(Sigma, St, Louis, MO》洗涤细胞三 次。细胞的最后一次洗涤在V形底的96孔分析板(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)中进行，随后弃掉上清。每次试-验中每孔含 有105个细胞。按照100微升/孔将FITC偶联的7BD-33-llA(15微克/mL 终浓度)和竟争抗体(7BD-33-l 1A或者(hu)AR7BD-33-l 1A，从终浓度400 微克/mL开始，并连续稀释3倍)的混合物加入到分析板中的细胞沉淀， 并在4。C孵育1小时。将细胞在FSB中洗涤三次，然后在200微升1%的 多聚曱醛溶液中重悬该沉淀，并在双激光FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences Immunocytometry Systems, San Jose, CA)上通过ifL式纟田月包术^j" 所述细胞进行分析。7BD-33-llA、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL)和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(VllL)抗体以浓度依赖的方式与FITC偶联 的7BD-33-l 1A竟争。如图36所示，利用计算机软件GraphPad Prism获 得 的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(VllL) 和 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)的平均IC50值分别是6.83微克/mL、 12.7微克/mL和38.8微克/mL。 FACS竟争分析的代表性结果显示于图 37 中 。 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl(Vl 1L) 和
(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3(Vl 1L)对人CD63的相对结合比7BD-33-l 1A对人CD63的相对结合大约低1.9倍和5.7倍。先前已经显示IgG2亚类 抗体的亲和力比IgGl亚类抗体的亲和力低2至3倍(Cole a/., 1997; Morelock d 1994)，在本文观察到(hu)AR7BD-33-l 1A-IgGl(Vl 1L)和 (hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L)抗体之间相同的亲和力差异。人源化 的(hu)AR7BD画33-l lA-IgGl(Vl 1L)和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3(Vl 1L) 抗体在后面分别被称为 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl 和 (hu)AR7BD-33-l 1A陽IgG2M3。
实施例9
A2058细胞的体内肿瘤实验
参考图38和39， 4至6周大的雌性SCID小鼠经颈背皮下注射植入 溶于100微升生理盐水的500,000个人黑素瘤细胞(A2058)。这些小鼠被 随机分成4个治疗组，每组8只小鼠。移植后1天，每组小鼠经腹腔给 予稀释后体积为 300微升的 2 mg/kg的 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-22-llA-IgGl、 (hu)AR7BD-22-l 1A-IgG2M3测试抗体或緩冲 液对照，所述稀详奪使用含有2.7 mM KC1、 1 mM KH2P04、 137 mM NaCl 和20 mM Na2HP04的稀释剂从原液浓度稀释。然后在整个研究期间以同 样方式每周给予一次所述抗体和对照样品。大约每7天用测径器测量一 次肺瘤生长。因为抗体的供给问题，用(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3治疗 的组总共接受3次给药。该研究在34天后终止，因为动物由于大溃疡性 损伤达到CCAC的终点。在这个时间点，对照组、7BD-33-11A和 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl治疗组已经接受6次给药。在整个研究期间每 周一次记录动物的体重。研究结束时，依据CCAC的指导方针，所有的 动物都采取安乐死。
在建立的人黑素瘤A2058体内模型中，小鼠7BD-33-11A和 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl抑制肿瘤生长。图38显示与緩沖液对照相比， 2 mg/kg的3种抗体对肺瘤生长的影响。第27天，当治疗组的所有小鼠 都存活时，7BD-33-11A 降低56%的月中瘤生长(p=0.0086)， (hu)AR7BD-33-UA-IgGl 降低 63%的月中瘤生长(p=0.0016) 而 (hu)AR7BD-33 -11 A-IgG2M3对肺瘤生长没有显著的影响(10%的胂瘤抑制)。这些结果证明人源化的IgGl保留了鼠科的抗体的功效，但lgG2M3 形式的功效显著下降。这种观察到的降低至少可以部分归因于IgG2M3 治疗组接受的较少次数的给药，或者该同种型的较低亲和力(参见上面)。
在整个研究期间没有临床毒性症状。每周测得的体重用做动物健康 和发育停止的指标。图39显示整个研究期间各治疗组的体重结果。，在 第27天或者研究结束时(第34天)，来自任何抗体治疗组的小鼠的体重与 緩沖液对照组的体重相比都没有显著变化。
总之，在A2058黑素瘤模型中，(hu)AR7BD-33-llA-IgGl显示了与 鼠科的抗体相同或者比其更高的功效。相反，在该人A2058黑素瘤模型 中(hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3嵌合抗体不抑制肺瘤生长。此外，鼠科抗 体和人源化抗体看起来被小鼠良好地耐受。
实施例10
7BD-33-llA、 1A245.6 、 H460-22扁l 、 Chu)AR7BD-33 - 11A-IgGl和 (hu)AR7BD-33 - 11A-IgG2M3对CD63的结合亲和力的测定
通过测定 7BD-33-11A 、 1A245.6 、 H460-22-l 以及 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3在结合到细菌表 达和纯化的人CD63细胞外结构域2 (GST-EC2)的重组蛋白GST融合构 建体后的各自的解离常数的来比较它们的结合亲和力。
使用标准胺偶联步骤固定抗GST抗体。通过注射35 mL包含0.05 M NHS和0.2 M EDC的混合物(溶于H20中)活化CM5传感器芯片(Biacore， Uppsala， Sweden)的表面。注射浓度为30 mg/mL溶于10 mM醋酸钠(pH 5.0)的抗GST抗体，直到捕获50,000 RU至100,000RU。最后，注射35 mL 1.0 M的盐酸乙醇胺以封闭传感器芯片表面的任何活化位点。注射5 mg/mL的GST-EC2 (25 mL),随后注射25至50 mL的所述抗体。通过 20 mM甘氨酸(pH 2.2)的两次10 mL脉冲的应用实现传感器芯片表面的再 生以用于随后的注射。连续地注射浓度从12.5至200 nM变动的抗体。 作为对照，在捕获GST而不是GST-EC2的表面上注射每种抗体浓度。 根据测定的稳态结合水平来计算不同抗体对EC2的亲和力。对于每条传 感器曲线(sensorgram),在抗体注射结束前20秒提取报告点(Req)。对于每种抗体浓度，从在GST-EC2上注射抗体获得的Req中减去在GST上 注射抗体获得的Req。确定Req/Conc对Req的曲线的斜率，其代表结合 常数(KA)。解离常数(KD)计算为KA的倒数。利用Biacore 2000系统 (Biacore, Uppsala， Sweden)进行所述实验。该实验得到的7BD-33-llA、 H460-22-l和1A245.6的KD值分别为135 nM、 42 nM和10 nM(图40), 从而表明在该研究使用的抗体中7BD-33-IIA的亲和力最低。它也表明人 源化抗体(hu)AR7BD-33-llA-IgGl和(hu)AR7BD-33-l 1A-IgG2M3的亲和 力高于亲代的鼠科的7BD-33-11A的亲和力。这些结果不同于实施例8 中报道的那些结果。所述结果中的差异可以部分归因于下述因素。首先， 使用了 FACS对表面等离子体共振的不同的方法学。其次，在实施例8 中使用PC-3细胞，而在实施例10中，使用细菌表达的重组CD63。这两 个来源会体现CD63的构象或者糖基化形式的轻度差异。
此优势证据表明，AR51A994.1、 7BDI誦58、 7BDI-60、 H460-22-l、 7BD-33-llA、 (hu)AR7BD-33-llA-IgGl和1A245.6通过CD63上存在的 表位的连接来介导抗癌作用。在实施例4中已经显示，AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-11A抗体可以用于免疫沉淀来自诸如 MDA-MB-231细胞的表达细胞的同源抗原。此外还表明，利用例如但并 不限于FACS、细胞ELISA或IHC等技术，AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60 、 7BD-33-11A 、 (hu)AR7BD-33-l lA扁IgGl 和 (hu)AR7BD-33-llA-IgG2M3抗体可以用于4企测表达与之特异性结合的 CD63抗原部分的细胞和/或组织。
因此，利用FACS、细胞ELISA或者IHC分析，可以显示免疫沉淀 的AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-l 1A抗原能够抑制任一种 抗体对这类细胞或者组织的结合。此外，就象AR51A994.1、 7BDI-58、 7BDI-60和7BD-33-l 1A抗体一样，其他抗CD63抗体可以用于免疫沉淀 和分离其他形式的CD63抗原，并且利用相同类型的分析，所述抗原也
本说明书中提及的所有专利和公开出版物代表了本发明所属领域的 技术人员的水平。所有专利和公开出版物通过引用的方式并入本文，其 弓1用程度如同每个出版物被特别单独地指明以引用的方式并入本文。应该明白，尽管本发明以某种形式被说明，但这不是要将本发明限 定在本文所描述和显示的特定形式或布局。对本领域的技术人员显而易 见的是，在不偏离本发明的范围的前提下还可做出各种变化，且不应当 认为本发明限于本说明书中显示和描述的内容。本领域的技术人员很容 易看出使本发明较好地适合实现所描述的目的并获得提及的结果和益 处，以及其中固有的部分。本文中描述的任一寡核香酸、肽、多肽、生 物相关化合物、方法、流程和技术都是优选实施方案中有代表性的，其 目的在于示例，并不是限制本发明的范围。本领域的技术人员能够想到 包括在本发明精神的范畴内的变化和其它用途，并由所附权利要求书的 范围所限定。尽管借助特定的优选实施方案描述了本发明，但是应理解
描述的实施本发明的方式的各种变化，对本领域的技术人员来说是显而 易见的，均在所附权利要求书的范围内。为专利^呈序的微生物《呆藏耳5^得国卩示7"P:i人的布达《風其开条纟勺
国际表
丰艮J居第7.3条发布的纟散生物^f呆藏i正明以及 才、艮J居第10.2条发布的微生物存^舌声明
(译文)
致(保藏人成代理人名称及地址)
Arius Research Inc.(阿里乌斯研究公司)
代理人Jean de Sousa-Hitzler
55 York Street 16th Floor
Toronto, Ontario
Canada M5J 1R7
(加拿大多伦多)
代表Anus Research Inc.(阿里乌斯研究公司)而保藏 保藏人标识号
小鼠杂交瘤细胞系H460-16-2 小鼠杂交瘤细胞系H460-22-1 小鼠杂交瘤细胞系7BDI-60
专利保藏指定 PTA-4621 PTA-4622 PTA-4623
所述保藏附有以下说明的_科学性描述_建议的分类描述。
本国际保藏机构丁- 2002年9月4日收到所述保藏，并且所述保藏己被接受。 应您的耍求1 我们旌向您通知30年内对所述齒种的诺求。
如果布达佩斯条约成员国专利W证明某人有权收到该齒—种，成者如果匕出版引用该齒种的关国专 利，且美国专利与商标局成本保减人指示ATCC释放该齒种，那么将可获得该齒种。
如X该培养物在所述保藏的有效期内死亡成被破坏，那么您将负有川相冋的活培养物代替它的责 任。
在G保藏日起至少30年内，成者在最近的样品诺求之后5年内，该齒种将被维持，所述时间以 较L;者为准。美国和其他很多国家都是布达佩斯条约成员国。
于2002年9月6日检测以上所引用培养物的存活。在当天，所述培养物是存活的。
国际保藏机构American Type Culture Collection(美国典荆微生物保藏中心)，Manassas, VA 20110-2209 USA(美国弗吉尼亚)
ATCC授权代忐签字
____曰助2002年10月9 U
Ferris Lander先生
巻-;):2056.009 &关W序列"09/72736]为专禾lJ禾呈序的微生物《呆藏耳JU寻国际7"^i人的布达f風其斤条纟勺
国际表
才、艮J居第7.3条发布的f散生物^f呆藏i正明以及 才、艮J居第10.2条发布的^效生物存;、舌声明
(译文)
致(保藏人或代理人名称及地址)
Arius Research Inc.(阿里乌斯研究公司)
f^理人LisaCechetto
55 York Street, 16th Floor
Toronto, ONM5J 1R7
Canada
(加拿大多伦多) 代表Arius Research Inc.(阿里乌斯研究公司)而保藏
保藏人标识号 小鼠杂交瘤细胞系1A245.6
所述保藏附有以下说明的_科学性描述_建议的分类描述。
本国际保藏机构于2003年1月8闩收到所述保藏，并且所述保藏已被接受。
应您的要求L 我们旌向您通知30年内对所述菌种的请求。
如果布达佩斯条约成员国专利局证明某人有权收到该菌种，或者如果已出版引用该菌 种的美国专利，且美国专利与商标局或本保藏人指示ATCC释放该菌种，那么将可获 得该菌种。
如果该培养物在所述保藏的有效期内死亡或被破坏，那么您将负有用相同的活培养物 代替它的责任。
在自保藏闩起至少30年内，或者在最近的样品请求之后5年内，该菌种将被维持， 所述时间以较长者为准。关国和其他很多国家都是布达佩斯条约成员国。
于2003年1月27 R检测以上所引用培养物的存活。在当天，所述培养物是存活的。
国际保藏机构American Type Culture Collection(关国典型微生物保藏中心)， Manassas, VA 20110-2209 USA(美国弗吉尼亚)
ATCC授权代表签字
_ 眺2003年2 W Ij己
Ferris Lander先生 巻"2056.018
专利保藏指定 PTA-4889为专禾，J禾呈序的微生物l呆藏耳又《尋国P示7T"人的布达f風其斤条纟勺
国际表
才、艮J居第7.3条发布的微生物〗呆藏i正明以及 丰艮J居第10.2条发布的f散生物存;、舌声明
(译文)
致(保藏人或代理人名称及地址)
Arius Research Inc.(阿里乌斯研究公司)
代理人LisaCechetto
55 York Street, 16th Floor
Toronto, ONM5J 1R7
Canada
(加拿大多伦多) 代表Arius Research Inc.(阿里乌斯研究公司)而保藏 保藏人标识号
小鼠杂交瘤细胞系7BD-33-11A
所述保藏附有以下说明的_科学性描述_建议的分类描述。
本国际保藏机构于2003年1月8 R收到所述保藏，并且所述保藏己被接受。
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如果布达佩斯条约成员国专利局证明某人有权收到该菌种，或者如果已出版引用该菌 种的美国专利，且美国专利与商标局或本保藏人指示ATCC释放该菌种，那么将可获 得该菌种。
如果该培养物在所述保藏的有效期内死亡或被破坏，那么您将负有用相同的活培养物 代替它的责任。
在自保藏H起至少30年内，或者在最近的样品请求之后5年内，该菌种将被维持， 所述时间以较长者为准。美国和其他很多国家都是布达佩斯条约成员国。
于2003年1月19闩检测以上所引用培养物的存活。在当天，所述培养物是存活的。
国际保藏机构American Type Culture Collection(美国典型微生物保藏中心)， Manassas, VA20110-2209 USA(美国弗吉尼亚)
ATCC授权代表签字
__N期2003年2爿11 II
Ferris Lander先生 巻'4: 2056.018
专利保藏指定 PTA-4890加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 电话(204)789-2070
R3E 3R2_传真(204)789-2097
国际IDAC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(根据布达佩其开条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与活存声明的副本 1 、 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址 ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司) 提交日期2005年12月14闩
2、 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号
7BDI-58
由该国际保藏机构给予的保藏号:
141205-01
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3、国际保藏机构IDAC授权代表^^
圆:2005年12月14 1:1加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 电话(204)789-2070
R3E 3R2_传真(204)789-2097
国际ID AC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩其斤条约第10.2条发布)
致
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1.保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽、
地址ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司)
2.保藏标识:
由国际保藏机构给予的保藏号141205-01
保藏闩期(或最近相关闩期)2005年12月14闩
3.存活检测
于(最近检测円期)对以上标识的微生物进行存活检测 在以上指出的闩期，所述微生物
0存活
□不再存活
进行存活检测的条件(在已请求该信息且检测结果为阴性时填写):
4.国际保藏机构授权代表签字:
隐2006年1月9 R加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 电话(204)789-2070
R3E 3R2_传真(204)789-2097
国际IDAC/BP/4表
微生物保藏证明(译文)
(根据布达佩其斤条约第7.1条发布)
所附文件为原始保藏合同与活存声明的副本
1. 国际保藏机构接受了以下具体描述的微生物 保藏人姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
;t也i止 ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON, M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司) 提交闩期2005年12月14闩
2. 保藏的标识
保藏人对培养物指定的名称和符号
AR51A994.1
由该国际保藏机构给予的保藏号:
141205-06
以上标识的保藏附有
□科学性描述
□建议的分类指定
3.国际保藏机构IDAC授权代表签！
闩期2005年12月14闩加拿大公共卫生部国立微生物学实验室
加拿大马尼托巴省温尼伯市阿林顿街1015 电话(204)789-2070
R3E3R2_传真(204)789-2097
国际IDAC/BP/9表
微生物保藏存活证明译文
(根据布达佩其斤条约第10.2条发布)
致
姓名Ferris Lander先生
地址2855 PGA Boulevard, Palm Beach Gardens, Florida, USA 33410
(美国佛罗里达)
1.保藏人
姓名Valerie Harris (哈里斯'瓦莱丽)
地址ARIUS Research Inc., 55 York Street, Suite 1600, Toronto, ON, M5J 1R7
(加拿大多伦多阿里乌斯研究公司)
2.保藏标识
由国际保藏机构给予的保藏号141205-06
保藏闩期(或最近相关n期)2005年12月14 R
3.存活检测:
于(最近检测日期)对以上标识的微生物进行存活检测 在以上指出的闩期，所述微牛:物
0存活
□不再存活
进行存活检测的条件(在已请求该信息且检测结果为阴性时填写): 4.国际保藏机构授权代表签字_
闩期2006年1月09闩
权利要求
1. 分离的单克隆抗体，所述抗体由以保藏号141205-01保藏在IDAC的克隆编码。
2. 如权利要求1所述的抗体，所述抗体是人源化的。
3. 如权利要求l所述的抗体，所述抗体是嵌合的。
4. 由以保藏号141205-01保藏在IDAC的分离的克隆。
5. 引发抗体诱导的选自人类肺瘤的组织样本中癌细胞的细胞毒性作 用的方法，其包括提供来自所述人类肿瘤的组织样本；提供由以保藏号141205-01保藏在IDAC的克隆编码的分离的单克隆 抗体或者其细胞的细胞毒性诱导配体，所述配体的特征在于具有竟争性 抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及将所述分离的单克隆抗体或者其细胞的细胞毒性诱导配体与所述组 织样本接触；其中所述分离的单克隆抗体或者其细胞的细胞毒性诱导配体与所述 组织样本的结合诱导细胞的细胞毒性作用。
6. 如权利要求1所述的分离的单克隆抗体的配体。
7. 如权利要求2所述的人源化抗体的配体。
8. 如权利要求3所述的嵌合抗体的配体。
9. 如权利要求1、 2、 3、 6、 7或者8中的任一项所述的分离的抗体 或配体，所述抗体或配体与选自细胞毒部分、酶、放射性化合物和造血细胞的成员偶联。
10. 治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类 肿瘤的方法，其中所述人类肺瘤表达与分离的单克隆抗体或者其细胞的 细胞毒性诱导配体特异结合的抗原，所述分离的单克隆抗体由以保藏号141205-01保藏在IDAC的克隆编码，所述配体的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所 述哺乳动物有效诱导细胞的细胞毒性作用从而减轻所述哺乳动物的肿瘤负荷的量的所述单克隆抗体或者所述其细胞的细胞毒性诱导配体。
11. 如权利要求10所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体与细胞 毒部分偶联。
12. 如权利要求11所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
13. 如权利要求IO所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体活化补体。
14. 如权利要求10所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体介导抗 体依赖的细胞的细胞毒性作用。
15. 如权利要求IO所述的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
16. 如权利要求IO所述的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合的。
17. 分离的单克隆抗体，所述抗体由以保藏号141205-06保藏在 ID AC的克隆编码。
18. 如权利要求17所述的抗体，所述抗体是人源化的。
19. 如权利要求17所述的抗体，所述抗体是嵌合的。
20. 由以保藏号141205-06保藏在IDAC的分离的克隆。
21. 引发抗体诱导的选自人类肿瘤的组织样品中癌细胞的细胞毒性 作用的方法，其包括提供来自所述人类肿瘤的组织样本；提供由以保藏号141205-06保藏在IDAC的克隆编码的分离的单克隆抗体或者其细胞的细胞毒性诱导配体，所述配体的特征在于具有竟争性 抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及将所述分离的单克隆抗体或者其细胞的细胞毒性诱导配体与所述组 织样本4妄触；其中所述分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性诱导配体与所述组 织样本的结合诱导细胞的细胞毒性作用。
22. 如权利要求17所述的分离的单克隆抗体的配体。
23. 如权利要求18所述的人源化抗体的配体。
24. 如权利要求19所述的嵌合抗体的配体。
25. 如4又利要求17、 18、 19、 22、 23或24中的任一项所述的分离的 抗体或抗原配体，所述抗体或抗原配体与选自细胞毒部分、酶、放射性 化合物和造血细胞的成员偶联。
26. 治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类 肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤表达与分离的单克隆抗体或其细胞的细 胞毒性诱导配体特异结合的抗原，所述分离的单克隆抗体由以保藏号 141205-06保藏在1DAC的克隆编码，所述配体的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所 述哺乳动物有效-誇导细胞的细胞毒性作用^v而减轻所述哺乳动物的肿瘤 负荷的量的所述单克隆抗体或所述其细胞的细胞毒性诱导配体。
27. 如权利要求26所述的方法，其中所述单克隆抗体或者配体与细 胞毒部分偶联。
28. 如权利要求27所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位素。
29. 如权利要求26所述的方法，其中所述单克隆抗体或者配体活化 补体。
30. 如权利要求26所述的方法，其中所述单克隆抗体或者配体介导 抗体依赖的细胞的细胞毒性作用。
31. 如权利要求26所述的方法，其中所述单克隆抗体是人源化的。
32. 如权利要求26所述的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合的。
33. 分离的单克隆抗体，所述抗体由以保藏号PTA-4623保藏在 ATCC的克隆编码。
34. 如权利要求33所述的抗体，所述抗体是人源化的。
35. 如权利要求33所述的抗体，所述抗体是嵌合的。
36. 由以保藏号PTA-4623保藏在ATCC的分离的克隆。
37. 引发抗体诱导的选自人类紳瘤的组织样品中癌细胞的细胞毒性作用的方法，其包括提供来自所述人类肿瘤的组织样本；提供由以保藏号PTA-4623保藏在ATCC的克隆编码的分离的单克 隆抗体或者其细胞的毒性诱导配体，所述配体的特征在于具有竟争性抑 制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力；以及将所述分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性诱导配体与所述组织 样本接触；其中所述分离的单克隆抗体或其细胞的细胞毒性诱导配体与所述组 织样本的结合诱导细胞的细胞毒性作用。
38. 如权利要求33所述的分离的单克隆抗体的配体。
39. 如权利要求34所述的人源化抗体的配体。
40. 如权利要求35所述的嵌合抗体的配体。
41. 如权利要求33、 34、 35、 38、 39或40中的任一项所述的分离的 抗体或者配体，所述抗体或者配体与选自细胞毒部分、酶、放射性化合 物和造血细胞的成员偶联。
42. 治疗哺乳动物中对抗体诱导的细胞的细胞毒性作用敏感的人类 肿瘤的方法，其中所述人类肿瘤表达与分离的单克隆抗体或者其细胞的 细胞毒性诱导配体特异结合的抗原，所述分离的单克隆抗体由以保藏号 PTA-4623保藏在ATCC的克隆编码，所述配体的特征在于具有竟争性抑 制所述分离的单克隆抗体与其靶抗原结合的能力，所述方法包括给予所 述哺乳动物有效诱导细胞的细胞毒性作用从而减轻所述哺乳动物的肿瘤负荷的量的所述单克隆抗体或所述其细胞的细胞毒性诱导配体。
43. 如权利要求42所述的方法，其中所述单克隆抗体或配体与细胞 毒部分偶联。
44. 如^l利要求43所述的方法，素。
45. 如权利要求42所述的方法，体。
46. 如权利要求42所述的方法， 体依赖的细胞的细胞毒性作用。
47. 如权利要求42所述的方法，其中所述细胞毒部分是放射性同位其中所述单克隆抗体或配体活化补其中所述单克隆抗体或配体介导抗其中所述单克隆抗体是人源化的。
48. 如权利要求42所述的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合的。
49. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体 与人CD63的一个或多个表位反应，所述表位与获自杂交瘤细胞系 H460-22-l的单克隆抗体与之反应的表位相同，所述杂交瘤细胞系的 ATCC保藏号为PTA-4622。
50. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体或配体，其中所述单克 隆抗体或其配体与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与获自 具有ATCC保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6的分离的单克隆抗 体与之反应的表位相同；所述单克隆抗体或配体的特征在于具有竟争性 抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
51. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体或配体，其中所述单克 隆抗体或其配体与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与获自 具有ATCC保藏号PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A的分离的单克 隆抗体与之反应的表位相同；所述单克隆抗体或者配体的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
52. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体或配体，其中所述单克 隆抗体或其配体与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与获自 具有ATCC保藏号PTA-4623的杂交瘤细胞系7BDI-60的分离的单克隆 抗体与之反应的表位相同；所述单克隆抗体或者配体的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
53. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体或配体，其中所述单克 隆抗体或其配体与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与获自 具有IDAC保藏号141205-01的杂交瘤细胞系7BDI-58的分离的单克隆抗 体与之反应的表位相同；所述单克隆抗体或配体的特征在于具有竟争性 抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
54. 能够特异性结合于人CD63的单克隆抗体或配体，其中所述单克 隆抗体或其配体与人CD63的一个或者多个表位反应，所述表位与获自 具有IDAC保藏号141205-06的杂交瘤细胞系AR51A994.1的分离的单克隆抗体与之反应的表位相同；所述单克隆抗体或配体的特征在于具有竟争性抑制所述分离的单克隆抗体与其人CD63靶抗原结合的能力。
55. 与选自下列组的杂交瘤产生的单克隆抗体识别相同的 一个或者 多个表位的单克隆抗体或者配体，所述组由具有ATCC保藏号PTA-4622 的杂交瘤细胞系H460-22-1 、具有ATCC保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞 系1A245.6、具有ATCC保藏号PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-llA、 具有ATCC保藏号PTA-4623的杂交瘤细胞系7BDI-60、具有IDAC保藏 号141205-01的杂交瘤细胞系7BDI-58和具有IDAC保藏号141205-06的 杂交瘤细胞系AR51A994.1组成。
56. 治疗表达人CD63抗原的人癌性肺瘤的方法，所述方法包括 给予患有所述人类癌症的个体至少一种单克隆抗体或配体，所述单克隆抗体或配体与由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体识别相同的 一个或多个表位，所述杂交瘤选自具有ATCC保藏号PTA-4622的杂交瘤细胞 系H460陽22-l，具有ATCC保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6, 具有ATCC保藏号PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-11A,具有ATCC 保藏号PTA-4623的杂交瘤细胞系7BDI-60，具有IDAC保藏号141205-01 的杂交瘤细胞系7BDI-58和具有IDAC保藏号141205-06的杂交瘤细胞系 AR51A994.1;其中所述一个或多个表位的结合有效降低肿瘤负荷。
57. 治疗表达人CD63抗原的人癌性肿瘤的方法，所述方法包括 给予患有所述人类癌症的个体至少 一种单克隆抗体或配体，所述单克隆抗体或配体与由杂交瘤产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或 多个表位，所述杂交瘤选自具有ATCC保藏号PTA-4622的杂交瘤细胞 系H460陽22-l，具有ATCC保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6, 具有ATCC保藏号PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-llA，具有ATCC 保藏号PTA-4623的杂交瘤细胞系7BDI-60,具有IDAC保藏号141205-01 的杂交瘤细胞系7BDI-58和具有IDAC保藏号141205-06的杂交瘤细胞系 AR51A994.1;所述单克隆抗体或配体与至少 一种化疗剂联用； 其中所述给药有效降低肿瘤负荷。
58. 确定在灵长类动物组织样本中表达CD63的一个或多个表位的细胞存在的结合分析，所述分析包括提供来自所述灵长类动物的组织样本；提供至少一种单克隆抗体或配体，所述单克隆抗体或配体与由杂交 瘤产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或多个表位，所述杂交瘤选 自具有ATCC保藏号PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-l ，具有ATCC 保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6,具有ATCC保藏号PTA-4890 的杂交瘤细胞系7BD-33-llA，具有ATCC保藏号PTA-4623的杂交瘤细 胞系7BDI-60,具有IDAC保藏号141205-01的杂交瘤细胞系7BDI-58和 具有IDAC保藏号141205-06的杂交瘤细胞系AR51A994.1;将所述至少一种单克隆抗体或其配体与所述灵长类动物组织样本接触；以及确定所述至少一种单克隆抗体或其配体与所述灵长类动物组织样本的结合；由此指示所述细胞在所述灵长类动物组织样本中的存在。
59.确定在选自人类肿瘤的组织样品中表达CD63的一个或多个表 位的癌性细胞存在的结合分析，所述分析包括提供来自所述人类肿瘤的组织样本；提供至少一种单克隆抗体或者配体，所述单克隆抗体或配体与由杂 交瘤产生的分离的单克隆抗体识别相同的一个或者多个表位，所述杂交 瘤选自具有ATCC保藏号PTA-4622的杂交瘤细胞系H460-22-1,具有 ATCC保藏号PTA-4889的杂交瘤细胞系1A245.6,具有ATCC保藏号 PTA-4890的杂交瘤细胞系7BD-33-llA，具有ATCC保藏号PTA-4623 的杂交瘤细胞系7BDI-60，具有IDAC保藏号141205-01的杂交瘤细胞系 7BDI-58和具有IDAC保藏号141205-06的杂交瘤细胞系AR51A994.1;将所述至少一种单克隆抗体或其配体与所述组织样本接触；以及确定所述至少一种单克隆抗体或其配体与所述组织样本的结合；由此指示所述癌细胞在所述组织样本中的存在。
全文摘要
本发明涉及癌性疾病的诊断和治疗，尤其涉及肿瘤细胞的细胞毒性作用的介导；最尤其涉及癌性疾病调节抗体(CDMAB)作为引发细胞毒性反应的手段的用途，所述CDMAB任选地与一种或者多种化疗剂联用。本发明还涉及利用本发明CDMAB的结合分析。
文档编号C07K16/30GK101421395SQ200780012743
公开日2009年4月29日 申请日期2007年2月22日 优先权日2006年2月24日
发明者保罗·亨顿, 克瑞斯蒂恩·罗格斯, 山喀尔·库马尔, 戴德·萨耶和, 戴维·S·F·扬, 海伦·P·芬德利, 苏姗·E·哈恩, 路易斯·A·G·唐克鲁兹 申请人:阿里乌斯研究公司